بررسی اثر ریزنمونه‌ و غلظت تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی بر کال‌زایی در گیاه Stipagrostis pennata

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه زراعت و اصلاح نباتات، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه تهران، کرج، ایران

2 گروه زراعت و اصلاح نباتات، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه تهران

3 گروه زراعت و اصلاح نباتات، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه تهران

چکیده

گیاه Stipagrostis pennata برای تقویت پوشش گیاهی مناطق کویری و همچنین تثبیت شن‌های روان کاشته می‌شود و به‌دلیل مشکل تولید بذر در این گیاه، این پژوهش با هدف القا کالوس در این گیاه انجام گرفت. تیمارهای آزمایش شامل دو نوع ریزنمونه (گره ساقه و بذر)، چهار سطح توفوردی کلروفنوکسی استیک اسید (2,4-D) با غلظت­های یک، دو، سه و چهار میلی­گرم در لیترو پنج سطح بنزیل آمینوپورین (BAP) با غلظت‌های صفر، 05/0، 1/0، 2/0 و 4/0 میلی­گرم در لیتر بودند که در محیط کشت پایه موراشینگ و اسکوگ اعمال شدندند.این پژوهش به­صورت فاکتوریل و بر پایه طرح کاملاً تصادفی در سه تکرار انجام شد. ریزنمونه بذر در تیمارهای سه میلی­گرم در لیتر توفوردی به همراه 4/0 و 2/0 میلی­گرم در لیتر بنزیل­آمینوپورین، بیش­ترین درصد القا کالوس (صد در صد) را نشان داد، درحالی‌که بالاترین درصد القا کالوس، در ریزنمونه گره ساقه (60 درصد) در تیمار سه میلی­گرم در لیتر توفوردی به همراه 4/0 میلی­گرم در لیتر بنزیل­آمینوپورین به­دست آمد. در مورد صفات سطح و وزن تر کالوس برای هر دو ریزنمونه و حجم کالوس در ریزنمونه بذر نیز تیمار سه میلی­گرم در لیتر توفوردی به همراه 4/0 میلی­گرم در لیتر بنزیل­آمینوپورین، به‌عنوان تیمار بهینه شناخته شد. ریزنمونه گره ساقه در تیمار دو میلی­گرم در لیتر توفوردی به همراه 1/0 میلی­گرم در لیتر بنزیل­آمینوپورین، بیش­ترین حجم کالوس را تولید کرد. به­طورکلی می­توان ریزنمونه بذر در ترکیب هورمونی غلظت­های سه میلی­گرم بر لیتر توفوردی به همراه 4/0 میلی­گرم در لیتر بنزیل­آمینوپورین را به­عنوان پروتکل بهینه­سازی شده معرفی کرد.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Effect of explants and concentrations of plant growth regulators on callus induction in Stipagrostis pennata

نویسندگان [English]

  • Masoumeh Asadi Aghbolaghi 1
  • Farzad Sharifzadeh 2
  • Mansoor Omidi 3
1 Department of Agronomy and Plant, Breeding, College of Agriculture and Natural Resources, Karaj, I. R. Iran
2 Department of Agronomy and Plant Breeding, College of Agriculture and Natural Resources, University of Tehran
3 Department of Agronomy and Plant Breeding, College of Agriculture and Natural Resources, University of Tehran
چکیده [English]

Stipagrostis pennata is one of the most important desert species to cover desert areas as well as to bind the sand which unfortunately cannot produce the best quality seed for its survival. This research was conducted to callus induction and experimental treatments included two types of explants (stem and seed), four various concentrations of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) consists of 1, 2, 3 and 4 mg /L and five levels of 6-benzylaminopurine (BAP) consists of 0, 0.05, 0.1, 0.2 and 0.4 mg /L were applied to the Murashing and Skoog basal media. This study was conducted as a factorial experiment based on completely randomized design with three replications. Results showed a significant interaction effect among explants, auxin and cytokinin on the traits related to callus induction. Seed explant showed the maximum of callus induction percentage (100%) in medium containing 3 mg/l 2,4-D with both 0.4 or 0.2 mg/l of BAP. The highest percentage of callus induction in stem node explant (60%) was obtained in 3 mg/l 2,4-D with 0.4 mg/l BAP treatment. For the surface and fresh weight of callus in both explants and the volume of callus in seed explant, 3 mg/l 2,4-D with 0.4 mg/l BAP was recognized as the best treatments. Stem node explant in the of 2 mg/l 2,4-D with 0.1 mg/l BAP treatment showed the highest volume of callus. In general, the use of seed explant in mg/l 2,4-D and 0.4 mg/l BAP treatment can be introduced as an optimized protocol.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Bread Auxin
  • Callus induction
  • cytokinin
  • Stipagrostis pennata
  • Tissue culture

مقدمه

گیاه Stipagrostis pennata متعلق به جنس Stipagrostis ، طایفه Aristideae و تیره Poaceae، گونه­ای علفی، چندساله، دارای ساقه­های زیرزمینی رونده، ماسه­دوست، خوش­خوراک و مقاوم به خشکی است که در زبان فارسی به آن سبد یا بسط گفته می­شود و در شرایط سخت محیطی ماسه­زارها و با وجود طوفان­های سهمگین، گرمای شدید و کمبود رطوبت، امکان رشد و نمو، زادآوری و تجدید حیات را دارد (Biroodian, 2001). طول ریشه­های توزیع شده این گیاه را به‌طور متوسط سه تا هفت متر برآورد نموده­اند (Batooli, 2003). از طرفی، وجود برگ­های باریک و کشیده با ظاهری خشن، از اتلاف آب جلوگیری می­کند. با توجه به این ویژگی­های بارز، این گیاه از گیاهان مهم مرتعی برای توسعه و اصلاح مراتع خشک معرفی شده است (Moghimi, 2005). گیاه سبد جزو گیاهان مهم پوششی مراتع می‌باشد که به­‌دلیل خصوصیات رویشی، نقش بالا در تثبیت شن­های روان و حفاظت خاک از فرسایش‌ دارد. همچنین از گیاهچه‌های گیاهان دیگر در برابر چرا حفاظت می­کند و رطوبت مورد نیاز این گیاهان را تأمین می­کند. علوفه تولیدی این گیاه، دارای حجم زیاد و بسیار خوش­خوراک است که در مناطق حاشیه کویر، توسط انواع دام به­خصوص شتر مورد استفاده قرار می‌گیرد (Tian et al., 2019). گیاه سبد، به‌دلیل وﺟﻮد اﻧﺪام­های ﻫﻮاﻳﻲ ﻃﻮﻳﻞ ﻗﺎﺑﻞ ﻣﻼﺣﻈﻪ، در ﺑﺮاﺑﺮ ﻃﻮﻓﺎن ﺷﻦ و ﻓﺮﺳﺎﻳﺶ ﺑﺎدی، ﻣﻘﺎوﻣﺖ ﺧﻮﺑﻲ از ﺧﻮد ﻧﺸﺎن ﻣﻲ­دﻫﺪ و وﺟﻮد ﻏﻼﻓﻲ از ﺷﻦ­داﻧﻪ در اﻃﺮاف ﺳﻴﺴﺘﻢ رﻳﺸﻪ، ﻫﻤﭽﻮن ﻋﺎﻳﻘﻲ از ﺗﻤﺎس ﻣﺴﺘﻘﻴﻢ ﻧﻮر و ﺣﺮارت ﺑﻪ رﻳﺸﻪ­ﻫﺎ جلوگیری می‌کند و ﺑﺮدﺑﺎری ﮔﻴﺎه را در برابر شرایط ﮔﺮﻣﺎ و ﺧﺸﻜﻲ اﻓﺰاﻳﺶ ﻣﻲدﻫﺪ؛ بنابراین ﮔﻮﻧﻪ ﺳﺒﺪ ﺑﻪﻋﻨﻮان ﻳﻜﻲ از ﮔﻮﻧﻪ­ﻫﺎی ﺷﻦ­دوﺳﺖ در ﺗﭙﻪ­ﻫﺎی ﻣﺎﺳﻪ­ای ﻣﻌﺮﻓﻲ ﺷﺪه است (Amirabadi-zadeh & Borhan, 1993). با وجود این ویژگی­های مطلوب، پتانسیل تولید بذر در این گیاه پایین است و بذرهای تولیدی نیز فاقد توان جوانه­زنی و شانس بقا در این مناطق می­باشند (Tian et al., 2019). بنابراین با توجه به اهمیت این گونه، بررسی امکان تکثیر غیرجنسی و استفاده از تکنیک کشت بافت برای احیاء و تولید انبوه آن حائز اهمیت می‌باشد.

تکنیک کشت بافت، یکی از روش‎های مطلوب در تکثیر سریع گیاهان سالم و یکنواخت و نیز تولید گیاهان مقاوم است که امروزه کاربردهای فراوان دارد. تکثیر با استفاده از این تکنیک، در راستای تولید انبوده گیاهان با کیفیت، بسیار متداول است که روش­های مختلفی برای آن استفاده می­شوند؛ از جمله این روش­ها می­توان به تکثیر با استفاده از کال­زایی اشاره نمود
 (keyhanfar, 2014). بافت کالوس، کاربردهای مختلفی در ازدیاد گیاه دارد. از مهم­ترین این کاربردها، استفاده کالوس برای تکثیر گیاه از دو طریق عمده اندام­زایی و جنین­زایی می­باشد (Kayser & Quax, 2006). طبق تحقیقی، نوع ریزنمونه بر میزان کال­زایی تاثیر معنی­داری دارد(Gholami and Tarinejad, 2018) . همچنین میزان کالوس­زایی در سیب­زمینی به­طور معنی­داری تحت تاثیر نوع ریزنمونه و میزان هورمون قرار گرفت (Amerian, 2018). بررسی امکان کال­زایی در گیاه بریش (Hyparrhenia hirta L.)، گویای تاثیر نوع ریزنمونه و ترکیب هورمونی بر صفات کال­زایی بود (Salimi, 2010).

با توجه به ابداع روش­های باززایی غیرمستقیم به­واسطه کال­زایی، بر آن شدیم که در مسیر تعیین بهترین روش تکثیر غیرجنسی این گیاه و ارایه آن به مراجع زیربط، اقدامی در جهت احیای اراضی بیابانی انجام دهیم. هدف از این تحقیق، شناسایی مناسب­ترین ریزنمونه و تیمار هورمونی در راستای القاء کالوس در گیاه ﺳﺒﺪ می­باشد.

 

مواد و روش‌ها

این آزمایش در سال 1398 در آزمایشگاه کشت بافت گروه زراعت و اصلاح نباتات پردیس کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه تهران انجام شد. گیاهان مورد مطالعه از منطقه کرخه استان خوزستان جمع­آوری و به گلخانه منتقل شدند. در این آزمایش، از دو نوع ریزنمونه شامل گره ساقه (اندازه تقریبی یک سانتی­متر) و بذر استفاده شد. ریزنمونه­ها از گیاهان جدا شدند و در سریع­ترین زمان ممکن در ظرف دربسته به آزمایشگاه منتقل شدند. جهت ضدعفونی آن­ها، ابتدا در اتانول 70 درصد به مدت یک دقیقه قرار گرفتند و پس از آبکشی با آب مقطر استریل، 10 دقیقه در محلول هیپوکلریت سدیم دو درصد (حاوی پنج درصد کلر فعال) غوطه­ور شدند. در انتها، سه بار با آب مقطر استریل آب­کشی شدند و به مدت 30 دقیقه در زیر هود استریل خشک شدند.

تیمارهای هورمونی شامل چهار سطح (یک، دو، سه و چهار میلی­گرم در لیتر) هورمون اکسین‌ 2و4 – دی کلروفنوکسی استیک اسید (2,4-D) و پنج سطح سیتوکنین بنزیل­آمینوپورین (BAP) (صفر، 05/0، 1/0، 2/. و 4/0 میلی­گرم در لیتر) بودند. کلیه تیمارهای هورمونی به محیط کشت پایه ام­اس
 (Murashige and Skoog, 1962) دارای سه درصد ساکارز و 7/0 درصد آگار با pH 6/5 - 8/5 اضافه شدند و در اتوکلاو با دمای 121 درجه سانتی­گراد و فشار 2/1 بار به مدت 20 دقیقه ضدعفونی شدند. به منظور القای کال­زایی، ریزنمونه­ها به پتری­دیش‌های حاوی محیط کشت منتقل شدند و در انکوباتور در شرایط تاریکی با دمای 2±25 درجه سانتی­گراد قرار گرفتند.

یک هفته پس از کشت ریزنمونه­ها، تشکیل کالوس آغاز شدد. کالوس­های تشکیل شده، سفیدرنگ، شفاف و دارای بافت نرم بودند. پس از سپری شدن حدود یک ماه، تعداد ریزنمونه‌هایی که تولید کالوس کردند، شمارش شدند و درصد کال­زایی به­صورت نسبت تعداد ریزنمونه­هایی که کالوس در آن­ها القا شده به تعداد کل ریزنمونه­ها، برای هر تیمار محاسبه شد. بررسی ابعاد کالوس­ها با استفاده از اندازه­گیری سطح (با واحد میلی­متر مربع) و حجم (با واحد میلی­متر مکعب) آن­ها صورت گرفت. به‌دلیل نامنظم بودن شکل کالوس، سطح کالوس با استفاده از کاغذ میلی­متری و با ضرب کردن بزرگ­ترین طول در بزرگ­ترین عرض کالوس به­دست آمد (Pirouzi, 2018). همچنین حاصل ضرب بزرگ­ترین ارتفاع در سطح کالوس، به­عنوان حجم آن در نظر گرفته شد (Pirouzi, 2018). وزن تر کالوس­ها (با واحد گرم) نیز با استفاده از ترازوی دیجیتال با دقت ده هزارم در زیر هود استریل، اندازه­گیری شد.

این تحقیق به­صورت فاکتوریل و در قالب طرح کاملا تصادفی با سه تکرار انجام شد که برای هر تکرار، سه پتری­دیش و برای هر پتری­دیش پنج ریزنمونه در نظر گرفته شد. بررسی آماری داده­ها با استفاده از نرم افزار SAS 9.2 انجام شد. تیمار­ها به کمک روش Proc glm و بر اساس آزمون چند دامنه­ای دانکن در پنج درصد گروه­بندی شدند و نمودارها با استفاده از نرم افزار 2016Excel  رسم شدند.

 

نتایج و بحث

پس از گذشت یک هفته از اعمال تیمارها، القا کالوس در آن­ها مشاهده شد که در ابتدا، کالوس­ها سفید و خمیری بودند، اما پس از گذشت یک ماه، به کالوس­های کرم­رنگ و شکری تبدیل شدند (شکل 1).

 

 
   

 

 

 

 

 

 

 

 

 


شکل 1- القا کالوس در ریزنمونه­ ساقه (A) و بذر (B) در گیاه سبد.

Figure 1. Callus induction in seed (A) andstem node (B) explants in Stipagrostis pennata.

 

 

نتایج تجزیه واریانس نشان داد که اثر متقابل غلظت­های مختلف هورمون توفوردی، بنزیل­آمینوپورین و نوع ریزنمونه بر روی صفات درصد کال­زایی، سطح، حجم و وزن تر کالوس، در سطح احتمال یک درصد معنی­دار بود (جدول 1).

 

 

جدول 1- تجزیه واریانس اثر غلظت­های مختلف هورمون توفوردی، بنزیل­آمینو­پورین و ریزنمونه­های مختلف بر صفات کال­زایی در گیاه سبد.

Table 1. Variance analysis of the effect of different concentrations of 2,4-dichlorophenoxy (2,4-D), 6-Benzylaminopurine (BAP) and different explants on the callus induction characteristics of Stipagrostis pennata.

Mean squares

 

 

callus fresh weight

callus volume

callus surface

callus induction percentage

df

S.O.V

 

**0.104

27963.1**

2116.9**

875.4**

4

BAP

 

**0.363

4739.1**

1145.5**

133.4*

3

 2,4-D

 

**2.63

17828.3**

329.9**

136822**

1

P

 

**0.04

5225.4**

642.5**

556.7**

12

BAP × 2,4-D

 

**0.03

5638.6**

985.1**

**324.9

4

BAP × P

 

**0.13

3020.9**

386.7**

80.4*

3

2,4-D × P

 

**0.05

2621.9**

406.3**

520.5**

12

BAP × 2,4-D × P

 

0.002

60.7

8.9

27.6

80

Error

 

11.7

9.5

11.1

9.2

-

CV(%)

 

                 

BAP: بنزیل­آمینوپورین، 2,4-D: توفوردی، P: ریزنمونه.؛ ** و *: به‌ترتیب معنی­دار در سطح احتمال یک و پنج درصد.

BAP: 6-Benzylaminopurine, 2,4-D: 2, 4-dichlorophenoxy, P: explant; ** and *: Significant at 1% and 5% of probability levels, respectively.

 

 

بالاترین میزان درصد کال­زایی (صد در صد) به ریزنمونه بذر و غلظت سه میلی­گرم در لیتر هورمون توفوردی به همراه غلظت میلی­گرم در لیتر 4/0 و 2/0 هورمون بنزیل­آمینوپورین تعلق داشت. در تحقیقی بر روی کال­زایی در گیاه گندم، بالاترین درصد القا کالوس در محیط کشت حاوی یک میلی­گرم بر لیتر توفوردی به­دست آمد که از نظر غلظت بهینه توفوردی، با نتایج پژوهش پیش رو مطابقت ندارد (Hakam et al., 2015)، اما کاملا با نتایج تحقیقی در زمینه بررسی کال­زایی در گیاه بریش هم­خوانی دارد (Salimi, 2010). در پژوهش دیگری، بالاترین میزان القا کالوس در گیاه Eleusine coracana در محیط ام­اس حاوی غلظت 5/1 میلی­گرم در لیتر اکسین مشاهده شد (Kashyap et al., 2018). هم‌چنین کم­ترین درصد کال­زایی در ریزنمونه ساقه در تیمارهای بدون بنزیل­آمینوپورین و غلظت­های یک، دو و چهار میلی­گرم در لیتر توفوردی (پنج درصد)، توفوردی سه میلی­گرم در لیتر به همراه 1/0 میلی­گرم در لیتر بنزیل­آمینوپورین (سه درصد) و توفوردی چهار میلی­گرم در لیتر به همراه 05/0 میلی­گرم در لیتر بنزیل­آمینوپورین (سه درصد) مشاهده شد و در تیمار یک میلی­گرم در لیتر توفوردی در ترکیب با 2/0 میلی­گرم در لیتر بنزیل­آمینوپورین کال­زایی صورت نگرفت (شکل 2).

تیمار هورمونی سه میلی­گرم در لیتر توفوردی به همراه 4/0 میلی­گرم در لیتر بنزیل­آمینوپورین در ریزنمونه بذر، بیش­ترین میزان سطح کالوس (6/65 میلی­متر مربع) را دارا بود که با همین ترکیب هورمونی در ریزنمونه گره ساقه ( 6/61 میلی­متر مربع) تفاوت معنی­داری نداشت. از طرف دیگر، ریزنمونه گره ساقه در ترکیب­های هورمونی سه میلی­گرم توفوردی در لیتر و 1/0 میلی­گرم بنزیل­آمینوپورین در لیتر (چهار میلی­متر مربع)، یک، دو و چهار میلی­گرم توفوردی در لیتر بدون بنزیل­آمینوپورین و چهار میلی­گرم توفوردی در لیتر همراه با 05/0 میلی­گرم بنزیل­آمینوپورین در لیتر (سه میلی­متر مربع)، کم­ترین میزان سطح کالوس را نشان دادند (شکل 3).

 

 

 

شکل 2- مقایسه میانگین درصد القا کالوس در ریزنمونه­های گره ساقه و بذر گیاه سبد، تحت تاثیر غلظت­های مختلف 2,4-D و BAP. میانگین‏های دارای حروف مشابه، با یکدیگر تفاوت معنی‏دار ندارند (آزمون دانکن، p<0.05).

Figure2. Means comparison of callus induction percentage of stem node and seed explants of Stipagrostis pennata under different concentrations of 2,4-D and BAP. Means with the same letters are not significantly different (Duncan test, p<0.05).

 

 

شکل 3- مقایسه میانگین سطح کالوس حاصل از ریزنمونه­های گره ساقه و بذر گیاه سبد، تحت تاثیر غلظت­های مختلف 2,4-D و BAP. میانگین‏های دارای حروف مشابه، با یکدیگر تفاوت معنی‏دار ندارند (آزمون دانکن، p<0.05).

Figure 3. Means comparison of callus surface of Stipagrostis pennatastem node and seed explants under different concentrations of 2,4-D and BAP. Means with the same letters are not significantly different (Duncan test, p<0.05).

 

 

بیش­ترین میزان حجم کالوس (205 میلی­متر مکعب) در تیمار سه میلی­گرم توفوردی در لیتر به همراه 4/0 میلی­گرم بنزیل­آمینوپورین در لیتر در ریزنمونه بذر مشاهده شد و ریزنمونه گره در تیمارهای چهار میلی­گرم توفوردی در لیتر بدون بنزیل­آمینوپورین و نیز با 05/0 میلی­گرم بنزیل­آمینوپورین در لیتر (10 میلی­متر مکعب)، دو میلی­گرم توفوردی در لیتر بدون بنزیل­آمینوپورین (نه میلی­متر مکعب)، سه میلی­گرم توفوردی در لیتر همراه با 1/0 میلی­گرم بنزیل­آمینوپورین در لیتر (هشت میلی­متر مکعب) و یک میلی­گرم توفوردی در لیتر بدون بنزیل­آمینوپورین (هفت میلی­متر مکعب)، دارای کم­ترین میزان حجم کالوس بودند (شکل 4).

 

 

 

شکل 4- مقایسه میانگین حجم کالوس حاصل از ریزنمونه­های گره ساقه و بذر گیاه سبد تحت تاثیر غلظت­های مختلف 2,4-D و BAP . میانگین‏های دارای حروف مشابه، با یکدیگر تفاوت معنی‏دار ندارند (آزمون دانکن، p<0.05).

Figure 4. Means comparison of callus volume of Stipagrostis pennatastem node and seed explants under different concentrations of 2,4-D and BAP. Means with the same letters are not significantly different (Duncan test, p<0.05).

 

 

کالوس­های حاصل از ریزنمونه بذر در تیمار هورمونی سه میلی­گرم توفوردی در لیتر به همراه 4/0 میلی­گرم بنزیل­آمینوپورین در لیتر،  بیش­ترین وزن تر (83/0 گرم) را نشان دادند و کم­ترین میزان وزن تر (صفر) در ریزنمونه گره تحت تیمار 2/0 میلی­گرم بنزیل­آمینوپورین در لیتر به­همراه یک میلی­گرم هورمون توفوردی در لیتر مشاهده شد که با تیمارهای یک میلی­گرم توفوردی در لیتر بدون بنزیل­آمینوپورین، دو میلی­گرم توفوردی در لیتر بدون بنزیل­آمینوپورین، سه میلی­گرم توفوردی در لیتر به­همراه 1/0 میلی­گرم نزیل­آمینوپورین در لیتر بو چهار میلی­گرم توفوردی در لیتر بدون بنزیل­آمینوپورین و با 05/0 میلی­گرم بنزیل­آمینوپورین در لیتر برای همین ریزنمونه، تفاوت معنی­داری نداشت (شکل 5). نتایج پژوهشی با هدف کالوس­زائی و اندام­زائی از جداکشت­های مختلف گیاه علف مار (Capparis spinosa L.) تحت شرایط درون شیشه­اینشان داد که بهترین ترکیبات هورمونی برای کالوس­دهی از نظر میانگین وزن تر کالوس، محیط کشت موراشیگ و اسکوک حاوی 02/0 میلی­گرم نفتالین استیک اسید بر لیتر و یک میلی­گرم کینتین در لیتر بود (Sheikhi Hamouleh et al., 2019).

محدوده درصد کالوس­زایی در ریزنمونه­ بذر، از 81 درصد تا صد در صد و در ریزنمونه ساقه، از صفر تا 60 درصد بود که نشان از برتربودن ریزنمونه بذر در راستای تولید کالوس می­باشد (شکل 2). همچنین محدوده حجمی کالوس­های به­دست آمده از ریزنمونه بذر (از 30 تا 205 میلی­متر مکعب)، در سطح بالاتری از این محدوده در ریزنمونه گره ساقه (از صفر تا 143 میلی­متر مکعب) قرار داشت (شکل 4). این موضوع در مورد صفت وزن تر کالوس (محدوده ریزنمونه بذر= از 3/0 تا 8/0 گرم و ریزنمونه گره ساقه= از صفر تا 5/0) هم صادق بود (شکل 5).

تحقیقات متعددی، گویای تاثیرگذاری عوامل خارجی و داخلی بر نتایج حاصل از کشت بافت می­باشد که از جمله این عوامل می­توان به نوع ریزنمونه، ترکیبات محیط کشت و شرایط فیزیکی محیط اشاره کرد (Torres, 1989; Lal et al., 2016). مقایسات میانگین اثرات ریزنمونه، نوع و سطوح هورمونی بر صفات کال­زایی گیاه Stipagrostis pennata در پژوهش حاضر نشان داد که نوع ریزنمونه و نوع و غلظت تنظیم­کننده­های رشدی به­کار رفته، اثر معنی‌داری بر تولید کالوس داشت. بر اساس نتایج یک تحقیق، کالوس­زایی در گندم به ژنوتیپ، نوع ریزنمونه و ترکیبات محیط کشت بستگی دارد(Gholami & Tarinejad, 2018) . همچنین بررسی کال­زایی در گیاه
Agropyron cristatum  نشان داد که حضور پیکلورام در محیط کشت، نقش به­سزایی داشته است، به­طوری‌که بیش­ترین وزن تر کالوس، در غلظت هشت میلی­گرم پیکلورام در لیتر تولید شد (Can et al., 2008). در مورد گیاه Pennisetum purpureum نیز توفوردی و بنزیل­آمینوپورین، اثر خود را نشان دادند، به­طوری­که حضور دو میلی­گرم توفوردی در لیتر به همراه 5/0 میلی­گرم بنزیل­آمینوپورین در لیتر در محیط کشت نسبت به حضور تنها 5/0 میلی­گرم توفوردی در لیتر، نقش موثرتری در تولید کالوس داشت
 (Umami et al., 2016).

 

 

شکل 5- مقایسه میانگین وزن تر کالوس حاصل از ریزنمونه­های گره ساقه و بذر گیاه سبد تحت تاثیر غلظت­های مختلف 2,4-D و BAP. میانگین‏های دارای حروف مشابه، با یکدیگر تفاوت معنی‏دار ندارند (آزمون دانکن، p<0.05).

Figure 5. Means comparison of callus fresh weight of Stipagrostis pennatastem node and seed explants under different concentrations of 2,4-D and BAP. Means with the same letters are not significantly different (Duncan test, p<0.05).

 

 

طبق نتایج این تحقیق، استفاده از گره ساقه نتوانست مقدار کالوس مورد انتظار را فراهم کند که با نتایج تحقیقی بر روی Brachiaria مطابقت داشت
 (Cabral et al., 2011). اگرچه که استفاده از این سیستم برای B. brizantha توانست کالوس­های جنین­زا تولید کند، اما آن­ها نتوانستند به گیاه تبدیل شوند. همچنین گزارش شده است که استفاده از بافت­های رویشی به­عنوان ریزنمونه برای تولید کالوس در تک­لپه­ای­ها مشکل است و گیاهان محدودی تولید می­کند (Chaudhury & Qu, 2000).

 واکنش­ متفاوت ریزنمونه­ها از لحاظ کالوس­زایی به تغییرات غلظت تنظیم­کننده­­های رشدی می­تواند مربوط به فیزیولوژی گیاه منبع ریزنمونه­ها (گیاه پایه) باشد که تاثیر عمیقی بر روی پاسخ­دهی در شرایط درون شیشه­ای دارد. اگرچه گیاهان حاصل از تکثیر رویشی
 (کلون­ها)، از لحاظ ژنتیکی کاملا شبیه گیاه مادری هستند، اما توده کلونی حاصل از یک گیاه مادری با توده کلونی حاصل از گیاه مادری دیگر متفاوت است
 (Merkle et al., 1990).

با وجود این­که هر دو هورمون به­کار رفته در این پژوهش (2.4-D و BAP) بر القاء کالوس تاثیر قابل توجهی داشتند، اما غلظت متوسط توفوردی توانست نقش مهمی ایفا کند که با نتایج تحقیقات در گذشته مطابقت داشت Binte Mostafiz & Wagiran, 2018)  Amerian, 2018; (Bi et al, 2007;. تحقیقات نشان داد که بدون حضور اکسین، کال­زایی مشاهده نخواهد شد. همچنین گزارش شده است که بهترین نوع اکسین برای القای کال­زایی در تک­لپه­ای­ها، توفوردی می­باشد  (Iqbal et al., 2016)که غلظت آن علاوه بر القای کالوس، بر درصد کال­زایی، بافت و رنگ کالوس نیز موثر است (Khalafalla et al., 2010). علاوه بر این نشان داده­اند که غلظت متوسط اکسین به همراه غلظت بالای بنزیل­آمینوپورین می­تواند نقش مهمی در تشکیل کالوس داشته باشد(Bi et al., 2007) .

در پژوهش حاضر، استفاده از ریزنمونه بذر و غلظت‌ متوسط هورمون توفوردی در ترکیب با غلظت بالای هورمون بنزیل‌آمینوپورین، نتایج مطلوبی در صفات اندازه‌گیری­شده نشان داد، ‌به­طوری‌که سه میلی­گرم هورمون توفوردی در لیتر در ترکیب با 4/0 میلی­گرم هورمون بنزیل‌آمینوپورین در لیتر در ریزنمونه بذر، بیش­ترین درصد القا کالوس (صد در صد) را به­‌همراه داشت به­علاوه، کیفیت کالوس‌های به­دست­آمده از لحاظ سطح و حجم در هنگام استفاده از این ترکیب هورمونی نسبت به سایر تیمارها، نتایج بهتری را نشان دادند. نتایج حاصل از این پژوهش نشان داد که ترکیب هورمونی توفوردی و بنزیل­آمینوپورین در محیط کشت، بر روی کال­زایی و صفات مربوط به آن موثر می­باشد، به­طوری­که حضور همزمان اکسین و سیتوکینین، در القای تقسیمات سلولی و تمایزات سلولی ضروری بود و تقسیمات سلولی، موجب تشکیل کالوس و تمایز سلولی، موجب اندام­زایی شد. با افزایش غلظت توفوردی در محیط کشت، افزایش تقسیمات سلولی در سطح ریزنمونه و در نتیجه افزایش وزن تر و خشک کالوس مورد انتظار خواهد بود (Haque et al., 2003). تنوع در فراوانی تولید کالوس در پاسخ به سطوح مختلف هورمونی، می‌تواند به­دلیل تمایز در بیان ژن‌های کنترل­کننده تولید کالوس باشد. با این وجود، ممکن است که در بعضی از سطوح هورمونی مورد استفاده، برخی از ژن‌های مسئول در سنتز کالوس، به­طور کامل بیان نشوند (Mahmood et al., 2012) .

طبق بررسی‌های صورت گرفته، تاکنون گزارشی مبنی بر استفاده از فن­آوری کشت بافت در ریزازدیادی گیاه Stipagrostis pennata منتشر نشده است و این تحقیق، اولین تحقیق تولید کالوس در این گیاه می­باشد.

 

نتیجه‌گیری کلی

یافته­های این پژوهش می­تواند به­عنوان یک دستورالعمل در تولید کالوس در گیاه
 Stipagrostis pennata استفاده شود. طبق نتایج این پژوهش، بیش­ترین درصد القای کالوس در ریزنمونه بذر، در تیمارهای سه میلی­گرم توفوردی بر لیتر به همراه 4/0 و نیز 2/0 میلی­گرم بنزیل­آمینوپورین در لیتر و در ریزنمونه گره ساقه، در تیمار سه میلی­گرم توفوردی بر لیتر به همراه 4/0 میلی­گرم بنزیل­آمینوپورین در لیتر به­دست آمد. در مورد صفت سطح کالوس، هر دو ریزنمونه بالاترین میزان را در ترکیب هورمونی سه میلی­گرم توفوردی بر لیتر به همراه 4/0 میلی­گرم بنزیل­آمینوپورین در لیتر نشان دادند. بیش­ترین مقدار حجم کالوس در ریزنمونه بذر، در محیط کشت حاوی سه میلی­گرم توفوردی بر لیتر به همراه 4/0 میلی­گرم بنزیل­آمینوپورین در لیتر و در ریزنمونه گره ساقه، در ترکیب هورمونی دو میلی­گرم توفوردی بر لیتر به همراه 1/0 میلی­گرم بنزیل­آمینوپورین در لیتر به­دست آمد. همچنین بالاترین مقدار صفت وزن تر کالوس، در هر دو ریزنمونه در تیمار سه میلی­گرم توفوردی بر لیتر به همراه 4/0 میلی­گرم بنزیل­آمینوپورین در لیتر حاصل شد.

اگرچه در رقابت دو ریزنمونه برای کال­زایی، بیش­ترین مقدار این صفت در تیمار هورمونی سه میلی­گرم توفوردی در لیتر همراه با 4/0 میلی­گرم بنزیل­آمینوپورین در لیتربه دست آمد، اما از نظر درصد کالوس­های تولیدشده، ریزنمونه بذر برتری داشت، چرا که حتی کم­ترین میزان کال­زایی در بذر (81 درصد)، بر بیش­ترین میزان این صفت در ریزنمونه گره ساقه (60 درصد) برتری داشت؛ اما این موضوع در مورد سایر صفات، عمومیت نداشت و با تغییر ترکیب هورمونی موجود در محیط کشت، نوساناتی در کیفیت کالوس­های تولیدشده حاصل از هر دو ریزنمونه مشاهده شد.

در انتها می­توان استفاده از ریزنمونه بذر در ترکیب هورمونی غلظت­های سه میلی­گرم توفوردی بر لیتر به همراه 4/0 میلی­گرم بنزیل­آمینوپورین در لیتر را به­عنوان پروتکل بهینه­سازی شده معرفی کرد. از این نتایج می­توان در راستای پژوهش­های تکمیلی و نیز اهداف اصلاحی در رسیدن به صفات مطلوب استفاده کرد.

 

 

 

 

 

REFERENCES

  1. Amerian, M. (2018). The Effect of growing conditions explants and growth regulators on callus induction Potato Plant (Solanum tuberosum L.). Journal of Plant Research (Iranian Journal of Biology), 31(4). (In Persian).
  2. Amirabadi-Zadeh, H. & Borhan, M. H. (1993). A report on climate and deserts of Iran and Afghanistan. Journal of Pajouhesh & Sazandegi, 21, 32-27. (In Persian).
  3. Batooli, H. (2003). Ecological study of plant communities of Kashan Rige-Boland sandy dunes. PhD. Thesis. Islamic Azad University, Science and Research Branch, Tehran. (In Persian).
  4. Bi, R. M., Kou, M., Chen, L. G., Mao, S. R. & Wang, H. G. (2007). Plant regeneration through callus initiation from mature embryo of Triticum. Journal of Plant Breeding, 126(1), 9–12.
  5. Binte Mostafiz, S. & Wagiran, A. (2018). Efficient callus induction and regeneration in selected indica rice. Journal of Agronomy, 8(5), 77.
  6. Biroodian, N. (2001). Principles of Desert Management. Rashad Publications, Gorgan, 28. (In Persian).
  7. Cabral, G. B., Carneiro, V. T. C., Lacerda, A. L., Valle, C. B. D., Martinelli, A. P. & Dusi, D. M. D. A. (2011). Somatic embryogenesis and organogenesis in apomictic and sexual Brachiaria brizantha. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 107(2), 271–282.
  8. Can. E., Çeliktaş, N. & Hatipoğlu, R. (2008). Effect of auxin type and concentrations in different media on the callus induction and shoot formation of crested wheatgrass (Agropyron cristatum (L.) Gaertn). Journal of Biotechnology and Biotechnological Equipment, 22(3), 782–786.
  9. Chaudhury, A. & Qu, R. (2000). Somatic embryogenesis and plant regeneration of turf-type bermudagrass: Effect of 6-benzyladenine in callus induction medium. Journal of plant biotechnology, 60(2), 113–120.
  10. Gholami, A. A. & Tarinejad, A. (2018). Callus induction and regeneration of bread wheat cultivars from different explants. Journal of Cell and Tissue (JCT), 9(1), 25-56. (In Persian).
  11. Hakam, N., Udupa, S. M., Rabha, A., Ibriz, M. & Iraq, D. (2015). Efficient callus induction and plantlets regeneration in bread wheat using immature and mature embryos. International Journal of Biotechnology Research, 3(1), 1-9.
  12. Haque, M. A., Nath, U. K., Ahmad, Q. N. & Alam, S. (2003). Effect of 2,4-D and BAP on in vitro regeneration of garlic. Journal of Biological Sciences, 2(12), 771–774.
  13. Iqbal, A., Rizwan, A., Mukhtar, Z., Mansoor, S. & Asad, S. (2016). Establishment of an efficient and reproducible regeneration system for potato cultivars grown in pakistan. Pakistan Journal of Botany, 48(1), 258-290.
  14. Kashyap, A., Penak, S. M., Saha, A. & Singh, B. R. (2018). In vitro plant development of Eleusine coracana via indirect organogenesis and somatic embryogenesis using mature seeds as explants. Current Science, 115(1), 91-98.
  15. Kayser, O., & Quax, W. (2006). Medicinal Plant Biotechnology. Wiley-VCH.
  16. keyhanfar, M. (2014). Callus induction in Burdock (Arctium lappa L.). Journal of Cellular and Molecular Research. (Iranian Journal of Biology), 27(2), 252-259. (In Persian).
  17. Khalafalla, M. M., Elaleem, K. G. A. & Modawi, R. S. (2010). Callus formation and organogenesis of potato (Solanum tuberosum L.) cultivar Almera. Journal of Phytology, 2(5), 40–46.
  18. Lal, D., Sharma, A., Tak, K. R. & Ashok, T. H. (2016). Effect of growth regulators and chemical supplements on callus induction in japonica rice varieties through anther culture. Research in Environment and Life Sciences, 9(7), 903-906.
  19. Mahmood, I., Razzaq, A., Khan, Z. U. D., Hafiz, I. A. & Kaleem, S. (2012). Evaluation of tissue culture responses of promising wheat (Triticum aestivum L.) cultivars and development of efficient regeneration system. Pakistan Journal of Botany, 44, 277-284.
  20. Merkle, S. A., Parrott, W. A. & Williams, E. G. (1990). Applications of somatic embryogenesis and embryo cloning, In: Bhojwani S. S. (Ed.) Plant Tissue Culture: Applications and Limitations. Developments in Crop Science. Elsevier Science Publishers, The Netherlands. 19, 67–101.
  21. Moghimi, J. (2005). Introduction of some important rangeland species suitable for Iran rangeland development and improvement. Arvan publications, Tehran. 579. (In Persian).
  22. Murashige, T. & Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum, 15(3), 473–497.
  23. Pirouzi, R. (2018). Somatic embryogenesis and synthetic seed production of Astragalus meridionalis and Hyparrhenia hirta. MSc. Thesis. Faculty of Agricultural Sciences and Engineering, University of Tehran, Iran.
  24. Salimi, Z. (2010). Investigation of the possibility of somatic embryogenesis and synthetic seed production of Hyparrhenia hirta. MSc. Thesis. Faculty of Agricultural Sciences and Engineering, University of Tehran, Iran.
  25. Sheikhi Hamouleh, M., Fahmideh, L., Bana-Kashani, F. & Soluki, M. (2019). Callus induction and organogenesis from different explant of Caloparis spinosa L. under the in vitro condition. Journal of Plant Production Research (JOPPR),26 (1), 88-75. (In Persian).
  26. Tian, Y., Ma, X., Li, Y., Cheng, C., Ge, F. & An, D. (2019). Relationship between microbial diversity and nitrogenase activity of Stipagrostis pennata rhizosheath. Journal of Cellular Biochemistry, 120(8), 13501-13508.
  27. Torres, K. T. (1989). Tissue culture techniques for horticulture crop.Van Nostrand Reinhold, New York.
  28. Umami, N., Akashi, R., Gondo, T., Ishigaki, G. & Tanaka, H. (2016). Study on callus induction system of 4 genotype of Napiergrass (Pennisetum purpureum). Animal production, 18(3), 131-140.