ارزیابی اثر رژیم آبیاری و قارچ میکوریز آربوسکولار بر برخی صفات زراعی عفران (Crocus sativus L.) در بسترهای کاشت آلی

مقدمه

زعفران(Crocus sativus L.)  گیاهی است چندساله علفی تریپلویید، با گل­های بنفش است که تکثیر آن از طریق بنه صورت می­گیرد (Bakhtiari et al., 2015). در حال حاضر تقریبا 90 درصد از تولید زعفران و بیش از 84 درصد سطح زیر کشت آن در دنیا به ایران تعلق دارد (Ghavamsaeidi Noghbi et al., 2019) به دلیل چرخه زندگی خاص و بهره­مندی از ویژگی­های زیستی و ریخت­شناسی مهم مانند نیاز آبی پایین و داشتن برگ­های باریک و ضخیم، این گیاه به آب و هوای خشک و نیمه خشک سازگار است، اما مدیریت مناسب آب نقش مهمی در تولید این گیاه در این مناطق دارد. علاوه ­براین، فراهمی آب در طی دوره فعال رشد بنه‌های دختری، به افزایش میزان فتوسنتز و تشکیل بنه­های سنگین­تر کمک می­کند(Koocheki et al., 2016) . به‌طورکلی چهار تا پنج مرحله آبیاری برای تولید مناسب زعفران در مناطق خشک و نیمه خشک انجام می­شود که شامل آبیاری اول یا بسار­آب در پاییز برای شروع گلدهی، آبیاری دوم یا زاییج­آب در ابتدای رشد رویشی و ظهور برگ­ها، آبیاری سوم یا کولش­آب در اواخر زمستان و اوایل بهار، پس از وجین زمستانه به منظور تکمیل رشد بنه­، آبیاری چهارم یا زرد­آب در پایان فصل رشد و پیش از زرد شدن برگ­ها به منظور تکمیل نهایی رشد بنه­ها و در برخی موارد آبیاری پنجم در اواسط تابستان به منظور القاء گلدهی(Koocheki & Seyyedi, 2015; Koockeki & Khaje- Hosseini, 2020) می‌باشد. در طی سال­های اخیر، به دلیل خشکسالی­های پی­در­پی در مناطق زعفران­خیز استان خراسان و کاهش منابع آب در این مناطق، بیشتر کشاورزان مجبور به حذف چندین نوبت آبیاری در طول فصل رشد زعفران شدند که این امر موجب کاهش چشمگیر عملکرد زعفران شده است (Makarian et al., 2015).

شیوه­های کشاورزی متداول مانند استفاده بی­رویه از نهاده­های شیمیایی، خاک‌ورزی بیش ­از حد و عمیق، کاهش دوره آیش و استفاده از اراضی حاشیه­ای، باعث افزایش عملکرد گیاه به بهای کاهش کیفیت خاک شده است. در این شرایط، این سیستم‌های متداول منجر به کاهش محتوای مواد آلی خاک، تنوع زیستی و تخریب ویژگی­های فیزیکی خاک شده است که در سطح وسیع­تر، افزایش فرسایش خاک و انتقال رسوبات و آلودگی­ها به منابع آب سطحی و زیرزمینی را به همراه داشته است (Doan et al., 2015). بنابراین استفاده از کودهای آلی و زیستی می­تواند جایگزینی مناسب و ابزار مفیدی برای حفظ و افزایش باروری خاک و عملکرد محصولات کشاورزی باشد (Mau & Utami, 2014). قارچ­های میکوریز آربوسکولار با بیش از 80 درصد گیاهان در اکوسیستم‌های طبیعی و کشاورزی همزیست است و تأثیرات عمده­ای بر رشد، مقاومت به بیماری، جذب عناصر غذایی و بهبود رشد گیاه میزبان دارد (Mau & Utami, 2014). این همزیستی، روابط آبی گیاه را تغییر می‌دهد و سبب افزایش مقاومت گیاه به خشکی، از طریق تعامل پیچیده بین سازوکار­های بی­شمار نظیر جذب آب توسط شبکه­های خارجی­ هیف­، تنظیم روزنه­ها از طریق سیگنال­های هورمونی، جذب فسفر و تنظیم اسمزی بیشتر در گیاهان میکوریزایی می­شود (Bernardo et al., 2017). در پژوهشی با بررسی اثر اسید هیومیک و قارچ Glomus intraradices و سطوح آبیاری بر اندازه بنه و عملکرد زعفران در دو سال زراعی، بیشترین وزن بنه در تیمار G. intraradices و هر دو هفته یک بار آبیاری و هر چهار هفته یک بار آبیاری به­ترتیب در سال نخست و دوم مشاهده شد (Aghhavani Shajari et al., 2018).

بیوچار[1] ماده جامد پایداری است که از طریق فرآیند گرماکافت[2] ترکیبات آلی مانند بقایای گیاهان زراعی و جنگلی و فضولات دامی در شرایط بدون اکسیژن و یا اکسیژن محدود با دمای بالا تولید می‌شود (Najafi Ghiri, 2015) و کاربرد آن در خاک به عنوان راهکاری امید­وار کننده برای دفع پسماندهای آلی، افزایش رسوب کربن در خاک و کاهش غلظت CO₂ اتمسفر پیشنهاد شده است. ورود کربن به خاک، به دلیل نقش حیاتی این عنصر در فرآیندهای بیولوژیکی، شیمیایی و فیزیکی، باعث بهبود کیفیت خاک می­شود (Dai et al., 2016). بیوچار با تأثیر مطلوب بر pH خاک، ظرفیت تبادل کاتیونی، فراهمی زیستی عناصر غذایی و کاهش آبشویی، باعث بهبود باروری خاک و عملکرد گیاه می­شود (Wang et al., 2018). کاربرد 15 و 20 تن بیوچار در ذرت (Zea mays L.) به­ترتیب باعث افزایش 150 و 98 درصدی عملکرد دانه و 139 و 91 درصدی کارایی مصرف آب نسبت به شاهد شد (Uzoma et al., 2011). ورمی­کمپوست، ماده­ای پیت مانند با تخلخل، تهویه و زهکشی بالا است که حاوی مقدار قابل توجهی عناصر غذایی چون نیتروژن، فسفر، کلسیم و پتاسیم می­باشد (Darzi et al., 2012). مناسب بودن ورمی­کمپوست برای تولید زعفران، بارها توسط پژوهشگران به اثبات رسیده است (Rasouli et al., 2013). مصرف 2/10 تن در هکتار ورمی­کمپوست، باعث افزایش معنی­دار بنه­هایی با وزن متوسط و بیشتر از هشت گرم در تراکم­های گوناگون کاشت در مقایسه با کود شیمیایی و شاهد شد (Seyyedi et al., 2018). بنابراین هدف از این پژوهش، ارزیابی پتانسیل گونه‌های بومی قارچ میکوریز آربوسکولار و برهمکنش آن با کودهای آلی بر ویژگی­های رشدی و عملکرد بنه در زعفران در شرایط تنش آبی می­باشد.

مواد و روش­ها

جداسازی و خالص­سازی اسپور قارچ­های میکوریز آربوسکولار

نمونه­برداری از خاک برای جداسازی قارچ میکوریز آربوسکولار در اوایل خرداد سال 1396 در دو شهرستان قائنات (33 درجه و 43 دقیقه عرض شمالی و 59 درجه و 12 دقیقه طول شرقی) و نیشابور (36 درجه و 45 دقیقه عرض شمالی و 58 درجه و 15 دقیقه طول شرقی) به­ترتیب دارای اقلیم خشک و نیمه خشک در استان­های خراسان جنوبی و رضوی، به‌صورت مرکب از مزارعی که سال­ها به کشت زعفران اختصاص داشتند انجام شد. برای تهیه هر نمونه مرکب خاک (دو کیلوگرمی)، هشت نمونه تصادفی از عمق صفر تا 30 سانتی­متری خاک (شامل بنه و خاک اطراف بنه­ها) در جهت قطر مزرعه انتخاب و با یکدیگر مخلوط شدند و در پایان، تعداد 36 نمونه مرکب از 36 مزرعه در دو شهرستان (هر شهرستان 18 مزرعه) جمع­آوری و پس از هوا خشک شدن به آزمایشگاه بیولوژی مؤسسه تحقیقات خاک و آب واقع در شهرستان کرج منتقل شدند و در دمای چهار درجه­ سلسیوس نگهداری شدند. اسپور قارچ­ها به­ روش الک مرطوب و سانتریفوژ در محلول ساکارز 60 درصد و با استفاده از استریو­میکروسکوپ (x 200) و بر اساس ویژگی­های ظاهری اسپورها شامل رنگ، اندازه، شکل دیواره و نحوه اتصال هیف به دیواره و به­صورت مورفوتایپ­های متمایز تفکیک و جداسازی شدند (Gerdemann & Nicolson, 1963). برای تهیه تعداد زیادی اسپور سالم جهت شناسایی و خالص­سازی و تولید مایه تلقیح، اقدام به برقراری کشت تله گلدانی شد. کشت با گیاه ذرت به دلیل دارا بودن دوره رشد کوتاه، رشد سریع ریشه­ها و قدرت همزیستی بسیار بالا با گستره وسیعی از گونه­های قارچ میکوریز (Sadravi & Talaei, 2015) و در بستر ماسه که به روش Srinivasan et al., (2014) استریل شد، انجام گرفت. گیاهان به مدت سه ماه در گلخانه در دمای 30 درجه سانتی‌گراد و 14 ساعت دوره نوری نگهداری شدند. در پایان فصل رشد یعنی پس از سه ماه، بخش هوایی گیاه حذف شدند و ریشه­ها جهت اثبات برقراری رابطه همزیستی با استفاده از استریومیکروسکوب بررسی شدند. در پایان، تعداد دو جدایه­ که دارای رابطه همزیستی موفق و تعداد کافی اسپور بودند، انتخاب شدند و محتویات گلدان­ها شامل بستر، اسپورها، هیف و ریشه­های میکوریزی کاملا با هم مخلوط شدند و به عنوان ­مایه تلقیح در کشت زعفران به‌کار رفتند.

شناسایی مولکولی جدایه­ها

برای استخراج DNA ابتدا اسپورها به روشSrinivasan et al.  (2014) استریل شدند و سپس یک عدد اسپور از هر یک از جدایه­ها به میکروتیوپ­های 200 میکرولیتری منتقل شد و استخراج DNA با شکستن اسپور توسط نوک سر نمونه­گیر کریستالی و با استفاده از استریومیکروسکوپ صورت گرفت. پس از شکستن، به آن دو میکرولیتر بافر PCR اضافه شد و بعد نمونه­ها برای واسرشت­سازی ابتدایی به مدت 15 دقیقه در دمای 94 درجه سانتی‌گراد در ترموسایکلر(Techne, Genius FGEN02TP, USA) گذاشته شد. واکنش زنجیره­ای پلیمراز به‌صورت آشیانه­ای و با کمی تغییر صورت گرفت (Renker et al., 2003). از جفت آغازگرهای SSUmAf- LSUmAr و SSUmCf- LSUmBr (که نام و توالی آن‌ها در جدول 1 آمده است) برای تکثیر ناحیه ژنی SSU-ITS1-5.8S-ITS2-LSU در قارچ میکوریز آربوسکولار استفاده شد. حجم مواد در واکنش زنجیره­ای پلیمراز نخست و دوم برای یک نمونه به­ترتیب 20 و 50 میکرولیتر بود که در واکنش زنجیره پلیمراز نخست شامل 8/16 میکرولیتر آب مقطر استریل، 4/0میکرولیتر dNTP_s، 24/0 میکرولیتر از هر یک از آغازگرهای SSUmAf و  LSUmAr و 32/0 میکرولیتر ازPfu DNA polymerase  و در واکنش زنجیره پلیمراز دوم، 2/39 میکرولیتر آب مقطر استریل، پنج میکرولیتر بافر PCR، یک میکرولیتر dNTP_s، یک میکرولیتر از هر یک از آغازگرهای SSUmCf و LSUmBr، 8/0 میکرولیتر از Pfu DNA polymerase و دو میکرولیتر از محصول PCR نخست بود.

جدول 1- نام و توالی آغازگر­های مورد استفاده در این مطالعه.

Table 1. Name and sequence of primers used in this study.

برنامه دمایی برای هر دو واکنش زنجیره­ای پلیمراز یکسان و شامل واسرشتگی ابتدایی به مدت چهار دقیقه در دمای 94 درجه سانتی‌گراد، 30 چرخه (واسرشتگی به مدت 60 ثانیه در دمای 94 درجه سانتی‌گراد، اتصال آغاز­گر به مدت 60 ثانیه در دمای 58 درجه سانتی‌گراد، گسترش به مدت 120 ثانیه در دمای 72 درجه سانتی‌گراد) و گسترش نهایی به مدت هفت دقیقه در دمای 72 درجه سانتی‌گراد بود. مقداری از محصول مرحله دوم واکنش زنجیره­ای پلیمراز روی ژل آگارز 2/1 درصد الکتروفورز شد و اندازه هر محصول به کمک نشانگر مولکولی (1500bp) تخمین زده شد. در نهایت، قطعات حاصل از تکثیر برای تعیین توالی به شرکت بایونیر کره جنوبی ارسال شد. نتایج توالی به­دست آمده با استفاده از ابزار جستجوی BLAST با سایر توالی­های موجود در بانک ژن NCBI (National Center for Biotechnology Information) مورد مقایسه قرار گرفتند.

مطالعات گلدانی پژوهش

به ­منظور بررسی اثر قطع آبیاری و قارچ میکوریز آربسکولار جداسازی شده در بسترهای کاشت آلی بر برخی صفات زراعی زعفران، آزمایشی به­صورت اسپلیت فاکتوریل و در قالب طرح کاملا تصادفی با سه تکرار در مؤسسه تحقیقات خاک و آب واقع در شهرستان کرج اجرا شد. تیمارها شامل رژیم آبیاری به­عنوان عامل اصلی در سه سطح [آبیاری مطلوب (I₁)،  قطع آبیاری در ابتدای فصل رشد یا زاییج­آب (I₂) و قطع آبیاری در ابتدا و اواسط فصل رشد یا قطع زاییج­آب و کولش­آب (I ₃)]، بستر کاشت آلی در سه سطح [عدم مصرف کود آلی (M₀)، ورمی­کمپوست (20 تن در هکتار) (M₁) و بیوچار (10 تن در هکتار) (M₂)] و قارچ میکوریز در سه سطح (عدم مصرف میکوریزا، جدایه a و جدایه b) به­عنوان عامل فرعی در نظر گرفته شدند. در این آزمایش از گلدان­هایی به عمق 30 و قطر 26 سانتی­متر و گنجایش 15 کیلوگرم استفاده شد. با توجه به مقدار مصرف در هکتار، میزان ورمی­کمپوست و بیوچار محاسبه شد و به خاک الک شده گلدان­ها (که خصوصیات فیزیکی و شیمیایی آن در جدول 2 آورده شده است) اضافه شد. بیوچار باگاس نیشکر (Saccharum officinarum) از شرکت نوآوران زیست بنیان آویسا و ورمی‌کمپوست بقایای گیاهی از موسسه تحقیقات خاک و آب تهیه شد که برخی از ویژگی­ آن‌ها به‌ترتیب در جدول 2 ارایه شده است. جمعیت قارچ میکوریز در هر گرم خاک و مایه تلقیح مورد استفاده، به‌ترتیب حاوی 21 و 630 عدد اندام فعال بود که به روش Dalpe (1993) شمارش شدند. کاشت در تاریخ 29 شهریور 1397 انجام شد. ابتدا نصف ارتفاع گلدان از خاک پر شد، پس از آن مایه تلقیح به مقدار پنج گرم برای هر گلدان به­صورت یک لایه به آن اضافه شد و سپس چهار عدد بنه (میانگین وزن بنه بین هشت تا 11 گرم)، یک بنه در وسط و سه بنه دیگر در اطراف آن روی دایره­ای به شعاع پنج سانتی­متر در بستر روی مایه تلقیح قرار داده شدند و در نهایت بخش دوم خاک به آن اضافه شد و گلدان­ها در فضای باز قرار گرفتند. در شرایط آبیاری کامل، آبیاری به‌صورت یکنواخت هر 15 روز یک­بار انجام شد و در فاکتور قطع آبیاری در اوایل فصل رشد، قطع آب در پنج آذر (قطع یک دور آبیاری) و در عامل قطع آب در اوایل و اواسط فصل رشد در پنج آذر و 20 اسفند (قطع دو دور آبیاری) انجام شد. قبل و بعد از اتمام دوره قطع آب (یک‌ماهه)، آبیاری به‌صورت منظم انجام شد. با توجه به احتمال وقوع بارندگی در زمان قطع آبیاری، از پوشش پلاستیکی برای جلوگیری از ریزش باران روی گلدان­ها استفاده شد. عملیات آبیاری و اعمال تنش قطع آب در سال دوم همانند سال نخست انجام گرفت. با توجه به این‌که رشد زعفران در سال اول متأثر از بنه­های اولیه است که در مزارع مادری رشد کرده­اند و تحت تأثیر تیمار­های اعمال شده نمی­باشند، بنابراین، اندازه­گیری­ها در سال دوم آزمایش انجام شد (Naghizade et al., 2014).

جدول 2- ویژگی­های خاک، بیوچار و ورمی کمپوست مورد استفاده در آزمایش.

Table 2. Characteristics of biochar, vermicompost and soil used in the experiment.

برداشت گل در پاییز سال 1398 و برداشت بنه­ها در 20 اردیبهشت سال 1399 انجام شد. بر این اساس، صفات مورد مطالعه شامل عملکرد اقتصادی (وزن کلاله خشک)، تعداد  و وزن تر و خشک برگ، وزن (تر) و تعداد بنه، وزن  (تر) و تعداد بنه­های بیش از هشت گرم­ و قطر بنه در گلدان بودند. برای اندازه­گیری عملکرد اقتصادی، کلاله­ها از گل­ها جدا و در سایه خشک شدند و سپس وزن آن‌ها با ترازوی دیجیتال با دقت 001/0 اندازه‌گیری شد. تجزیه و تحلیل داده­ها با استفاده از نرم‌افزار SAS (9.1) و مقایسه میانگین‌ها با استفاده از آزمون حداقل اختلاف معنی­دار (LSD) در سطح احتمال پنج درصد انجام شد.

نتایج و بحث

شناسایی مولکولی

ارزیابی محصولات حاصل از تکثیر ناحیه SSU-ITS1-5.8S-ITS2-LSU، تکثیر بخشی از ژنوم به طول تقریبی 1500 جفت باز را نشان داد (Krüger et al., 2009) (شکل 1). نتایج به­دست آمده از بانک ژن NCBI نشان داد که جدایه a با شماره دسترسی MW254988 و جدایه b با شماره دسترسی MW254990 متعلق به گونه Rhizophagus irregularis بودند.

شکل 1- A و B به‌ترتیب تصویر اسپور جدایه a و b دست نخورده درون آب تحت نور استریو میکروسکوپ. C محصول مرحله دوم PCR روی ژل آگارز 2/1 درصد، L: نشانگر، 4- 1: جدایه a، 7- 5: جدایه b و 8: شاهد.

Figure 1. A & B, spore image of isolates a and b intact in water under stereo microscope light, respectively. C Product of the second stage PCR on 1.2% agarose gel, L: marker, 4- 1: isolate a, 7-5: isolate b and 8: control

عملکرد اقتصادی (کلاله خشک)

نتایج این بررسی نشان داد که اثر ساده قارچ R. irregularis و اثر متقابل رژیم آبیاری به‌همراه بستر کاشت آلی بر عملکرد اقتصادی زعفران معنی­دار شد (جدول 3).

در برهمکنش رژیم آبیاری به­همراه بستر کاشت، بیشترین و کمترین عملکرد به­ترتیب در تیمار آبیاری مطلوب به­همراه بیوچار و تیمار قطع آب در زاییج­آب و کولش‌آب و عدم مصرف کود آلی با مقادیر 062/0 و 001/0 گرم در گلدان مشاهده شد (جدول 4). بیوچار از طریق افزودن و نگهداری عناصر غذایی بر قابلیت دسترسی عناصر غذایی خاک مؤثر است (Chan and Xu, 2009)، بنابراین کاربرد منابع آلی با فراهمی عناصر غذایی و بهبود ساختار خاک و با تأثیر بر فرآیندهای رشد گیاه زعفران موجب افزایش عملکرد اقتصادی می­شود (Behdani et al., 2005). تنش رطوبتی، یکی از مهم‌ترین عوامل کاهش عملکرد ماده خشک به­ویژه عملکرد اقتصادی در زعفران می­باشد (Sabet Teimouri et al. 2010).

جدول 3- تجزیه واریانس اثر رژیم آبیاری، بستر کاشت آلی و قارچ R. irregularis بر برخی صفات زراعی زعفران.

Table 3. Variance analysis of the effect of irrigation regime, organic planting medium and R. irregularis on some agronomic traits of saffron.

^ns، ^* و^**: به‌ترتیب غیرمعنی­دار و معنی­دار در سطح پنج و یک درصد.

^ns, * and **: non-significant and significant at 1% and 5% of probability levels, respectively.

جدول 4- مقایسه میانگین اثر رژیم آبیاری و بستر کاشت آلی بر عملکرد اقتصادی، تعداد کل بنه زعفران و بنه­هایی با وزن بیش از هشت گرم در گلدان.

Table 4. Mean comparison of the effect of irrigation regime and organic planting media on economic yield and total number of saffron corms and corms weighing over 8 g per pot in.

I₁: آبیاری کامل، I₂: قطع آب در اوایل فصل رشد (زاییج­آب)، I₃: قطع آب در اوایل و اواسط فصل رشد (زاییج­آب و کولش­آب)، M₀: عدم مصرف کود آلی، M₁: ورمی­کمپوست، M₂: بیوچار. در هر ستون، میانگین­های دارای حروف مشترک، تفاوت معنی­داری بر مبنای آزمون حداقل اختلاف معنی­دار با یکدیگر ندارند (LSD 5%).

I₁: full irrigation, I₂: irrigation cut off at the beginning of the growing season (Zaeech-Ab),I₃: irrigation cut off at the beginning and mid of the growing season (Zaeech-Ab & Kulesh-Ab), M₀: no organic fertilizer, M₁: vermicompost, M₂: biochar. In each column, means with similar letters do not have significant differences based on the LSD test (5%).

جدول 5- تأثیر قارچ   R. irregularis بر عملکرد اقتصادی زعفران در گلدان.

Table 5. Effect of R. irregularis on the economic yield of saffron in pots.

در هر ستون، میانگین­های دارای حروف مشترک، تفاوت معنی­داری بر مبنای آزمون حداقل اختلاف معنی­دار با یکدیگر ندارند (5%).

In each column, means with similar letters do not have significant differences based on the LSD test (5%).

اندازه­گیری صفات مرتبط با برگ در گلدان

بر اساس جدول 3، اثر متقابل رژیم آبیاری، بستر­ کاشت آلی و قارچ R. irregularis بر صفت تعداد  و وزن تر و خشک برگ در گلدان معنی­دار شد، به‌طوری‌که بیشینه و کمینه تعداد برگ در گلدان با میانگین 180 و 85 عدد، به­ترتیب در تیمار آبیاری مطلوب به همراه بیوچار و Rhizophagus irregularis isolate b و تیمار قطع آب در زاییج­آب و کولش­آب و عدم مصرف کود آلی و قارچ میکوریز مشاهده شد (جدول 6). بین میانگین وزن تر و خشک برگ در اکثر تیمارها، تفاوت معنی‌دار وجود داشت، به‌طوری‌که بالاترین مقدار وزن تر (2/90 گرم در گلدان) و خشک برگ (96/23 گرم در گلدان)،  به تیمار آبیاری مطلوب به همراه بیوچار و Rhizophagus irregularis
 isolate b بود که نسبت به تیمار قطع آب در زاییج­آب و کولش­آب و عدم مصرف کود آلی و قارچ میکوریز که کمترین مقدار این صفات (9/41 و 92/10 گرم در گلدان) را داشت، به­ترتیب 115 و 119 درصد افزایش نشان داد (جدول 6). بررسی­ها نشان داد­ که بین استفاده از کود آلی و عملکرد زعفران، همبستگی مثبت و بالایی وجود دارد (Jassemi et al., 2010)، به­همین دلیل، افزودن کودهای آلی و زیستی سبب بهبود حاصلخیزی خاک و به دنبال آن، فراهمی عناصر غذایی و بهبود رشد زعفران و افزایش صفات مرتبط با برگ شده است. از سوی دیگر، همبستگی بالایی بین پتانسیل آب خاک و سرعت فتوسنتز در زعفران مشاهده شده است، به‌طوری‌که با کاهش پتانسیل آب، سرعت فتوسنتز کاهش یافت (Renau-Morata et al., 2012) . در پژوهشی، Nehvi et al. (2010) نشان دادند که کاربرد توأم باکتری آزوسپریلوم و قارچ میکوریز آربوسکولار، سبب افزایش 40 درصدی عملکرد زعفران نسبت به شاهد شد. محققان اظهار داشتند که وزن خشک برگ در تیمار 100 درصد ظرفیت زراعی، 7/21 درصد وزن تر و در تیمار تنش آبی، 4/15 درصد وزن تر برگ در زعفران بود. این مسئله نشان می­دهد که افزایش ماده خشک، تابع وجود آب قابل وصول در محیط ریشه و در نتیجه انتقال عناصر غذایی لازم از ریشه به برگ­ها و در نهایت انجام فتوسنتز در شرایط بهینه است
 (Sabet Teimouri et al. 2010).

جدول 6- مقایسه میانگین برهمکنش رژیم آبیاری، بستر کاشت آلی و قارچ R. irregularis بر برخی صفات زراعی زعفران.

Table 6. Mean comparison of the interaction effect of irrigation regime, organic planting media and R. irregularis on some agronomic traits of saffron.

I₁: آبیاری کامل، I₂: قطع آب در اوایل فصل رشد (زاییج­آب)، I₃: قطع آب در اوایل و اواسط فصل رشد (زاییج­آب و کولش­آب)، M₀: عدم مصرف کود آلی، M₁: ورمی­کمپوست، M₂: بیوچار. در هر ستون، میانگین­های دارای حروف مشترک، تفاوت معنی­داری بر مبنای آزمون حداقل اختلاف معنی­دار (LSD) با یکدیگر ندارند (LSD 5%).

I₁: full irrigation, I₂: irrigation cut off at the beginning of the growing season (Zaeech-Ab),I₃: irrigation cut off at the beginning and mid of the growing season (Zaeech-Ab & Kulesh-Ab), M₀: no organic fertilizer, M₁: vermicompost, M₂: biochar. In each column, means with similar letters do not have significant differences based on the LSD test (5%).

اندازه­گیری صفات مرتبط با بنه

نتایج تجزیه واریانس نشان داد برهمکنش رژیم آبیاری، بستر کاشت آلی و قارچ R. irregularis بر صفات میانگین وزن و قطر بنه در گلدان معنی­دار شد (جدول 3). بر اساس مقایسه میانگین داده­ها، بیشینه میانگین وزن (67/7 گرم در گلدان) و قطر بنه (38/2 سانتی­متر) به تیمار آبیاری مطلوب به همراه بیوچار و Rhizophagus irregularis isolate b تعلق داشت که نسبت به کمینه میانگین وزن (49/2 گرم در گلدان) و قطر (4/1 سانتی‌متر) که در تیمار قطع آب در زاییج­آب و کولش­آب و عدم مصرف کود آلی و قارچ میکوریز به­دست آمد، به­ترتیب 208 و 70 درصد افزایش نشان داد (جدول 6). در صفت تعداد بنه در گلدان، برهمکنش رژیم آبیاری و بستر کاشت آلی و همچنین رژیم آبیاری و R. irregularis معنی­دار بود. در مقایسه میانگین برهمکنش رژیم آبیاری و بستر کاشت آلی، بیشترین و کمترین تعداد بنه در گلدان به‌ترتیب در تیمار آبیاری مطلوب همراه با بیوچار و تیمار قطع آب در زاییج­آب و کولش­آب و عدم مصرف کود آلی با میانگین 22/54 و 33/25 عدد مشاهده شد (جدول 4). در تیمار رژیم آبیاری و R. irregularis بیشترین تعداد بنه در گلدان با میانگین 48 عدد، متعلق به تیمار آبیاری مطلوب و Rhizophagus irregularis isolate b بود که با تیمار آبیاری مطلوب و Rhizophagus irregularis isolate a (7/45 عدد) تفاوت معنی­داری نداشت، درحالی‌که کمترین تعداد بنه در گلدان با میانگین 89/27 عدد، در تیمار قطع آب در زاییج­آب و کولش­آب و عدم مصرف قارچ میکوریز مشاهده شد (جدول 7). از آن‌جا که زعفران به‌صورت چند­ساله بهره­برداری می­شود، سازگاری بسیار بالایی با کودهای آلی دارد، از این‌ رو، کودهای آلی نقش بسیار مهمی در افزایش عملکرد آن از طریق افزایش وزن بنه دارند (Koocheki et al., 2017). در آزمایشی Koocheki & Seyyedi  (2016) نشان دادند که با کاربرد کود گاوی، ورمی­کمپوست و کمپوست به‌صورت منفرد، عملکرد بنه زعفران در متر مربع در هر سه کود به­طور معنی­داری افزایش یافت که علت این افزایش عملکرد را ناشی از فراهمی عناصر عذایی به­ویژه نیتروژن و فسفر و بهبود ویژگی­های فیزیکی و شیمیایی خاک دانستند. در مطالعه­ای دیگر
 Caser et al. (2018) نشان دادند که تلقیح بنه­های زعفران با قارچ­های Funneliformis mosseae و  Rhizophagus intraradices به‌صورت توأم، سبب افزایش تعداد، وزن و قطر بنه نسبت به عدم مصرف آن شد. در ارزیابی اثر رژیم­های رطوبتی 50، 60 و 70 درصد ظرفیت زراعی، عرف محل به همراه آبیاری تابستانه وآبیاری بر اساس عرف محل بر عملکرد زعفران نتایج نشان داد که با افزایش شدت تنش رطوبتی، تعداد و وزن بنه­ها کاهش یافت، علاوه بر این، وزن و تعداد بنه در تیمار آبیاری عرف محل، بیشتر از سایر تیمارها بود (Hosseini & Rahimi, 2018).

جدول 7- تأثیر تنش آبی و قارچ   R. irregularis بر تعداد کل بنه زعفران در گلدان.

Table 7. Effect of water stress and R. irregularis on total number of saffron corms per pot.

I₁: آبیاری کامل، I₂: قطع آب در اوایل فصل رشد (زاییج­آب)، I₃: قطع آب در اوایل و اواسط فصل رشد (زاییج­آب و کولش­آب)، M₀: عدم مصرف کود آلی، M₁: ورمی­کمپوست، M₂: بیوچار. در هر ستون، میانگین­های دارای حروف مشترک، تفاوت معنی­داری بر مبنای آزمون حداقل اختلاف معنی­دار (LSD) با یکدیگر ندارند (LSD 5%).

I₁: full irrigation, I₂: irrigation cut off at the beginning of the growing season (Zaeech-Ab),I₃: irrigation cut off at the beginning and mid of the growing season (Zaeech-Ab & Kulesh-Ab), M₀: no organic fertilizer, M₁: vermicompost, M₂: biochar. In each column, means with similar letters do not have significant differences based on the LSD test (5%).

بر اساس جدول 3، برهمکنش رژیم­ آبیاری، بستر کاشت و قارچ R. irregularis بر وزن بنه­­های بیش از هشت گرم در گلدان معنی­دار شد. همچنین در تعداد بنه­هایی با وزن بالاتر از هشت گرم، اثر رژیم آبیاری و بستر کاشت آلی و همچنین بستر کاشت آلی و R. irregularis معنی­دار شد. بالاترین وزن بنه در بنه­هایی با وزن بیش از هشت گرم، در تیمار آبیاری مطلوب به همراه بیوچار و Rhizophagus irregularis isolate b (با میانگین 66/12 گرم) مشاهده شد که با تیمار آبیاری مطلوب به همراه بیوچار و Rhizophagus irregularis isolate a تفاوت معنی­داری نداشت و کمترین وزن بنه در گلدان در تیمارهای قطع آب در زاییج­آب و کولش­آب و قطع آب در زاییج­آب و عدم مصرف کود آلی تحت هر سه تیمار قارچ میکوریز، قطع آب در زاییج­آب و کولش­آب به همراه ورمی­کمپوست با عدم مصرف قارچ میکوریز و Rhizophagus irregularis isolate a و قطع آب در زاییج­آب به همراه ورمی­کمپوست و عدم مصرف قارچ میکوریز مشاهده شد که بنه‌ای با وزن بالاتر از هشت گرم نداشتند (جدول 6). در مقایسه میانگین تعداد بنه­هایی با وزن بیش از هشت گرم، بیشترین تعداد بنه با میانگین 78/8 عدد بنه در گلدان، متعلق به تیمار آبیاری مطلوب و بیوچار بود و کمترین آن، در قطع آب در زاییج­آب و زاییج­آب و کولش­آب و عدم مصرف کود آلی مشاهده شد که بنه بالاتر از هشت گرم نداشتند (جدول 4).

بیشترین تعداد بنه­هایی با وزن بیش از هشت گرم در گلدان با میانگین 11/7 عدد، از برهمکنش بستر کاشت آلی با R. irregularis در تیمار بیوچار با Rhizophagus irregularis isolate b مشاهده شد که تفاوت معنی‌داری با تیمار بیوچار و Rhizophagus irregularis isolate a نداشت و این در حالی بود که کمترین میزان این صفت (1 عدد) در تیمار عدم مصرف کود آلی و قارچ میکوریز مشاهده شد که با سایر تیمارها بجز دو تیمار بیشینه گفته شده در بالا، تفاوت معنی‌داری مشاهده نشد (جدول 8).

جدول 8- تأثیر بستر کاشت آلی و قارچ   R. irregularis بر تعداد بنه­های زعفران با وزن بیش از هشت گرم در گلدان.

Table 8. Effect of organic planting media and R. irregularis on the total number of saffron corms over 8 g per pot.

M₀: عدم مصرف کود آلی، M₁: ورمی­کمپوست و M₂: بیوچار. در هر ستون، میانگین­های دارای حروف مشترک، تفاوت معنی­داری بر مبنای آزمون حداقل اختلاف معنی­دار (LSD) با یکدیگر ندارند (LSD 5%).

M₀: no organic fertilizer, M₁: vermicompost and M₃: biochar. In each column, means with similar letters do not have significant differences based on the LSD test (5%).

بیوچار حاوی عناصر غذایی می­باشد که قابل دسترس برای فلور میکروبی خاک و ریشه گیاهان می‌باشد، به همین دلیل، افزودن آن به خاک اغلب سبب واکنش مثبت گیاه و قارچ میکوریز آربوسکولار به آن می­شود (Warnock et al., 2007). همچنین خاک­های حاوی ورمی­کمپوست، به دلیل داشتن نیتروژن، فسفر و پتاسیم بیشتر و از سوی دیگر غنی بودن از هورمون­های رشد و ویتامین­ها نسبت به خاک­های فاقد آن می­توانند موجب افزایش رشد، وزن تر و خشک گیاه شوند (Martin et al., 1997). نتایج یک مطالعه نشان داد که کاربرد ورمی­کمپوست، اثر معنی­داری بر صفات بنه مانند وزن کل، متوسط وزن تر و خشک و قطر بنه داشت (Aminifard et al., 2019). در مطاله­ای دیگر در گندم (Triticum aestivum L.) ، محققان افزایش وزن خشک کل را در گیاهان میکوریزی نسبت به گیاهان غیرمیکوریزی در تنش شدید خشکی، به دلیل دسترسی ریشه گیاهان میکوریزی به آب موجود در زیر نقطه پژمردگی دایم نسبت دادند
 (Beltrano & Ronco, 2008).

نتیجه­ گیری کلی

نتایج حاصل از این بررسی نشان داد، با این‌که زعفران گیاهی با نیاز آبی پایین است، اما تنش آبی باعث کاهش عملکرد اقتصادی، ویژگی­های رویشی و تعداد و وزن بنه شد. کاربرد کودهای آلی و دو جدایه قارچ Rhizophagus irregularis  منجر به بهبود عملکرد اقتصادی زعفران شد. همچنین استفاده از دو جدایه قارچ Rhizophagus irregularis  به همراه کودهای آلی در شرایط آبیاری مطلوب به­طور معنی­داری سبب افزایش ویژگی­های رویشی و صفات مرتبط با بنه شد، اما این افزایش با کاربرد بیوچار و Rhizophagus irregularis isolate b به­ طور قابل توجهی بالاتر از دیگر تیمارها بود. بنابراین استفاده توأم از بیوچار و Rhizophagus irregularis isolate b می­تواند نقش مهمی در رشد رویشی و افزایش عملکرد بنه زعفران داشته باشد.

REFERENCES

1. Aghhavani Shajari, M., Rezvani Moghaddam, P., Ghorbani, R. & Koocheki, A. (2018). Increasing saffron (Crocus sativus) corm size through the mycorrhizal inoculation, humic acid application and irrigation managements. Journal of Plant Nutrition, 41(8), 1047-1064.
2. Aminifard, M. H., Oftadeh Fadafen, A., Moradi Nezhad, F. & Behdani, M. A. (2019). Effects of vermicompost and nitroxin on replacement corm characteristics and flower yield of saffron (Crocus sativus ) in the second year. Saffron Agronomy & Technology, 7(2), 139- 154. (In Persian)
3. Bakhtiari, A. A., Hematian, A. & Sharifi, A. (2015). Energy analyses and greenhouse gas emissions assessment for saffron production cycle. Environmental Science and Pollution Research, 22, 16184-16201.
4. Behdani, M. A., Koocheki, A., Nassiri, M. & Rezvani, P. (2005). Evaluation of quantitative relationships between saffron (Crocus sativus ) yield and nutrition (on farm trial). Iraninan Journal of Field Crops Research, 3(1), 1-14. (In Persian)
5. Beltrano, J. & Ronco M. G. (2008). Improved tolerance of wheat plants (Triticum aestivum ) to drought stress and rewatering by the arbuscular mycorrhizal fungus Glomus claroideum: Effect on growth and cell membrane stability. Brazilian Journal of Plant Physiology, 20(1), 29-37.
6. Bernardo, L., Morcia, C., Carletti, P., Ghizzoni, R., Badeck, F.W., Rizza, F., Lucini, L. & Terzi, W. (2017). Proteomic insight into the mitigation of wheat root drought stress by arbuscular mycorrhizae. Journal of Proteomics, 28, 1-12.
7. Caser, M., Victorino, I. M. M., Demasi, S., Berruti, A., Donno, D., Lumini, E., Bianciotto, V. & Scariot, V. (2019). Saffron cultivation in marginal alpine environments: How AMF inoculation modulates yield and bioactive compounds. Agronomy, 1- 14.
8. Dai, L., Li, H., Tan, F., Zhu, N., He, M. & Hu, G. (2016). Biochar: a potential route for recycling of phosphorus in agricultural residues. Bioenergy, 8, 852-858.
9. Dalpe, Y. (1993). Vesicular – arbuscular mycorrhiza. pp. 287 – 301. In: M.R. Carter (Ed), Soil sampling and methods of analysis. (pp. 287 301) Lewis, Boca Raton.         
10. Darzi, M., Haj Seyedhadi, M. & Rejali, F. (2012). Effects of the application of vermicompost and phosphate solubilizing bacterium on the morphological traits and seed yield of anise (Pimpinella anisum ). Journal of Medicinal Plants Research, 6(2), 215-219.
11. Chan, Y. K. & Xu, Z. (2009). Biochar for Environmental Management. In: Lehmann, J and S. Joseph (Ed), Biochar: Nutrient Properties and Enhancement. (pp. 68-74.) Earthscan, USA.
12. Doan, T. T., des-Tureaux, T. H., Rumpel, C., Janeau, J. T. & Jouquet, P. (2015). Impact of compost, vermicompost and biochar on soil fertility, maize (Zea mays) yield and soil erosion in Northern Vietnam: A three year mesocosm experiment. Science of the Total Environment, 514, 147-154.
13. Gerdemann, J. W. & Nicolson, T. H. (1963). Spores of mycorrhizal Endogene species extracted from soil by wet- siving and decanting. Transaction in British Mycological Society, 46: 235-244.
14. Ghavamsaeidi Noghbi, S., Khashei Siuki, A., Hammami, H., Shahidi, A. & Yaghoobzadeh, M. (2019). Determination of evapotranspiration and crop coefficient of Saffron (Crocus sativusL.) by using lysimetric method in the dry-desert climate of Birjand. Journal of Saffron Research, 8(1), 161- 172. (In Persian)
15. Hosseini, M. & Rahimi, H. (2018). Effect of Irrigation Regimes on Yield and Qualitative Criteria of Saffron (Crocus sativus). Journal of Saffron Research, 5(2), 247-255. (in Persian)
16. Jassemi, K., Kardoni, F. & Behdani, M. A. (2010). The study of various fertilizers use and their effects on yield in the saffron fields. In: Proceedings of the 1^st Iranian Fertilizer Challenges Congress, 10-12 Mar, Tehran, Iran.
17. Koocheki, A. & Seyyedi, S. M. (2015). Phonological stages and formation of replacement corms of saffron (Crocus sativus) during growing period. Journal of Saffron Research, 3(2), 134-154. (In Persian)
18. Koocheki, A., Seyyedi, S. M. & Gharaei, S. (2016a). Evaluation of the effects of saffron-cumin intercropping on growth, quality and land equivalent ratio under semi-arid conditions. Scientia Horticulturae, 201, 190-198.
19. Koocheki, A. & Seyyedi, S. M. (2016b). Effects of corm size, organic fertilizers, Fe-EDTA and Zn-EDTA foliar application on nitrogen and phosphorus uptake of saffron foliar application on nitrogen and phosphorus uptake of saffron (Crocus sativus ) in a calcareous soil under greenhouse conditions. Notulae Scientia Biologicae, 8(4), 461- 467.
20. Koocheki, A., Nassiri Mahallati, M., Rezvan beydokhti S. & Sanjani, S. 2017. The effect of planting bed height, manure and foliar feeding on corm criteria and yield of Saffron (Crocus sativus). Journal of Agroecology, 9(1), 158- 170. (In Persian)
21. Koocheki, A. & Khaje Hosseini, M. (2020). Saffron: Science, Technology and Health. Woodhead Publishing.
22. Krüger, M., Stockinger, H., Krüger, C. & Schüßler, A. (2009). DNA-based species level detection of Glomeromycota: one PCR primer set for all arbuscular mycorrhizal fungi. New Phytologist. 183, 212-223.
23. Makarian, H., Baradaran Firouzabadi, M. & Ghorbani Ghoujdi, H. (2017). Effect of drought stress, zeolite and ascorbic acid foliar application on growth and yield of saffron (Crocus sativus ). In: Proceeding of National Conference Medicinal Plants, 18-19 March, Shahrood University.
24. Martin, J. P., Black, J. H. & Hawthorne, R. M. (1997). Influence of earthworm-processed pig manure on the growth and yield of greenhouse tomatoes. Bioresource Technology, 75 (3), 175-180.
25. Mau, A. E. & Utami, R. S. (2014). Effects of biochar amendment and arbuscular mycorrhizal fungi inoculation on availability of soil phosphorus and growth of maize. Journal of Degraded & Mining Lands Management, 1(2), 69-74.
26. Naghizadeh, M., Gholami Shabestari, M. & Shamsaddin Saied, M. (2014). The study of some physiological responses of three Iranian saffron (Crocus sativus L.) landraces to salinity stress. Saffron Agronomy & Technology 2(2), 127- 136. (In Persian)
27. Najafi Ghiri, M. (2015). The effect of using different biochar on some soil properties and adsorption capability some nutrients in a calcareous soil. Journal of Soil Research, 29(3), 351- 358. (In Persian)
28. Nehvi, F. A., Khan, M. A., Lone, A. A. & Maqhdoomi, M. I. (2010). Impact of microbial inoculation on growth and yield of saffron in Kashmir. Acta Horticulturae, 850(27), 171-175.
29. Rasouli, Z., Maleki Farahani, S. & Besharati, H. (2013). Response of some vegetative properties of saffron (Crocus sativus ) to different fertilizer sources. Soil & Water Sciences, 27(1), 35-46. (In Persian)
30. Renker, C., Heinrichs, J., Kaldorf, M. & Buscot, F. (2003) Combining nested PCR and restriction digest of the internal transcribed spacer region to characterize arbuscular mycorrhizal fungi on roots from the field. Mycorrhiza, 13, 191-198.
31. Renau-Morata, B., Nebauer, S. G., Sanches, M. & Molina, R. V. (2012). Effect of corm size, water stress and cultivation conditions on photosynthesis and biomass partitioning during the vegetative growth of saffron (Crocus sativus). Industrial Crops and Products, 39, 40-46.
32. Sabet Teimouri, M., Kafi, M., Oorsaji, Z. & Orooji, K. (2010). Effect of drought stress, corm size and corm tunic on morpho-Ecophysiological charachteristics of saffron (Crocus sativus ) under greenhouse condition. Journal of Agroecology, 2(2), 323-334. (In Persian)
33. Sadravi, M. & Talaei, F. (2015). Methods of mass production of inoculum of endomycorrhizal fungi. Plant Pathology Science, 4(1), 13- 22. (In Persian)
34. Seyyedi, S. M., Ebrahimian, E. & Rezaei-Chiyaneh, E. (2018). Saffron daughter corms formation, nitrogen and phosphorous uptake in response to low planting density, sampling rounds, vermicompost and mineral fertilizers. Communications in Soil Science & Plant Analysis, 49(5), 585-
35. Srinivasan, M., Kumar, K., Kumutha, K. & Marimuthu, P. (2014). Establishing monoxenic culture of arbuscular mycorrhizal fungus Glomus intraradices through root organ culture. Journal of Applied and Natural Science, 6(1), 290-293.
36. Uzoma, K. C., Inoue, M., Andry, H., Fujimaki, H., Zahoor, A. & Nishihara E. (2011). Effect of cow manure biochar on maize productivity under sandy soil condition. Soil Use and Management, 27, 205-212.
37. Warnock, D. D., Lehmann, J., Kuyper, T. W. & Rillig, M. C. (2007). Mycorrhizal responses to biochar in soil - concepts and mechanisms. Plant & Soil, 300, 9-20.
38. Wang, L., Xue, X., Nie, X., Liu, Y. & Chen, F. (2018). Effects of biochar application on soil potassium dynamics and crop uptake. Journal of Plant Nutrition & Soil Science, 181, 635-643.

¹- Biochar

[2]- Pyrolysis