شناسایی miRNA‌ها و ژن‌های هدف آن‌ها در Phaseolus vulgaris L. تحت تنش خشکی و PGPR

مقدمه
 
در بین حبوبات، لوبیای معمولی  (Phaseolus vulgaris L.)به جهت دارا بودن بیشترین سطح زیر کشت و تولید (301/287 تن معادل82/48 درصد از تولید کل حبوبات کشور) اهمیت ویژه‌ای دارد (FAO, 2017). تولید و عملکرد این محصول در بسیاری از نقاط جهان به‌دلیل تنش خشکی مورد تهدید قرار می-گیرد (Singh, 2007; Akbari et al., 2016). یکی از راهکارهای افزایش عملکرد گیاهان در راستای کشاورزی پایدار، بهره‌گیری از توان باکتری‌های محرک رشدگیاه یا ‌PGPRها (Plant Growth Promoting Rhizobacteria) در شرایط کمبود آب می‌باشد (Hungria et al., 2013). ‌PGPRها گروه وسیعی از باکتری‌های مفید خاک و محرک رشد گیاه میزبان خود هستند که رشد گیاه را از طریق مکانیزم‌های مختلف (انحلال فسفات، تشکیل گره‌های تثبیت کننده ازت ، تولید هورمون و...) افزایش می‌دهند (Saharan & Nehra, 2011). گزارش شده است که تلقیح با باکتری‌های PGPR باعث افزایش گره‌زایی و افزایش عملکرد در لوبیای معمولی می‌شود (Hungria et al., 2013; Oliveira et al., 2013). هچنین کاهش اثرات ناشی از تنش خشکی توسط باکتری‌های PGPR از طریق تولید گلیسین بتائین، کاهش تولید اتیلن و حفظ سطح طبیعی آبسزیک اسید و افزایش بیان فنیل آلانین (تیروزین) و آمونیالیاز در گیاهان مختلف از جمله ماش و لوبیای معمولی گزارش شده است (Kasim et al., 2013; Da Piedade Melo et al., 2017; Maryani et al, 2018).
اخیرا بسیاری از ژن‌های پاسخ دهنده به تنش خشکی در لوبیا‌ی معمولی یافت شده است (Wu et al., 2014) که در فرآیندهای متابولیکی پاسخ به تنش خشکی، فرآیندهای بیوسنتز کربوهیدرات و ...دخیل هستند (Wu et al., 2014)؛ با این حال، گزارش‌های کمی از miRNA‌های پاسخ دهنده خشکی در لوبیای معمولی وجود دارد.‌miRNA ها، RNA‌های کوچک، تک‌رشته‌ای و غیرکد شونده هستند که تقریبا 21 جفت باز طول دارند و بیان ژن را تنظیم می‌کنند (Li et al., 2010; Tian et al., 2015; Samad et al., 2017). بانک اطلاعاتی miRNAsتحت عنوان database miRBase (Release 21: July 2014) شامل 35828 محصول miRNA می‌باشد. در این پایگاه داده، 6/24 درصد از کل miRNA‌ها متعلق به 73 گونه گیاهی می‌باشد. در سال 2002 برای نخستین بار ‌miRNAها در گیاهان کشف شدند (Park et al ., 2002). این ترکیبات نقش کلیدی در کنترل صفات زراعی مهم گیاهان، انتقال سیگنال و پاسخ به شرایط محیطی مانند تنش‌های زنده و غیرزنده و ... ایفا می‌کنند (Xie et al., 2015; Candar-Cakir et al., 2016; Li & Zhang, 2016). اخیرا بر اساس high-throughput sequencing، -miRNAها در گیاهان مختلف مانند نیشکر، گندم، لوبیای معمولی و سیب زمینی شناسایی شده‌اند (Formey et al., 2016 Sun et al., 2014;) و به‌طور خاص در پاسخ به تنش خشکی در برنج و نخود و یونجه و... مورد توجه قرار گرفته‌اند (Barrera-Figueroa et al.,2011; Wang et al.,2011). 
باتوجه به خشک بودن ایران از نظر اقلیمی، اهمیت گیاه لوبیای معمولی و حساس بودن آن به تنش خشکی، تاثیر PGPR‌ها بر تنظیم بیان miRNA‌ها و نقش مهمی که miRNA‌ها در پاسخ به تنش خشکی دارند، مطالعه حاضر با هدف بررسی تاثیر PGPR‌ها بر بیانmiRNA  و تاثیر توام باکتری وmiRNA بر تحمل به تنش خشکی در دو بخش انجام پذیرفت:
1) کاشت گلخانه‌ای شامل اعمال تنش خشکی و بررسی تاثیر PGPR بر خصوصیات فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی گیاه لوبیای معمولی در پاسخ به تنش تنش خشکی و 2) بخش بیوانفورماتیک و مولکولی شامل شناسایی miRNA‌های دخیل در تنش خشکی درگیاه لوبیای معمولی با استفاده از روش‌های بیوانفورماتیکی مبتنی بر همولوژی بین EST‌های گیاه لوبیا موجود در بانک اطلاعاتی NCBI و miRNA‌های سایت miRBase با انجام  BLASTnو بررسی تاثیر -PGPRها بر بیان اینmiRNA‌ها 

مواد و روش‌ها
کاشت گلخانه‌ای
آزمایش گلخانه‌ای به صورت آزمایش فاکتوریل در قالب کاملا تصادفی در سه تکرار در سال 1397 در گلخانه‌ی گروه زراعت و اصلاح نباتات دانشکده پردیس کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه تهران انجام شد. سطوح آبیاری شامل آبیاری معمولی (FC = 90%)، FC = 60% و  FC = 30%به عنوان فاکتور اول، ژنوتیپ‌های لوبیای معمولی شامل ژنوتیپ‌های‌ متحمل به خشکی (صدری) و حساس به خشکی (یاس) به-عنوان فاکتور دوم و باکتری‌های ریزوبیوم تثبیت کننده ازت شامل چهارسطح شاهد (عدم تلقیح با باکتری)، تلقیح با جدایه باکتریایی اول (B1)، تلقیح با جدایه باکتریایی دوم (B2) و تلقیح با مخلوط دو جدایه‌ی باکتریایی به عنوان فاکتور سوم در نظر گرفته شدند. ابتدا خاک موجود در گلخانه از الک عبور داده شد و به نسبت 3:2 با ماسه بادی مخلوط شد. ظرفیت زراعی (FC)  خاک نیز با استفاده از دستگاه دیسک صفحه فشاری  اندازه‌گیری شد که مقدار آن 18 درصد بود. از گلدان‌های پلاستیکی دو کیلوگرمی برای کاشت استفاده شد. آلوده سازی بذرها با باکتری، همزمان با کاشت و به‌صورت بذرمال انجام شد و سپس تعداد سه عدد بذر آلوده با باکتری از هر ژنوتیپ در گلدان‌ها‌ کاشته شد. شرایط نوری و دمایی رشد گیاهان شامل 16 ساعت نور و هشت ساعت تاریکی با دمای 25 درجه سانتی‌گراد بود. ابتدا آبیاری به اندازه ظرفیت زراعی خاک صورت گرفت و پس از پنج هفته از کاشت گیاهان، تیمارهای مختلف آزمایشی اعمال شد. نحوه‌ اعمال تنش خشکی بدین صورت بود که ابتدا وزن گلدان‌هایی که در آن‌ها خاک ریخته شده بود مشخص شد و سپس هر روز گلدان‌ها را وزن شدند و بر اساس سطح تنش مربوط به آن‌ها و با توجه به مقدار آبی که خاک از دست داده بود، آبیاری انجام پذیرفت. در نهایت 10 روز پس از اعمال تنش خشکی و برای انجام آزمایشات فیزیولوژی، بیوشیمیایی و مولکولی، از ریشه و سه برگچه‌ دوم گیاهان، نمونه‌هایی از سه تکرار گرفته شد. 
اندازه‌گیری نشت یونی (EL)
اندازه‌گیری نشت یونی به روش Lutts et al.   (1996) انجام شد و با استفاده از رابطه زیر مقدار آن محاسبه شد: 
EL= (EC1/EC2)×100 
که در آن، :EC1 هدایت الکترولیتی اول و :EC2 هدایت الکترولیتی دوم بود.
اندازه‌گیری محتوای پرولین
اندازه‌گیری محتوای پرولین به روشBates et al. (1973) انجام و غلظت پرولین با توجه به منحنی استاندارد پرولین در دستگاه طیف سنج نوری (اسپکتروفتومتر Shimadzu uv-160) در طول موج 520 نانومتر تعیین شد.
2) بخش بیوانفورماتیک و مولکولی
شناسایی miRNA‌های دخیل در تنش خشکی درگیاه لوبیای معمولی
توالی‌های miRNA و EST
تمام توالی‌های بالغ miRNA اعتبار سنجی شده از تمام گونه‌های گیاهی و جانوری، به‌عنوان miRNA‌های مرجع جهت پیشگویی miRNA‌های حفاظت شده در گیاه لوبیای معمولی از بانک اطلاعاتی miRBase دانلود شدند (Xie et al., 2007). تمام EST‌های گیاه لوبیای معمولی نیز که شامل 11854EST مربوط به تنش خشکی بودند، از پایگاه اطلاعاتی NCBI دانلود شدند (Xie et al., 2007). 
جستجوی همولوژی
از نرم افزار C-mii جهت پیشگویی miRNA‌ها بر مبنای جستجوی همولوژی بین کانتیگ‌ها و EST‌ها در برابرmiRNA ‌های حفاظت شده  در گیاه لوبیای معمولی مورد استفاده قرار گرفت (Numnark et al., 2012). این نرم افزار با استفاده از ابزارBLASTn  و با درنظر گرفتن دو پارامتر E-value ≤ 10 و mismatch ≤ 4 شناسایی رونوشت‌هایی که بیشترین شباهت را با توالی‌های miRNA‌های بالغ دارند انجام می‌دهد. در طی این BLAST، ESTها به‌عنوان توالی‌های شناخته شده  و miRNA‌ها نیز به‌عنوان query در نظر گرفته شدند (Akter et al, 2014). 
تعیین کارکرد توالی‌ها با استفاده از BLASTx
miRNA‌ها کد کننده پروتئینی نیستند (Catalanotto et al., 2016)، بنابراین توالی‌های کدکننده پروتئینی باید حذف شوند. بدین منظور، مستند سازی و تفسیر عملکردی رونوشت ‌های هدف miRNA‌ها در نرم افزار C-mii با استفاده از ابزار BLASTx در برابر پایگاه Uniprot TrEMBL صورت گرفت. در طی این فرآیند، EST‌های غربال شده به-عنوان کاندیدهای miRNA با فرمت FASTA در برابر تمام توالی‌های کد کننده پروتئینی BLASTx شدند (Zhou et al., 2008).
تعیین ساختار ثانویه پیش‌ساز miRNA (pre-miRNA)
در این مرحله، ساختار ثانویه آن دسته از پیش‌سازهای miRNA که پتانسیل تبدیل شدن به miRNA را دارند، با استفاده از سرور MFOLD، پیش بینی شد. بنابراین 200-100 نوکلئوتید بالادست و پایین دست ناحیه جفت شده بین EST و miRNA انتخاب شدند و ساختار ثانویه حاصل شد (Perez–Quintero et al., 2012). در نهایت توالی‌هایی که ساختار ثانویه‌ای با شرایط زیر داشتند به‌عنوان miRNA‌های کاندید انتخاب شدند:
حداکثر تعداد بازهای جفت نشده بین توالی miRNA و توالی پیش‌ساز آن بیشتر از چهار نوکلئوتید نباشد؛ حداقل انرژی آزاد folding  pre-miRNA بیشترین مقدار باشد؛ MFEI شاخص حداقل انرژی آزاد تاخوردگی (Minimal free energy index) کمترین مقدار باشد؛ توالی miRNA بالغ باید روی حلقه پیش-ساز قرار گیرد؛ حلقه یا شکاف بزرگ در توالی miRNA بالغ وجود نداشته باشد و محتوای A+U توالی پیش‌ساز باید بین 30 تا 70 % باشد (Zhang et al., 2006a).
تعیین ژن‌های هدف miRNA کاندید
شناسایی ژن‌های هدف احتمالی miRNA‌های پیشگویی شده برای لوبیای معمولی با استفاده از نرم افزار C-mii با جستجوی همولوژی بین miRNA‌های شناسایی شده کاندید گیاه لوبیا‌ی معمولی با کانتیگ‌ها و EST‌های همان گیاه بر اساس پارامترهای زیر صورت گرفت:
بیش از چهار باز غیر مشابه بین miRNA و ژن هدف آن وجود نداشته باشد؛ محدوده‌ی عدم جفت شدگی  مرکزی برای مهار ترجمه بین 11-9 نوکلئوتید باشد؛ حداقل انرژی آزاد تاخوردگی (MFE) باید دارای یک مقدار منفی باشد و هرچه این مقدار منفی‌تر باشد، اتصال بین miRNA و ژن هدف آن پایدارتر می‌باشد و تعداد جایگاه‌های هدف برابر دو؛ حداکثر جفت شدگی در جایگاه‌های مکمل کمتر از چهار و بدون هیچگونه فاصله  باشند (Devi et al., 2016; Singh et al., 2016b;).
در نهایت طراحی آغازگرهای miRNA‌های کاندید به صورت دستی (Varkonyi-Gasica et al., 2007) و با استفاده از نرم افزار اینترنتیprimer 3  و Oligo Analysis Tool صورت پذیرفت (جدول 1).
تایید آزمایشگاهی miRNA‌ها
استخراج RNA به روش بایوزول انجام شد و به منظور اطمینان از کیفیت RNA استخراج شده، جذب نمونه-ها در طول موج‌های 260 و 280 نانومتر با استفاده از دستگاه نانودراپ مورد سنجش قرار گرفت؛ همچنین کیفیت RNA‌ها توسط الکتروفورز بررسی شد. تیمار RNA با DNase بر اساس روش پیشنهادی شرکت فرمنتاز و ساخت cDNA از miRNA‌ها با استفاده از پرایمرهای اختصاصی ساقه - حلقه (Stem loop RT-primer) انجام شد (Varkonyi-Gasic et al., 2007). در نهایت سنجش میزان نسبی بیان miR9559-3P به روش واکنش زنجیره‌ای پلیمراز در زمان واقعی (Real-Time PCR) در دستگاه icycler شرکت BioRad انجام پذیرفت. 
تجزیه و تحلیل آماری
تجزیه واریانس و آزمون مقایسه میانگین صفات به روش دانکن در سطح احتمال یک درصد با نرم افزارSAS 9.4  انجام شد و برای ترسیم نمودارها از نرم افزار Excel 2013 استفاده شد. آغازگرهای ژن‌های مورد بررسی با استفاده از نرم افزار اینترنتی Primer 3 طراحی و داده‌های حاصل از واکنش زنجیره‌ای پلیمراز در زمان واقعی در قالب یک طرح کاملا تصادفی در 3 تکرار بااستفاده از نرم افزار REST 2009 تجزیه و تحلیل شدند.
 

 
جدول 1- آغازگرهای طراحی شده برای واکنش زنجیره‌ای پلیمراز در زمان واقعی جهت بررسی بیان  miR9559-3pدر لوبیای معمولی (Phaseolus vulgaris L.) در سه سطح تنش خشکی (FC = 90%, 60% , 30%) و دو سطح باکتری (عدم تلقیح باکتری (شاهد) و تلقیح با مخلوط دو جدایه باکتری).
Table 1. Primers designed for Real-Time PCR to evaluate the expression of miR9559-3p in Phaseolus vulgaris L. at three levels of drought stress (FC = 90%, 60%, 30%) and bacterial treatments (including control (no bacteria) and mixture of 2 bacterial isolates).
Oligo sequences 5’→3’    ID
GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAACAATTTG
GGCGAAATCAACAAATGAACAAAATC    miR9559-3p
stem-loop primer
Forward

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAATGC
TTCATTTTGAAAATAGGCATTG    
miR1514a*
stem-loop primer
Forward

GTGCAGGGTCCGAGGT    
Universal Revers
*از miRNA1514a به‌عنوان شاهد جهت تایید مراحل کار استفاده شد. این miRNA یکی از miRNA‌های حبوبات می‌باشد که در پاسخ به تنش خشکی در لوبیای معمولی برانگیخته می‌شود (Sosa-Valencia et al., 2017 ).

 
نتایج و بحث
کاشت گلخانه‌ای
نتایج تجزیه واریانس نشان داد که از نظر صفات محتوای پرولین، نشت یونی (EL) و وزن خشک ریشه بین ژنوتیپ‌ها، باکتری‌ها، سطوح تنش خشکی، اثر متقابل ژنوتیپ و باکتری، اثر متقابل ژنوتیپ و تنش، اثرمتقابل باکتری و تنش و اثر متقابل سه گانه ژنوتیپ، باکتری و تنش در سطح احتمال یک درصد تفاوت معنی‌داری وجود داشت (جدول 2).
 

جدول 2- تجزیۀ واریانس وزن خشک ریشه، نشت یونی و محتوای پرولین ژنوتیپ‌های صدری و یاس در سه سطح تنش خشکی (FC = 90%, 60%, 30%) و چهار سطح باکتری عدم تلقیح باکتری(شاهد)، تلقیح با جدایه باکتریایی اول (B1)، تلقیح با جدایه باکتریایی دوم (B2) و تلقیح با مخلوط دو جدایه باکتریایی.
Table 2. Variance analysis of root dry weight, EL and prolin in Sadri, and Yas bean genotypes in response to drought stress (FC = 90%, 60% and 30%) and bacterial treatments (including control (no bacteria), first bacterial isolate (B1), second bacterial isolate (B2) and mixture of 2 bacterial isolates).
        Mean squares    
ANOVA    df    Root dry weight    EL    Prolin
Genotype    1    0.079**    2351.06**    0.169**
Bacteria    3    0.019**    722.90**    0.069**
Stress    2    0.015**    4840.02**    0.767**
Genotype × Bacteria    3    0.003**    28.12**    0.003**
Genotype × Stress    2    0.002**    567.35**    0.040**
Bacteria × Stress    6    0.0002**    119.76**    0.025**
Genotype × Bacteria × Stress    6    0.0002**    7.58**    0.001**
Error    48    0.00003    2.23    0.0001
CV (%)        5.03    5.61    3.68
**معنی‌دار در سطح احتمال یک درصد
CV: ضریب تغییرات
** Significant (P≤0.01).    
CV: Coefficient of Variation

 
وزن خشک ریشه
نتایج حاصل از مقایسه میانگین نشان داد که در سطح احتمال یک درصد، بیشترین میزان وزن خشک ریشه در سطح تنش خشکی FC = 90% و  FC = 60%در شرایط تلقیح با جدایه باکتریایی اول و مخلوط دو جدایه باکتریایی در ژنوتیپ صدری (19/0 گرم) و کمترین میزان وزن خشک ریشه در سطح تنش خشکی FC = 30% و  FC = 60%در شرایط عدم تلقیح با باکتری در ژنوتیپ یاس (به ترتیب031/0و 046/0‌گرم) مشاهده شد (شکل 1). در سطح تنش خشکی  FC = 60%و  FC = 30%، بیشترین میزان کاهش وزن خشک ریشه نسبت به سطح شاهد تنش خشکی در شرایط عدم تلقیح با باکتری در ژنوتیپ یاس (به ترتیب با 30 درصد و 52 درصد کاهش وزن نسبت به سطح شاهد تنش خشکی) و کمترین آن در شرایط تلقیح با مخلوط دو جدایه باکتریایی در ژنوتیپ صدری (به ترتیب با دو درصد و 26 درصد کاهش وزن نسبت به سطح شاهد تنش خشکی) مشاهده شد (شکل 1). گزارش‌های متعددی با این نتایج هم‌راستا هستند و بهبود ویژگی‌های رشد گیاه را در حضور PGPR‌ها تایید می‌کنند (Kooky et al., 2017; Khan & Bano, 2019). گزارش شده است که ریشه‌های گیاهان، مجموعه‌ای از ترکیبات آلی را تولید و ترشح می‌کنند که منبع کارآمد کربن در داخل خاک هستند (Bechtold et al., 2019). میکروب‌های خاک از جمله PGPR این ترکیبات را جذب می‌کنند (Saikia et al., 2018; Zhang et al., 2017) و از طریق بهبود رشد ریشه، گره‌زایی و افزایش دسترسی ریز مغذی‌‌ها به ریشه‌‌های گیاه، بودجه آبی گیاهان را در شرایط دیم حفظ می‌‌کنند و باعث تحمل گیاه به تنش خشکی می‌شوند (Strack et al., 2019). 

 
 
شکل 1- میانگین وزن خشک ریشه ژنوتیپ‌های صدری و یاس در سه سطح تنش خشکی (FC = 90%, 60%, 30%) و چهار سطح باکتری عدم تلقیح باکتری (شاهد)، تلقیح با جدایه باکتریایی اول (B1)، تلقیح با جدایه باکتریایی دوم (B2) و تلقیح با مخلوط دو جدایه باکتریایی )ستون‌های دارای حرف متفاوت، بر اساس آزمون دانکن و در سطح احتمال یک درصد تفاوت معنی‌دار دارند.(
Figure 1. Change in the root dry weight in Sadri, and Yas bean genotypes in response to drought stress (FC = 90%, 60% and 30%) and bacterial treatments (including control (no bacteria), first bacterial isolate (B1), second bacterial isolate (B2) and mixture of 2 bacterial isolates). Different letters indicate significant differences according to Duncan's test (P≤0.01).
 
نشت یونی (EL)
مقایسه میانگین نشان داد که با افزایش سطح تنش خشکی، افزایش شدیدی در نشت یونی در سطح احتمال یک درصد رخ داد، به‌طوری‌که بیشترین میزان نشت یونی در سطح تنش خشکی FC = 30% و در شرایط عدم تلقیح با باکتری در ژنوتیپ یاس (70/67 درصد نشت یونی) و کمترین آن در سطح تنش خشکی شاهد (FC = 90%) و در ژنوتیپ  یاس تلقیح شده با مخلوط دو جدایه باکتریایی و ژنوتیپ صدری در هر دو شرایط تلقیح و عدم تلقیح با باکتری (به تریب 11 و 8 درصد نشت یونی) مشاهد شد (شکل 2). در سطح تنش خشکی  FC = 60% و  FC = 30%بیشترین افزایش نشت یونی نسبت به سطح شاهد تنش خشکی در شرایط عدم تلقیح با باکتری در ژنوتیپ یاس (به ترتیب با 48/3 و 36/4 برابر افزایش نشت یونی نسبت به شاهد) و کمترین افزایش آن در شرایط تلقیح با مخلوط دو جدایه باکتریایی در ژنوتیپ صدری (به ترتیب با 09/2 و 61/2 برابر افزایش نشت یونی نسبت به شاهد) مشاهد شد (شکل 2). اثر منفی خشکی بر نشت یونی ممکن است به دلیل تأثیرات مخرب آن بر غشای سیتوپلاسمی و فرآیند نفوذپذیری باشد (Senaratna & McKersie, 1983). برعکس، در گیاهان تحت تنشی که بذر آن‌ها با جدایه‌های باکتریایی تیمار شده بود، درصد نشت یونی به طور قابل توجهی کاهش یافت. این اثرات ارزشمند تیمار جدایه‌های باکتریایی، به نقش مثبت آن‌ها بر پایداری غشا و بهبود نفوذپذیری انتخابی غشای پلاسمایی سلولی نسبت داده می‌شود. گزارش-های متعددی با نتایج ما مطابقت دارند و تأیید می-کنند که تیمار PGPRs به طور قابل توجهی نشت یونی را در گیاهان کاهش می‌دهد که ممکن است به دلیل کاهش تجمع اتیلن باشد (Abdelaal et al., 2020; Zafar et al., 2020). 

 
 
شکل 2- میزان نشت یونی ژنوتیپ‌های صدری و یاس در سه سطح تنش خشکی (FC = 90%, 60%, 30%) و چهار سطح باکتری عدم تلقیح باکتری(شاهد)، تلقیح با جدایه باکتریایی اول (B1)، تلقیح با جدایه باکتریایی دوم (B2) و تلقیح با مخلوط دو جدایه باکتری )ستون‌های دارای حرف متفاوت، بر اساس آزمون دانکن و در سطح احتمال یک درصد تفاوت معنی‌دار دارند.(
Figure 2. EL in Sadri, and Yas bean genotypes in response to drought stress (FC = 90%, 60% and 30%) and bacterial treatments (including control (no bacteria), first bacterial isolate (B1), second bacterial isolate (B2) and mixture of 2 bacterial isolates). Different letters indicate significant differences according to Duncan's test (P≤0.01).

 
پرولین
با افزایش سطح تنش خشکی، افزایش پیوسته‌ای در محتوای پرولین در سطح احتمال یک درصد رخ داد (شکل 3)، به‌طوری‌که بیشترین میزان محتوای پرولین در تنش خشکی FC = 30% و در شرایط عدم تلقیح با باکتری در ژنوتیپ  صدری و کمترین آن در تنش خشکی FC = 90% در شرایط تلقیح با باکتری در هر دو ژنوتیپ مشاهده شد (شکل3). در سطح تنش خشکی  FC = 60%و  FC = 30% بیشترین افزایش محتوای پرولین نسبت به سطح شاهد تنش خشکی در ژنوتیپ صدری تلقیح شده با جدایه باکتریایی اول و جدایه باکتریایی دوم (به ترتیب با 5/6 و 1/7 برابر افزایش نسبت به سطح شاهد) و کمترین آن در ژنوتیپ یاس تلقیح شده با مخلوط دو جدایه باکتریایی (به ترتیب با 2/2 و 6/3 برابر افزایش نسبت به سطح شاهد) مشاهده شد (شکل3). نتایج به‌دست‌آمده نشان داد که پرولین در گیاهان تحت تنش خشکی (در هر دو سطح تنش خشکی FC = 30%, 60% ) به‌‌طور معنی‌‌داری افزایش یافت؛ این تاثیر خشکی ممکن است به دلیل نقش آن در کاهش اکسیداسیون پرولین به گلوتامات و در نتیجه افزایش محتوای پرولین باشد (Khan et al., 2019). همبستگی مثبتی بین تجمع پرولین و گیاهان در معرض تنش‌های مختلف وجود دارد. تجمع پرولین به‌طور معمول در سیتوپلاسم اتفاق می‌‌افتد، جایی‌که به عنوان یک چاپرون مولکولی عمل می‌‌کند و ساختار پروتئین‌‌ها را تثبیت می‌‌کند. علاوه بر این، تجمع آن، PH سیتوزولی را تنظیم می‌کند (Khan et al., 2013; Jha & Subramanian, 2014). پرولین یکی از مهم-ترین محافظ‌های اسمزی است که نقش مهمی در تنظیم اسمزی ایفا می‌کند و از گیاهان تحت تنش محافظت می‌کند. در گیاهان پرولین با حفظ تورگر سلولی یا تعادل اسمزی و تثبیت غشاها، باعث افزایش تحمل به تنش خشکی می‌شود؛ در نتیجه از نشت یونی جلوگیری می‌کند و غلظت گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) را در محدوده طبیعی قرار می‌دهد که این به نوبه خود از آسیب اکسیداتیو در گیاهان جلوگیری می‌کند (Abdelaal et al., 2020). گزارش شده است که تلقیح بذر با جدایه‌های باکتریایی در شرایط تنش، باعث تنظیم مثبت محتوای پرولین می‌شود و این گونه تعادل اسمزی را در شرایط خشکی تنظیم می‌کند. گزارش‌‌های متعددی با این نتایج مطابقت دارند و تأیید می‌‌کنند که تولید پرولین به طور قابل‌توجهی در گیاهان رشد کرده در شرایط خشکی افزایش می‌یابد. با این حال، استفاده از PGPR‌ها به گیاهان کمک می‌کند تا با تنش اسمزی کنار بیایند و انرژی زیستی سلول‌‌های گیاهی تحت تنش حفظ شود؛ بنابراین در حضور PGPR‌ها، افزایش قابل توجهی در تولید پرولین ایجاد نمی‌شود، زیرا نیازی به پرولین اضافی نمی‌باشد (Khan et al., 2019; Abdelaal et al., 2020). 

 
 
شکل 3- تغییرپذیری محتوای پرولین ژنوتیپ‌های صدری و یاس در سه سطح تنش خشکی (FC = 90%, 60%, 30%) و چهار سطح باکتری عدم تلقیح باکتری(شاهد)، تلقیح با جدایه باکتریایی اول (B1)، تلقیح با جدایه باکتریایی دوم (B2) و تلقیح با مخلوط دو جدایه باکتری )ستون‌های دارای حرف متفاوت، بر اساس آزمون دانکن و در سطح احتمال یک درصد تفاوت معنی‌دار دارند.(
Figure 3. Prolin content changes in Sadri, and Yas bean genotypes in response to drought stress (FC = 90%, 60% and 30%) and bacterial treatments (including control (no bacteria), first bacterial isolate (B1), second bacterial isolate (B2) and mixture of 2 bacterial isolates). Different letters indicate significant differences according to Duncan's test (P≤0.01).

 
بخش بیوانفورماتیک و مولکولی
شناسایی‌miRNA ها ی کاندید در گیاه لوبیای معمولی
شناسایی ‌miRNAها بر مبنای جستجوی همولوژی بین miRNA‌ها، EST‌ها و کانتیگ‌ها با استفاده از نرم افزار C-mii صورت گرفت. MFE یک شاخص برجسته برای تعیین ساختار ثانویه اسیدهای نوکلئیک مانند RNA و DNA می‌باشد. MFE پایین‌تر از نظر ترمودینامیکی برای ساختار ثانویه توالی‌های RNA یا DNA مربوطه پایدارتر است. توالی پیش‌ساز miRNA نسبت به tRNA، rRNA و mRNA به‌طور معنی‌داری ارزش MFEI بالاتری دارد (Bonnet et al, 2004). برای جلوگیری از پیش‌بینی نادرست miRNA‌ها از دیگر RNA‌های کوچک، MFEI شاخص بسیار مطلوبی محسوب می‌شود؛ بنابراین با جستجو در بین کانتیگ‌-ها و با در نظر گرفتن شاخص  MFEIمساوی یا بزرگتر از 6/0 کیلو کلری بر مول، E-value برابر با 10، تعداد نوکلئوتید اشتباه حداکثر دو و با استفاده از داده‌های EST (شامل 11854EST مربوط به تنش خشکی در گیاه لوبیای معمولی) و بر مبنای درصد AU پنج miRNA دخیل در تنش خشکی متعلق به چهار خانواده‌ miR408، miR5021، miR5565e و miR9559 شناسایی شدند .
پیشگویی ژن‌های هدف
شناسایی ژن‌های هدف miRNA جهت پی بردن به نقش miRNA‌ها در عملکردهای مختلف سلولی، یک مرحله مهم می‌باشد. مطالعات نشان می دهد که miRNA بیان ژن را از طریق جفت شدن کامل یا تقریبا کامل با ژن‌های هدفشان و تخریب یا سرکوب کردن آن‌ها انجام می‌دهند. در این مطالعه، ژن‌‌های هدف مختلفی برای bra-miR9559-3p به‌دست آمد که متعلق به چندین خانواده ژنی با عملکردهای بیولوژیکی مختلف بودند (جدول3).
 

جدول 3- فهرست اهداف ژنی پیش بینی شده bra-miR9559-3p در گیاه لوبیای معمولی.
Table 3. List of computer-based predicted targets of bra-miR9559-3p in Phaseolus vulgaris L.
Function    Genes    miRNA
Pipl-protein, Pyridoxal 5´-phosphate, Protein transport, Sugar phosphate/phosphate translocator
    A7PK36
A7Q0V9
A7QN02
Q10LE2
Q39822    

bra-miR9559-3p

 
مطالعات بیوانفورماتیک در این تحقیق نشان داد که bra-miR9559-3p در تنظیم ترابری غشا از دستگاه گلژی به سمت ناحیه‌ی اندوپلاسمی (ER) و اتصال  GTPبه GDP نقش دارد و دارای فعالیت GTPase ذاتی می‌باشد (جدول 3). در سایت Uniprot برای کلاستر A7Q0V9 عملکردی مشخص نشده است؛ احتمالا این پروتئین در انتقال قند فسفات / فسفات نقش دارد. محتمل‌ترین هدف برای miR9559-3P مربوط به کلاستر Q39822 (Pip1 protein) در گیاه سویا (Glycin max) می‌باشد. این پروتئین در فعالیت کانال نقش دارد و انرژی مستقل برای انتشار تسهیل شده را فراهم می‌کند (جدول3). Pip‌ها در انتقال آب، H2O2، گلیسرول، CO2 و اوره نقش دارند و عمدتادر ریشه یافت می‌شوند (Forrest & Bhave, 2007; Recchia et al., 2013). گزارش شده است که افزایش بیان ژن کواپورین در ریشه با افزایش تراوایی غشای پلاسمایی و غشای واکوئل به آب سبب بازگشت آماس می‌شود (Recchia et al., 2013). همچنین تحت تنش خشکی اکثر رونوشت‌هایpip بجزAtPIP1:4  و AtPIP 2:5 کاهش بیان نشان می‌دهند و برخی دیگر از این pip‌ها تحت تاثیر تنش خشکی قرار نمی‌گیرند (He et al, 2018). بر اساس نتایج می‌توان گفت که miRNA‌های شناسایی شده همانند مطالعات قبلی در اغلب فرآیندهای متابولیکی مانند رشد و نمو، تمایز، انتقال پیام و پاسخ به انواع تنش‌های زیستی و غیر زیستی دخیل می‌باشند Jung et al., 2009; Jung et al., 2013; Baldrich et al., 2018)).
ساختار ثانویه پیش‌سازساقه - حلقه miRNAهای شناسایی شده
بعد از انجام Blastx جهت حذف توالی‌های کدکننده پروتئینی، با در نظر گرفتن پارامترهایی مانند دمای تاخوردگی در 37 درجه و شرایط یونی، یک مولار NacL برای پیشگویی ساختارهای ثانویه از نرم افزار MFOLD در C-mii استفاده شد (Xie et al., 2010) و ساختار ثانویه پیش‌ساز ساقه - حلقه miRNA‌های متمایز کاندید در گیاه لوبیا معمولی در MFOLD ترسیم شد. در ساختار ثانویه مشاهده شد که قسمت بالغ miRNA در قسمت حلقه ساختار ثانویه پیش‌ساز miRNA قرار دارد که یکی از شروط اساسی در ترسیم ساختار ثانویه در MFOLD است می‌باشد (Zhang et al., 2006a). نتایج نشان داد که باز یوراسیل (U) به عنوان باز غالب در موقعیت 5ˊ قسمت بالغ miRNA‌ها بود که با مطالعات دیگر نیز مطابقت دارد Yin et al., 2008; Zhang et al., 2008; Frazier et al., 2010)). در همه ‌miRNAهای پیشگویی شده، درصد A+U بیشتر از 50 درصد بود و از آن‌جا که بازهای A+U غنی از پیوند هیدروژنی هستند، باعث پایداری و ثبات ساختارهای پیش‌ساز miRNA‌ها می‌شوند (Zhang et al., 2006a,b). همچنین یک دامنه وسیع از طول پیش‌ساز miRNA‌ها مشاهده شد که این تنوع در طول پیش‌ساز miRNA‌ها در مطالعات قبلی نیز گزارش شده است Zhu & Luo, 2013)).
میزان نسبی بیان miR9559-3P
نتایج حاصل از بیانmiR9559-3P  نشان داد که میزان بیان miR9559-3P در گیاه حساس به تنش خشکی (یاس) در مقایسه با گیاه متحمل به تنش خشکی (صدری) بیشتر بود (شکل4). این امر نشان می‌دهد که این miRNA دارای پتانسیل بیان و کارکرد در جهت تنظیم فعالیت بیان ژن در گیاه لوبیای معمولی است و احتمالا miR9559-3Pدر گیاه حساس، نقش تنظیم کنندگی منفی در میزان تحمل به خشکی را دارا می‌باشد. در گیاه حساس پس از اعمال تنش خشکی ملایم (FC = 60%) نسبت به شرایط نرمال (FC = 90%)، میزان بیان افزایش یافت که این امر بر نقش تنظیم کنندگی این miRNA در میزان حساسیت گیاه نسبت به تنش خشکی اشاره دارد. همچنین پس از اعمال تنش شدید (FC = 30%)، میزان بیان این miRNA حتی در مقایسه با تنش خشکی ملایم هم بیشتر شد (شکل4) که این امر نشان می‌دهد که احتمالا تحت شرایط تنش خشکی شدید، گیاه حساس پتانسیل تنظیمی ضعیفی اعمال می‌کند، به‌گونه‌ای که miR9559-3P درصد بیشتری از ژن‌های هدف را هدف قرار می‌دهد و این امر می‌تواند حساسیت گیاه را نسبت به تنش خشکی شدید افزایش دهد. از سوی دیگر در گیاه متحمل به خشکی در مقایسه با حالت نرمال، میزان بیان miR9559-3P اندکی افزایش پیدا کرد (شکل4)، اما پس از اعمال تنش خشکی شدید و در مقایسه با تنش ملایم میزان بیان کاهش یافت (شکل4). احتمالااین امر به این دلیل می‌باشد که گیاه توانسته خود را برای شرایط تنش شدید آماده نماید و بنابراین با یک نمایش تنظیمی خاص، میزان بیان miR9559-3P را کاهش داده و به کاهش اثرات تخریبی آن منجر شده است.که نتیجه این امر، کاهش میزان تخریب رونوشت‌های miR9559-3P، بیان بیشتر ژن هدف و در نهایت بهبود تحمل گیاه تحت شرایط اعمال تنش شدید می‌باشد.
همچنین نتایج نشان داد که در حالت تلقیح باکتری نسبت به حالت عدم تلقیح باکتری در هر دو گیاه حساس و متحمل و در هر دو سطح تنش خشکی، میزان بیان miR9559-3P کاهش می‌یابد (شکل4). گزارش شده است که در گیاهان، PGPR‌ها از طریق تنظیم ژن‌‌های سیگنالینگ وابسته به ABA، تعدیل سطوح هورمونی، مسیر سیگنالینگ اتیلن و فاکتور رونویسی بیان miRNA را تعدیل کرده و منجر به تحمل به خشکی می‌شوند (Akpinar et al., 2015; Barnawal et al., 2017). استفاده از PGPR‌ها به گیاهان کمک می‌کند تا با تنش اسمزی کنار بیایند و انرژی زیستی سلول‌‌های گیاهی تحت تنش حفظ شود که این امر نشان دهنده‌ دخالت PGPR‌ها در بهبود تنش خشکی با تعدیل بیان miRNA می‌باشد؛ بنابراین در حضور PGPR‌ها، بیان miR9559-3P تعدیل می‌شود. نتایج محققان دیگر نیز با این نتایج مطابقت دارد (Barnawal et al., 2017; Jatan et al., 2019).
گزارش شده است که miRNA‌ها نقش مهمی در تعدیل بیان ژن در طول تنش‌های محیطی مختلف ایفا می‌کنند (Jatan et al., 2019). ژن‌های هدف miRNA‌ها طیف وسیعی از پروتئین‌ها از جمله فاکتورهای رونویسی، انتقال دهنده‌ها، پروتئین‌های مرتبط با دفاع، کینازها و … را رمزگذاری می‌کنند (Jeong et al., 2011; Hwang et al., 2013) که در این میان، اغلب فاکتورهای رونویسی در پاسخ و تحمل به تنش غیرزیستی توسطmiRNA ‌های حفاظت شده مورد هدف قرار می‌گیرند (Samad et al., 2017). فاکتورهای رونویسی، تنظیم کننده‌های اصلی بیان ژن هستند که به توالی‌های تنظیمی متصل می‌شوند و می‌توانند سرعت رونویسی ژن‌ها را تحریک یا سرکوب کنند. بیان شده است که. ژن‌های هدفmiRNA ‌ها نقش مهمی در سیگنال دهی هورمونی و پاسخ به تنش خشکی دارند (Baldoni et al., 2015). همچنین گزارش شده است که بیان فاکتورهای رونویسی bZIP در شرایط کم آبی افزایش می‌یابد. این فاکتورها در تنظیم شبکه‌های سیگنالینگ وابسته به تنش و تنظیم بیان ژن‌‌های متعدد پاسخ‌ دهنده به تنش دخیل هستند و تنظیم کننده‌ مهم سیگنالینگ ABAمی-باشند (Shen & Zhang, 1996; Finkelstein & Lynch, 2000; Lopez-Molina et al., 2001; Barnawal et al., 2017).
 

 
شکل 4- میزان نسبی بیان miR9559-3P در ژنوتیپ صدری و یاس در دو سطح تنش خشکی FC = 60% و FC = 30% و دو سطح باکتری (عدم تلقیح باکتری (شاهد) و تلقیح با مخلوط دو جدایه باکتری )ستون‌های دارای حرف متفاوت، بر اساس آزمون دانکن و در سطح احتمال یک درصد تفاوت معنی‌دار دارند.(
Figure 4. Relative expression of miR9559-3P in Sadri, and Yas bean genotypes in response to drought stress (FC = 60% and 30%) and bacterial treatments (including control (no bacteria) and mixture of 2 bacterial isolates). Different letters indicate significant differences according to Duncan's test (P≤0.01).

 
نتیجه‌گیری کلی 
‌miRNAها به صورت تکاملی در قلمرو گیاهی حفاظت شده هستند و از طریق تجزیه‌ی mRNA یا مهار ترجمه بیان ژن را تنظیم کرده و در پاسخ به تنش‌ نقش کلیدی دارند. با استفاده از ابزارها و روش‌های مقایسه‌ای می‌توان  ‌miRNAها و ژن‌های هدف آن‌ها را پیشگویی کرد و از آن‌ها به عنوان ابزار اصلاحی جدید در جهت بهبود ژنتیکی و تنظیم صفات عمده زراعی گیاهان استفاده کرد. در تحقیق حاضر، شناسایی miRNA‌های دخیل در تنش خشکی در لوبیای معمولی با روش‌های بیوانفورماتیکی مبتنی بر همولوژی بین EST‌های موجود در NCBI و miRNA-هایmiRBase  با BLASTn انجام پذیرفت و پنج miRNA دخیل در تنش خشکی متعلق به چهار خانواده‌ miR408، miR5021، miR5565e و miR9559 شناسایی شدند.  bra-miR9559-3p در تنظیم ترابری غشا و اتصال  GTPبه GDP نقش دارد و دارای فعالیت GTPase ذاتی بوده و محتمل‌ترین هدف برای miR9559-3P مربوط به کلاستر Q39822 (Pip1 protein) می‌باشد. نتایج نشان داد که در شرایط خشکی و تلقیح باکتری در گیاه حساس و متحمل به خشکی، میزان بیان miR9559-3P کاهش یافت، اما در حالت عدم تلقیح باکتری، میزان بیان miR9559-3P در گیاه حساس بیشتر بود. احتمالا در گیاه حساس miR9559-3P با نقش تنظیم کنندگی منفی و هدف قرار دادن درصد بیشتری از ژن‌های هدف، باعث افزایش حساسیت به تنش خشکی شده است، اما گیاه متحمل با یک نمایش تنظیمی خاص و کاهش بیانmiR9559-3P  باعث کاهش تخریب رونوشت‌‌هایmiR9559-3P، بیان بیشتر ژن هدف و بهبود تحمل به تنش شده است. بنابراین miRNA‌ها یکی از مهم‌ترین اجزای شبکه‌های تنظیمی در گیاهان است و نقش مهمی در کنترل ژن‌های مسیر بیوسنتزی متابولیت‌های ثانویه و عوامل رونویسی ایفا می‌کنند. miRNA‌های شناسایی شده در اغلب فرآیندهای زیستی و متابولیکی همچون رشد و نمو، تمایز، انتقال پیام و پاسخ به تنش نقش داشتند. به‌دلیل نقش تنظیمی miRNA‌های شناسایی شده بر طیف وسیعی از عوامل رونویسی و تاثیر بالقوه آن‌ها بر ژن‌های پایین دستی شبکه‌های ژنی، miRNA‌ها یکی از مهم‌ترین ابزارهای ایجاد تحمل به تنش خشکی محسوب می-شوند و شناساییmiRNA ‌های دخیل در پاسخ به تنش خشکی و ژن‌های هدف آن‌ها،  اولین مرحله در انتخاب ابزار برای ایجاد تحمل به تنش‌های محیطی با استفاده از روش‌های کنترل بیان ژن می‌باشد و می‌توان از این miRNA‌ها به منظور دست‌ورزی ژن‌هایی که در افزایش تحمل به تنش خشکی نقش دارند  استفاده نمود. همچنین به‌عنوان ژن‌های کاندید در مبحث مهندسی ژنتیک و با هدف افزایش تحمل به تنش‌های زیستی و غیرزیستی و ارتقا متابولیت‌های ثانویه در گیاه لوبیای معمولی کاربرد دارند و از آن‌جا که باکتری‌هایPGPR  بیان miRNA را تعدیل کرده و منجر به تحمل به خشکی، افزایش رشد و تولید گیاه می‌شوند، بنابراین استفاده از این باکتری‌ها به عنوان کود زیستی می‌تواند یک روش جایگزین مناسب کود شیمیایی باشد.
سپاسگزاری
از موسسه تحقیقات خاک و آب کشور بابت حمایت مالی و همکاری در جهت اجرای هرچه بهتر این پژوهش، تشکر وقدردانی می‌گردد.