نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 دانشجوی دکترا گروه زراعت واصلاح نباتات، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه تهران،
2 دانشیار، گروه زراعت واصلاح نباتات، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه تهران،
3 استادیار، پژوهشکده گیاهان و مواد اولیه گیاهان دارویی، دانشگاه شهید بهشتی تهران
چکیده
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Thyme is one of the most widely used and valuable medicinal plants in the world. To study the genetic diversity, 22 populations of Iranian thyme from four species, T. deanensis ,T. Pubescence ,T. kotschyanus and T. lancifolius as well as a population of T. vulgaris evaluated by 12 ISSR primers. Ten ISSR primers produced detectable bands with 57 alleles. The highest amount of the PIC (Polymorphism Information Content) was detected in P9 primer with 0.92 PIC. Primers with AC and AG motifs produced sharper bands. Cluster analysis based on molecular data grouped the populations in two separate classes. The range of genetic distance between populations varied from 0.03 to 0.4. Daran-Isfahan population and T. vulgaris revealed the highest (I=0.43, h= 0.29) and the lowest (I=0.16, h= 0.106) intra-population variation, respectively. The intra- and inter-population diversities contributed 23% and 77% to total Variation, respectively. T. deanensis and T. lancifolius indicated the highest polymorphism with 98.25% and 77.44%, respectively while the lowest polymorphism was detected in T. vulgaris (35.9 %). The intra- and inter-species diversities contributed 10% and 90% to total variation, respectively. Results showed a great genetic variation in Iranian thyme species which could be considered in hybridization and breeding programs.
کلیدواژه‌ها [English]
مقدمه
گیاهان منبع اصلی تولید دارو در سالهای دور بوده اند که در پی عوارض داروهای شمیایی دوباره در سال های اخیر مورد توجه قرار گرفته اند. داروهای گیاهی به ویژه هنگام مصرف طولانی و بیماریهای مزمن بسیار مناسبتر هستند (Omid Beygi, 2009). جنس آویشن، یکی از جنسهای خانواده نعنا و زیر خانواده نپتودا(Nepetoideae) است .اسانس آویشن، در ردیف 10 اسانس معروف دنیا است که جایگاه اقتصادی خاصی در تجارت جهانی دارد. در بین داروهای گیاهی تولید شده نیز گیاه آویشن در جهان بعد از نعنا، دارای رتبه دوم است (Omid Beygi, 2006). با توجه به درصد بالای اسانس در برخی از آویشنهای بومی ایران و نیز درصد بالای ترکیبات فنولی در آن‌ها (بویژه تیمول)، میتوان آن را به عنوان جایگزین مناسبی برای گونه رسمی اروپایی (T. vulgavis) جهت مقاصد مختلف، به‌ویژه کاربردهای دارویی در نظر گرفت (Nickavar et al., 2004).
در مورد تعداد گونههای آویشن از نظر تاکسونومی، گزارشهای متفاوتی وجود دارد. تعداد گونههای آن در بعضی از گزارشها به 800 گونه میرسد، اما با در نظر گرفتن کمترین مقدار تنوع مورفولوژیکی، 215 گونه از این جنس گزارش شده است (Morales, 2012). دلیل وجود تنوع بالا در بین گونههای آویشن، مقدار بالای دورگگیری بین گونهای در این جنس است (Jamzad, 2009). از میان گونههای آویشن، 18 گونه در ایران شناسایی شده است که از این تعداد، قبلاً 14 گونه و زیرگونه توسط پروفسور ریشینگر در فلور ایرانیکا گزارش شده است و چهار گونهT. persicus‚
T. carmanicus‚ T. daenensis‚ T. trautvetteri انحصاری کشورمان است.
اگرچه سابقه کشت و کار گیاهان دارویی به هزاران سال پیش باز میگردد، اما باید بیان داشت که در زمینه اصلاح این گیاهان ارزشمند، تاکنون اقدام قابل ملاحظهای صورت نگرفته است ) Bernath., 2002 Nemth., 2000;). در حال حاضر، تعداد ارقام اصلاح شده گیاهان دارویی اندک است. حدود 75-60 درصد از گیاهان دارویی که امروزه در کشت و صنعتها، کاشته و تولید می شوند، از طریق روشهای ساده انتخاب در بین جمعیتهای وحشی یا تودههای بومی به‌دست آمده‌اند. کارایی انتخاب، به وجود و شناخت دقیق تنوع ژنتیکی بستگی دارد) Bernath, 2002 Nemth, 2000;) در کشور ما، تحقیق روی اکثر گیاهان دارویی اندمیک یا بومی، تحت الشعاع گیاهان زراعی قرار گرفته است. بنابراین پیشرفت در زمینه اصلاح و بهره‌برداری از این گیاهان، نیازمند استفاده از تنوع ژنتیکی آن‌ها است (Rahim Malek et al., 2009). تنوع زنتیکی، اساس اصلاح نباتات و ماده خام ضروری برای آن است. یک بهنژادگر در صورتی میتواند امید به موفقیت زیادی در برنامه‌های بهنژادی خود داشته باشد که شانس انتخاب مواد مناسب برای او فراهم باشد. به‌همین دلیل، منابع خویشاوند وحشی گیاهی، یکی از مهم‌ترین، پرارزشترین و حیاتی‌ترین ذخایر و منابع طبیعی بشر محسوب می‌شوند (Vejdani, 1993).
مطالعات در سطح جمعیت نشان میدهد که نشانگرهای DNA، کارایی زیادی در تشخیص تنوع دارند و اطلاعات زیادی را فراهم میآورند. این نشانگرها، گروههای ژنتیکی و تشابه بین آن‌ها را مشخص میسازند و در تخمین تنوع درون گروهها و مطالعه روابط تکاملی آن‌ها با خویشاوندان وحشی نیز بسیار موثر هستند (Sharma et al., 1996). یکی از تکنیکهایی که اخیرا برای بررسی تنوع ژنتیکی، مورد استفاده گسترده پژوهشگران قرار گرفته است، تکنیک ISSR است. این تکنیک، ترکیبی از مزیتهای تکرارپذیری و دقت AFLP وSSR و فراگیری و عمومیت RAPD را دارا میباشد. در واقع این تکنیک، به‌دلیل داشتن آغازگرهایی با توالی ساده تکراری با طول 25-16 جفت باز، همراه با توالی لنگر در سمت 3’ و یا 5’ خود، تکرارپذیری بالایی دارد. به‌علاوه وجود این تعداد باز، سبب بالا بردن دمای اتصال (c60-45) میشود که این موضوع، خود سبب افزایش دقت کار[1] میشود. دو مورد از مزیتهای مهم این نشانگر این است که نیازی به اطلاعات قبلی از توالی ژنوم ندارد و هزینه این روش نسبت به روش هایی نظیر SSR و AFLP خیلی پائینتر و اجرای آن نیز راحتتر است (Aga et al., 2005). مطالعه بر روی قابلیت تکرارپذیری ISSR نشان داده است که تنها باندهای ضعیف، قابلیت تکرار را ندارند و حدود 95-92 درصد از قطعات، در ژنوم افراد مختلف یک گونه و همچنین در PCR های مختلف، قابل مشاهده و بررسی است (Fang, 1998).
در بررسی تنوع ژنتیکی و تمایز جغرافیایی 17 توده آویش دنایی با استفاده از 13 آغازگر ISSR، تعداد 356 باند تولید شد که تعداد 228 باند، چند شکل بودند. دندروگرام تولید شده از دادهها، تودههای بررسی شده را در دو گروه ژنتیکی متمایز قرار داد و انشعاب ژنتیکی آن‌ها، ارتباطی قوی با مناطق جغرافیایی و رویشگاهی آن‌ها نشان داد (Rahim Malek et al., 2009).
به‌منظور ارزیابی تنوع ژنتیکی درون و برون محیطی گیاه دارویی آویشن کرمانی، از نشانگرهای ملکولی ISSR استفاده شد که از مجموع 12 آغازگر به‌کار رفته، 127 باند با وضوح بالا تولید شد که از این تعداد، 22 باند، یک شکل و 105 باند دارای چند شکلی بودند (Bigdello, 2011).
در بررسی تنوع ژنتیکی 31 تک بوته T. caespititus جمع آوری شده از سه منطقه کوروا، فلوریس و گارسیوسا با استفاده از 11 آغازگر ISSR و 17 آغازگر RAPD، به‌ترتیب 127 و 199 باند چند شکل تولید شد. اطلاعات به‌دست آمده، گیاهان جمع‌آوری شده از مناطق کوروا و فلوریس را در گروه جداگانهای از گیاهان جمع آوری شده از منطقه گارسیوسا قرار داد (Trindade et al., 2009).
هدف از این پژوهش، بررسی تنوع ژنتیکی در بین و درون جمعیتهای گونههای مختلف آویشن بومی ایران و تعیین فاصله ژنتیکی موجود در بین جمعیتهای مختلف، برای شناسایی جمعیتهای دارای بیشترین فاصله از هم بود.
مواد و روشها
در این تحقیق، از 12 آغازگر ISSR جهت بررسی تنوع ژنتیکی در 23 جمعیت آویشن استفاده شد. بذرهای 22 جمعیت از چهار گونه آویشن بومی ایران از موسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور، شرکت پاکان بذر اصفهان و پژوهشکده گیاهان و مواد اولیه دارویی دانشگاه شهید بهشتی تهیه شد. همچنین در کنار این نمونهها، بذر نمونه آویشن ولگار
(T. vulgaris) نیز به عنوان شاهد، برای مقایسه با جمعیتهای بومی ایران، از شرکت پاکان بذر اصفهان تهیه شد (جدول 1).
جدول 1- مشخصات جمعیتهای آویشن مورد بررسی در این پژوهش.
Table 1. Characteristics of 23 thyme population used in this study.
|
Origin |
Species |
Population NO. |
Origin |
Species |
Population NO. |
|
Kordestan |
Deanensis |
12 |
Daran |
Deanensis |
1 |
|
Elam |
Deanensis |
13 |
Markazi. Baneh |
Deanensis |
2 |
|
Esfahan |
Vulgaris |
14 |
Lorestan- cheghelvandi |
Deanensis |
3 |
|
Oromeyeh |
Pubescence |
15 |
Markazi- Varcheh |
Deanensis |
4 |
|
Markazi |
Lancifolius |
16 |
Markazi- Shazand |
Deanensis |
5 |
|
Rodbar |
Kotschyanus |
17 |
freydoon shahr |
Deanensis |
6 |
|
Qazvin-Qaqazan |
Kotschyanus |
18 |
Lorestan- azgeneh |
Deanensis |
7 |
|
Qazvin |
Kotschyanus |
19 |
Esfahan-semirom |
Deanensis |
88 |
|
Saghez |
Pubescence |
20 |
Esfahan. Fereydan |
Deanensis |
9 |
|
Markazi- |
Lancifolius |
21 |
Lorestan |
Deanensis |
10 |
|
Azarbayjan. |
Pubescence |
22 |
Esfahan |
Deanensis |
11 |
|
Markazi- chepeghli |
Lancifolius |
23 |
|
|
|
بذرها در سینی نشا و در محیط کشت کوکوپیت و پرلیت، در گلخانههای گروه زراعت و اصلاح نباتات پردیس کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه تهران کاشته شدند. پس از جوانه زدن و رشد، گیاهچهها در مرحله چهار برگی از سینی نشا به گلدآن‌های سفالی منتقل شدند. پس از رشد مناسب گیاهچهها، از هر جمعیت، پنچ گیاه به‌صورت تصادفی انتخاب شدند و برای استخراج DNA، از برگ‌های سالم و جوان هر گیاه، نمونه‌برداری شد. برگ‌های جمع‌آوری شده پس از انجماد در ازت مایع، به فریزری با دمای منفی 80 منتقل شدند. استخراج DNA از گیاه آویشن با روش تغییر یافته CTAB (Murray & Thompson, 1989) و در چندین مرحله انجام شد. کمیت و کیفیت DNA استخراجی نیز با استفاده از نانودراپ و الکتروفورز ژل آگارز مورد بررسی قرار گرفت. در این پژوهش، از 12 آغازگر ISSR استفاده شد (جدول 2).
آغازگرهای به‌کار رفته در این پژوهش، آغازگرهایی بودند که در سایر مطالعات انجام گرفته بر روی گونههای مختلف آویشن و یا سایر گیاهان خانواده نعنا (Bigdelo et al., 2011; Rahim Malek et al., 2009; Trindade et al., 2009) بیشترین مقدار چند شکلی را نشان داده بودند. توالی آغازگرهای به کار رفته در جدول 2 آورده شده اند.
جدول 2- توالی آغازگرهایISSR مورد استفاده.
Table 2. ISSR primers used for analysis of Iranian thyme.
|
Name |
Sequence |
Annealing Temperature (C) |
|
P1 |
5'-CTCTCTCTCTCTCTCTG -3' |
53 |
|
P2 |
5'-AGAGAGAGAGAGAGAGST -3' |
51 |
|
P3 |
5′-AGAGAGAGAGAGAGAGT –3 |
53 |
|
P4 |
5′-CACACACACACACACAWT -3′ |
50 |
|
P5 |
5′- ACACACACACACACACG - 3′ |
50 |
|
P6 |
5′ - GAGAGAGAGAGAGAGAC - 3′ |
51 |
|
P7 |
5′-CACACACACACACACAG - 3′ |
51 |
|
P8 |
5′- TCGTCGTCGTCGTCGC -3′ |
50 |
|
P9 |
5′-TCTCTCTCTCTCTCTC -3′ |
48 |
|
P10 |
5′- ACACACACACACACACC -3′ |
51 |
|
P11 |
5′- AGAGAGAGAGAGAGAGC -3′ |
51 |
|
P12 |
5′- AGAGAGAGAGAGAGAG -3′ |
50 |
حجم واکنش زنجیرهای پلیمراز، 20 ماکرولیتر (بافرX 10،MgCl2: 4 mM ، dNTP: 0.25 mM، Primer : 0.5 pM ، 2 %: Formamide ، 30 ng/ DNA: ( در نظر گرفته شد و برنامه تکثیر به‌صورت Touch down انجام شد (شکل 1). الکتروفورز محصولات حاصل از واکنش زنجیرهای پلیمراز، با استفاده از ژل آگارز دو درصد و به مدت دو ساعت، با جریان 90 ولت صورت گرفت. رنگ آمیزی ژل، با استفاده از اتیدیوم بروماید صورت گرفت و در نهایت، عکس برداری از نمونهها با استفاده از دستگاه ژک داک انجام شد.
شکل 1- برنامه زمانی واکنش زنجیرهای پلیمراز برای آغازگرهای ISSR مورد استفاده.
Figure 1. Polymerase chain reaction timing applied for ISSR primers.
نمرهدهی باندها، به‌صورت یک برای وجود باند و صفر برای عدم وجود باند انجام شد. محتوای اطلاعات چند شکلی (PIC) بر اساس فرمول (Prasad et al., 2000) محاسبه شد. پارامترهای تعداد آللهای مشاهده شده(Na)، تعداد آللهای موثر (Ne (، میزان جریان ژنی (Nm)، مقادیر فاصله ژنتیکی (D)، شباهت ژنتیکی (I)، ماتریس تشابه و تجزیه واریانس ملکولی (AMOVA) با استفاده از نرم افزار GenAlEx v. 6. 1(Peakall & Smouse, 2006) مورد محاسبه و بررسی قرار گرفت. ضریب تمایز ژنی بین جمعیتها (GST) با استفاده از نرم افزار Popgen محاسبه شد و برای رسم دندروگرام بر اساس روش UPGMA و بر اساس ماتریس تشابه، از نرم افزار NTSYS استفاده شد. در این مطالعه، جهت تفکیک و گروه‌بندی نمودار خوشه‌ای، مکان خط برش با استفاده از روش جذرگیری بر روی محور فاصله مشخص شد.
نتایج و بحث
از بین 12 آغازگر به‌کار رفته در این پژوهش، 10 آغازگر، پلی‌مورفیسم نشان دادند و دو آغازگر P8 وP10 باند مناسبی جهت ارزیابی و بررسی جمعیتهای مورد مطالعه نشان ندادند. در مجموع، 57 آلل شناسایی شد که در این بین، آغازگرهای P2، P4 و P5با چهار آلل، دارای کمترین تعداد آلل و آغازگر P6 با هشت آلل، دارای بیشترین تعداد آلل در بین آغازگرهای مورد بررسی بودند. میانگین تعداد آلل در کل جایگاه‌ها، 7/5 بود (جدول 3). از آن‌جا که تعداد آلل هر نشانگر ریزماهواره، یکی از شاخصهایی است که مناسب بودن هر مکان ژنی را برای تخمین تنوع ژنتیکی نشان میدهد (Roder et al.,1998)، بنابراین آغازگرهایی که تعداد آلل زیادی نشان دادهاند، برای بررسی تنوع ژنتیکی مناسب تشخیص داده می‌شوند. با بررسی آلل‌ها مشاهده شد که برخی از آغازگرها در بعضی از ژنوتیپ‌ها، هیچ باندی را تکثیر نکردند. با توجه به سالم بودن DNA و چند بار تکرار آزمایش، به‌نظر میرسد که وقوع جهش در یک یا دو طرف ناحیه تکرار شونده، مانع چسبیدن آغازگرها و تکثیر ناحیه بین دو آغازگر شده است.
بیشترین درصد چند شکلی با متوسط 43/70 درصد، به آغازگر P9( شکل 2)و کمترین درصد چندشکلی با متوسط 13/39 درصد، به آغازگر تعلق داشت. متوسط درصد چند شکلی در بین تمامی آغازگرهای مورد استفاده، 2/52 درصد بود (جدول 3).
در تحقیقی که بر روی 25 نمونه آرتیمیزیای مربوط به پنچ منطقه با استفاده از 10 آغازگر ISSR صورت گرفت، 78 باند به‌دست آمد که از این تعداد، 54 باند چند شکل بودند؛ در این مطالعه، درصد چند شکلی 67/66 درصد بود (Shafai et al., 2011).
محتوای اطلاعات چندشکلی (PIC) محاسبه شده برای 10 آغازگر مورد استفاده با متوسط 68/0 از 55/0 برای آغاگر 12P تا 92/0 برای آغازگر 9P متغیر بود. میزان اطلاعات چند شکلی، یکی از شاخص‌های مهم جهت مقایسه نشانگرهای مختلف از لحاظ قدرت تمایز آن‌ها میباشد. مقادیر بالای این معیار، نشان دهنده چند شکلی بالا و وجود آلل یا آللهای نادر در یک جایگاه نشانگری است که در تفکیک و تمایز افراد، نقش بسزایی دارد (Agrama & Tuinstra, 2003). بنابراین آغازگر P9 با بیشترین مقدار PIC، بهتر از سایر نشانگرهای به‌کار رفته توانست فاصله ژنتیکی نمونهها را مشخص کند.
میانگین تعداد آللهای مشاهده شده، 12/1 بود که بیشترین آن با متوسط 46/1 به آغازگرهای P5 و 9 Pوکمترین آن با متوسط 01/1 به آغازگر P1 تعلق داشت. تعداد آللهای موثر نیز با متوسط 34/1 از دامنه 48/1 برای آغازگر P5تا 29/1 برای آغازگر 4P متغیر بود. شاخص اطلاعاتی شانون (I) با متوسط 29/0، از 21/0 برای آغازگر P7 تا 37/0 برای آغازگر P9متغیر بود. ضریب شانون نیز همانند محتوای اطلاعات چندشکلی، میزان چند شکلی آغازگر را نشان میدهد (جدول 3).
به‌منظور بررسی روابط بین جمعیتها، شاخص‌های بین جمعیتی برای تک تک آغازگرها به‌طور جداگانه بررسی شد (جدول 3). اولین شاخص، تنوع ژنتیکی کل (HT) بود که با میانگین 3/0، از 2/0 برای آغازگر P12 تا 458/0 برای آغازگر P5 متغیر بود. از نظر شاخص تنوع ژنتیکی داخل جمعیتی (Hs) نیز آغازگر P12با متوسط 16/0 کمترین و آغازگرهای P5 و P9 با متوسط 25/0 بیشترین مقدار را نشان دادند. با توجه به نتایج، بین شاخص‌های شانون، تنوع ژنتیکی کل، تنوع ژنتیکی داخل جمعیتی و تعداد آللهای مشاهده شده و موثر، رابطه مستقمی وجود داشت (جدول 3).
شکل 2- الگوی باندی حاصل از تکثیر DNA ژنومی جمعیتهای مختلف آویشن توسط آغازگر 9P بر روی ژل آگارز دو درصد.
Figure 2. The bands produced by ISSR primer P9 in some thymus population of on 2% agarose gel.
ضریب تمایز ژنی بین جمعیت (GST) به‌طور متوسط برابر با 341/0 محاسبه شد که آغازگرهای P2 و P12 به‌ترتیب با 489/0 و 204/0، بیشترین و کمترین مقدار این شاخص را نشان دادند. آماره GST نسبت تنوع بین جمعیتی به تنوع کل را نشان میدهد. بر اساس نتایج،1/34 درصد از تنوع مشاهده شده در کل جمعیتها، تنوع بین جمعیتها بود و 9/66 درصد تنوع کل، به تنوع دورن جمعیتها تعلق داشت. مقدار جریان ژنی (Nm) برای تمامی آغازگرها برابر با 963/0 محاسبه شد که این مقدار، متأثر از ضریب تمایز ژنی بین جمعیتها بود و همبستگی منفی با آن داشت. در میان آغازگرهای مورد بررسی نیز بیشترین جریان ژنی در میان جمعیتها، برای آغازگر P6 و کمترین آن برای آغازگر P2مشاهده شد. تشابه ژنتیکی بالا میتواند ناشی از ادغام و همپوشانی زیاد جمعیتها باشد که از جریان ژنی بین جمعیتها حاصل شده است.
جدول 3- ویژگیهای نشانگرهای حاصل از ده آغازگر ISSR مورد بررسی در ژنوتیپهای آویشن.
Table 3- ISSR primer characteristics in thyme species accessions.
|
Primer |
N |
Na±SE |
Ne±SE |
I±SE |
HT |
Hs |
Gst |
Nm |
Pol% |
PIC |
|
P1 |
7 |
1.01±0.07 |
1.32±0.031 |
0.27±0.024 |
0.283±0.006 |
0.184±0.006 |
0.325 |
1.17 |
54.4 |
0.68 |
|
P2 |
4 |
1.03±0.093 |
1.32±0.044 |
0.25±0.033 |
0.31±0.045 |
0.177±0.041 |
0.489 |
0.64 |
41.3 |
0.57 |
|
P3 |
5 |
1.11±0.089 |
1.33±0.038 |
0.27±0.028 |
0.29±0.021 |
0.188±0.005 |
0.315 |
1.24 |
51.3 |
0.64 |
|
P4 |
4 |
1.09±0.086 |
1.29±0.042 |
0.23±0.031 |
0.297±0.005 |
0.160±0.003 |
0.431 |
0.913 |
39.1 |
0.58 |
|
P5 |
4 |
1.46±0.072 |
1.48±0.04 |
0.36±0.033 |
0.458±0.012 |
0.250±0.001 |
0.429 |
0.937 |
57.6 |
|
|
P6 |
88 |
1.14±0.073 |
1.33±0.027 |
0.29±0.021 |
0.256±0.024 |
0 196±0.011 |
0.234 |
1.77 |
56.5 |
0.70 |
|
P7 |
6 |
1.03±0.083 |
1.33±0.034 |
0.28±0.026 |
0.296±0.030 |
0.191±0.012 |
0.340 |
1.29 |
48.5 |
0.71 |
|
P9 |
5 |
1.46±0.080 |
1.42±0.035 |
0.37±0.018 |
0.36±.003 |
0.250±0.002 |
0.310 |
1.28 |
70.4 |
0.92 |
|
P11 |
7 |
1.11±0.077 |
1.38±0.032 |
0.31±0.017 |
0.31±0.026 |
0.213±0.014 |
0.323 |
1.11 |
50.5 |
0.77 |
|
P12 |
7 |
0.98±0.079 |
1.28±0.028 |
0.25±0.015 |
0.206±0.005 |
0.168±0.004 |
0.204 |
1.29 |
49 |
0.55 |
|
Means |
5/7 |
1.14±0.080 |
1.34±0.035 |
0.28±0.024 |
0.306±0.026 |
0.197±0.005 |
0.34 |
1.16 |
52.2 |
0.68 |
N: تعداد باند، Na: تعداد آلل مشاهده شده، Ne: تعداد آلل موثر، I: شاخص اطلاعاتی شانون، HT: تنوع ژنتیکی کل، Hs: تنوع ژنتیکی داخل جمعیتی، Gst: ضریب تمایز ژنی و Nm: جریان ژنی.
N: Number of bands, Na: Number of observed alleles, Ne: Number of effective alleles, I: Shannon information index, HT: Total genetic diversity, Hs: Intra- population genetic diversity, Gst: Genetic differentiation coefficient and Nm: Gene flow.
به منظور بررسی تنوع ژنتیکی درون جمعیتها، میانگین شاخص‌های درون جمعیتی شامل آللهای مشاهده شده (Na)، تعداد آللهای موثر (Ne)، تنوع ژنی نی (H) و شاخص شانون (I) برای جمعیتهای مورد بررسی محاسبه شد (جدول 4). از نظر تعداد آللهای مشاهده شده، جمعیت یک با متوسط 77/1/بیشترین مقدار را نشان داد. میانگین تعداد آللهای موثر در کل جمعیتهای مورد بررسی، 34/1 بود و بیشترین تعداد آلل موثر در جمعیت شماره 14با میانگین 74/1 مشاهده شد.
از نظر تنوع ژنی نی (H) و شانون (I) نیز جمعیت یک به ترتیب با متوسط 29/0 و43/0 بیشترین مقدار را داشت و جمعیت 14 با مقادیر 1/0 و 172/0 کمترین مقدار این دو شاخص تنوع ژنتیکی را به خود اختصاص داد. از نظر تعداد باندهای چندشکل نیز جمعیتهای یک و دو به‌ترتیب با 18/70 و 67/66، بیشترین درصد و جمعیت 14 با 09/35، کمترین مقدار پلی‌مورفیسم را به خود اختصاص دادند.
جدول 4- شاخص‌های تنوع ژنتیکی در جمعیتهای آویشن مورد بررسی.
Table 4. Genetic diversity indices in thyme populations.
|
Poly. % |
No. Poly. bond |
H |
I |
Ne |
Na |
Pop |
|
77.18 |
44 |
0.29±0.19 |
0.43±0.126 |
1.51±0.37 |
1.77±0.42 |
1 |
|
66.67 |
38 |
0.22±0.19 |
0.34±0.27 |
1.38±0.36 |
1.66±0.47 |
2 |
|
63.16 |
33 |
0.20±0.18 |
0.30±0.26 |
1.33±0.35 |
1.63±0.49 |
3 |
|
61.40 |
35 |
0.22±0.19 |
0.33±0.28 |
1.37±0.37 |
1.61±0.43 |
4 |
|
61.40 |
29 |
0.23±0.20 |
0.34±0.29 |
1.40±0.39 |
1.61±0.50 |
5 |
|
50.88 |
35 |
0.21±0.22 |
0.30±0.31 |
1.39±0.43 |
1.50±0.49 |
6 |
|
61.40 |
25 |
0.25±0.21 |
0.37±0.30 |
1.46±0.41 |
1.61±0.50 |
7 |
|
43.86 |
31 |
0.13±0.17 |
0.20±0.25 |
1.21±0.31 |
1.43±0.52 |
8 |
|
54.39 |
31 |
0.21±0.21 |
0.31±0.30 |
1.38±0.42 |
1.54±0.50 |
9 |
|
47.3 |
27 |
0.19±0.22 |
0.27±0.31 |
1.35±0.42 |
1.47±0.50 |
10 |
|
49.12 |
28 |
0.19±0.21 |
0.28±0.30 |
1.35±0.41 |
1.49±0.50 |
11 |
|
52.93 |
30 |
0.18±0.20 |
0.28±0.28 |
1.32±0.38 |
1.52±0.50 |
12 |
|
38.60 |
22 |
0.15±0.21 |
0.22±0.29 |
1.27±0.39 |
1.38±0.49 |
13 |
|
35.09 |
20 |
0.106±0.166 |
0.165±0.24 |
1.47±0.30 |
1.35±0.48 |
14 |
|
47.3 |
27 |
0.20±0.22 |
0.29±0.31 |
1.39±0.42 |
1.47±0.50 |
15 |
|
49.11 |
24 |
0.17±0.21 |
0.25±0.30 |
1.32±0.41 |
1.42±0.50 |
16 |
|
50.88 |
29 |
0.14±0.15 |
0.23±0.24 |
1.21±0.25 |
1.50±0.50 |
17 |
|
43.86 |
25 |
0.16±0.20 |
0.24±0.29 |
1.29±0.39 |
1.43±0.48 |
18 |
|
63.16 |
36 |
0.27±0.22 |
0.39±0.31 |
1.51±0.44 |
1.63±0.50 |
19 |
|
54.39 |
31 |
0.19±0.20 |
0.28±0.28 |
1.33±0.38 |
1.54±0.48 |
20 |
|
35.09 |
20 |
0.13±0.19 |
0.20±0.28 |
1.24±0.36 |
1.35±0.52 |
21 |
|
45.61 |
26 |
0.20±0.23 |
0.29±0.32 |
1.38±0.44 |
1.45±0.50 |
22 |
|
49.12 |
28 |
0.21±0.22 |
0.30±0.31 |
1.38±0.42 |
1.49±0.50 |
23 |
اعضای جمعیت 14، مربوط به گونه اصلاح شده ولگار هستند و همان‌گونه که انتظار میرفت، درصد پلی‌مورفیسم زیادی در آن مشاهده نشد. بر اساس نظر شرکت پاکان بذر، بذرهای تهیه شده از این جمعیت، مربوط به نسل F2 بودند و با در نظر گرفتن درصد بالای دگرگشنی در این گیاه، میتوان پلی مورفیسم موجود در این جمعیت را توجیه کرد. بهطورکلی، در بین جمعیتهای مورد بررسی، تنوع زیادی وجود داشت، اما تنوع درون جمعیتی بیشتر بود که این موضوع سبب ممانعت از بروز کامل تنوع بین جمعیتی شد.
تجزیه واریانس مولکولی نشان داد که واریانس درون جمعیتها نسبت به واریانس بین جمعیتی بیشتر بود، به‌طوری‌که گیاهان درون جمعیتها تنوع بالایی داشتند و جمعیتها ناهمگن بودند. واریانس بین و درون جمعیتها جمعیتها، به‌ترتیب 27 و 73 درصد بود (جدول 5). بهطورکلی در مورد جمعیتهای وحشی، فاصله جغرافیایی و جریان ژنی بین جمعیتها تعیین کننده فاصله ژنتیکی میباشد. در گونههای دگرگشن، به‌علت جریان ژنی بالا، فاصله ژنتیکی جمعیتها کم و در عوض تنوع ژنتیکی در درون جمعیتها پراکنده است. در مورد این گونهها، در صورتی‌که جریان ژنی بین رویشگاهها، تحت تاثیر عوامل غیرطبیعی چون تخریب رویشگاهها در اثر چرای بیرویه، چرای مفرط و سایر عوامل قطع شود، فاصله ژنتیکی جمعیتهای منقطع افزایش مییابد و به علت افزایش هموژنی و افتراق بین جمعیتها، فرسایش ژنتیکی رخ خواهد داد (Hamrick & Godt, 1989). در مطالعه بر روی 70 ژنوتیپ از هفت جمعیت آویشن کرمانی با استفاده از 12 آغازگر ISSR گزارش شد که تنوع ژنتیکی درون جمعیتی، حدود 67 درصد و تنوع بین جمعیتی، حدود 33 بود (Bigdello et al., 2011).
جدول 5- تجزیه واریانس مولکولی AMOVA)) تنوع بین و درون جمعیتهای آویشن.
Table 5. Analysis of molecular variance between and within the populations of thyme.
|
PhiPT Prob |
PhiPT Value |
%poly. |
Estimated variance |
MS |
df |
S.O.V |
|
0.010 |
0.270 |
27 |
2.71 |
20.88 |
22 |
Between group |
|
|
|
73 |
7.32 |
7.32 |
92 |
Within group |
|
|
|
100 |
10.034 |
|
114 |
Total |
مقدار ارزش phipT(27/0)، نشان دهنده تمایز بین جمعیتها است که با توجه به این‌که جمعیت 14 آویشن ولگار، نسل 2F بوده است و بذر جمعیت شماره هشت هم از دانشگاه شهید بهشتی فراهم شده بود که چند نسل انتخاب بر روی آن صورت گرفته بود، میتوان گفت که این دو جمعیت تا حدودی تثبیت شدهاند. در واقع نشان دهنده این است که این جمعیتها تنوع خود را از دست دادهاند و به یکنواختی رسیدهاند. علاوه بر این، بذر سایر جمعیتها که از مرکز تحقیقات جنگلها و مراتع کشور تهیه شده بود نیز ممکن است متعلق به یک بوته و یا چند بوته مجاور هم بوده است که این موضوع هم میتواند در متمایز شدن جمعیتها نقش داشته باشد (جدول 5).
به‌منظور بررسی تنوع ژنتیکی درون هر گونه، جمعیتهای مختلف مربوط به هر گونه به عنوان یک جمعیت در نظر گرفته شدند و میانگین شاخص‌های درون جمعیتی شامل آللهای مشاهده شده (Na)، تعداد آللهای موثر (Ne)، تنوع ژنی نی (H) و شاخص شانون (I) برای جمعیتهای مورد بررسی محاسبه شد (جدول 6). از نظر تعداد آللهای مشاهده شده، گونه دنایی با متوسط 96/1 بیشترین و گونه ولگار با متوسط 71/0 کمترین مقدار را نشان داد. میانگین تعداد آللهای موثر در کل جمعیتهای مورد بررسی، برابر با 38/1 بود و بیشترین تعداد آلل موثر در گونههای دنایی و T. Lancifolius با میانگین 45/1 مشاهده شد. از نظر تنوع ژنی نی (H) و شانون (I) نیز گونه دنایی به ترتیب با متوسط 28/0 و 44/0 بیشترین مقدار را داشتند و گونه ولگار با مقادیر 112/0 و 172/0 کمترین مقدار این دو شاخص تنوع ژنتیکی را به خود اختصاص دادند. از نظر تعداد باندهای چندشکل نیز گونههای دنایی و T. lancifolius به‌ترتیب با درصد پلی‌مورفیسم 25/98 و 44/75 بیشترین و گونه ولگار با درصد پلی‌مورفیسم 09/35، کمترین مقدار را از لحاظ این صفت به خود اختصاص دادند (جدول 6).
جدول 6- شاخص‌های تنوع ژنتیکی در گونههای آویشن مورد بررسی.
|
Pol% |
UHe |
He |
I |
Ne |
Na |
Species |
|
98.25 |
0.28 |
0.28 |
0.44 |
1.45 |
1.96 |
T. deanensis |
|
35.09 |
0.12 |
0.11 |
0.17 |
1.18 |
0.71 |
T. vulgaris |
|
71.93 |
0.26 |
0.25 |
0.37 |
1.44 |
1.49 |
T. pubescence |
|
64.91 |
0.23 |
0.22 |
0.34 |
1.38 |
1.29 |
T. kotschyanus |
|
75.44 |
0.27 |
0.26 |
0.39 |
1.45 |
1.50 |
T. lancifolius |
Table 6. Genetic diversity indices in thyme species.
N: تعداد باند، Na: تعداد آلل مشاهده شده، Ne: تعداد آلل موثر، I: شاخص اطلاعاتی شانون، HT: تنوع ژنتیکی کل، Hs: تنوع ژنتیکی داخل جمعیتی، Gst: ضریب تمایز ژنی و Nm: جریان ژنی.
N: Number of bands, Na: Number of observed alleles, Ne: Number of effective alleles, I: Shannon information index, HT: Total genetic diversity, Hs: Intra- population genetic diversity, Gst: Genetic differentiation coefficient and Nm: Gene flow.
تجزیه واریانس دادههای ملکولی مربوط به گونهها نشان داد که در بین گونهها، تفاوت چندانی وجود نداشت و بیشتر تفاوت در درون گونهها بود، به‌گونهای که واریانس درون و بین گونه، به‌ترتیب 90 و 10 درصد بود (جدول 7).
جدول 7 - تجزیه واریانس مولکولی (AMOVA) برای تنوع بین و درون گونههای مختلف آویشن.
Table 7. Analysis of molecular variance between and within the species of thyme.
|
PhiPT Prob |
PhiPT Value |
%poly |
Estimated variance |
MS |
df |
S.O.V |
|
0.010 |
0.102 |
10 |
1.04 |
28.20 |
4 |
Between group |
|
|
|
90 |
9.27 |
9.27 |
110 |
Within group |
|
|
|
100 |
10.32 |
|
114 |
Total |
نتایج حاصل از تجزیه کلاستر، جمعیتهای مورد بررسی را به دو کلاستر اصلی تقسیم بندی نمود که کلاستر اول به دو زیرمجموعه و کلاستر دوم به سه زیرمجموعه تقسیم شد. کلاستر اول بیشتر شامل جمعیتهای متعلق به گونههای دنایی و برخی از جمعیتهای مربوط بهT. lancifolius بود. از آن‌جا که گفته میشود این گونه از زیرگونههای آویشن دنایی است، این نکته قابل توجیه میباشد. زیر مجموعههای یک و دو گروه دوم را هم بیشتر جمعیتهای متعلق به آویشن دنایی تشکیل دادهند. زیر مجموعه سوم از گروه دوم را نیز بیشترجمعیتهای متعلق به گونههای T. kotschyanus و T. pubescence تشکیل دادند (شکل 3) .
نتایج تجزیه کلاستر حاصل با پراکندگی جغرافیایی جمعیتها نیز همخوانی دارد؛ مثلاً جمعیتهای شش (نمونههای 26، 27، 28، 29 و30) و هشت (36، 37، 38، 39 و 40)که هر دو متعلق به استان اصفهان هستند، در فاصله نزدیکی نسبت به هم قرار گرفتند. همچنین جمعیتهای مربوط به اصفهان و ارومیه (هشت و 15) که از لحاظ جغرافیایی در حدود 1074 کلیومتر با یکدیگر فاصله دارند، از لحاظ ژنتیکی هم در فاصله نسبتاً زیادی از یکدیگر قرار گرفتند که این خود نشان دهنده مناسب بودن نشانگر ملکولی ISSR در تفکیک جمعیتهای مورد بررسی است. بهطورکلی، برخی از ژنوتیپ‌ها به‌طور کامل به گروههای مشخص مطابق با جمعیتهای مختلف تقسیم نشدند و این ژنوتیپ‌ها به‌طور مساوی در طول دندروگرام توزیع شدند که توزیع ژنوتیپ‌ها به این صورت، وجود تنوع ژنتیکی زیاد درون تودهای را تایید کرد (شکل 3).
به‌منظور تعیین ارتباط و فاصله بین گونهها، تجزیه کلاستر مربوط به گونهها نیز انجام (شکل 4) و مشاهده شد که گونههای مورد بررسی، در دو کلاس کلی قرار گرفتند، به‌شکلی که گونه دو که گونه ولگار بود، در یک کلاستر و گونههای آویشن بومی ایران در یک کلاستر دیگر قرار گرفتند. با توجه به این‌که منشا این گونه کشور آلمان و دارای ماهیت ژنتیکی متفاوتی با آویشنهای بومی ایران میباشد، این امر میتواند گواهی بر مناسب بودن نشانگرISSR در تفکیک گونههای مورد بررسی باشد. در بین گونههای بومی ایران نیز گونه سه که آویشن T. pubescence است، به‌طور کامل از سایر گونهها جدا شد و در یک زیر کلاستر جداگانه قرار گرفت که شاید بتوان عامل جغرافیایی را دلیل مهم این تمایز دانست، به‌طوری که اکثر جمعیتهای مربوط به سایر گونهها، متعلق به استان های مرکزی و غربی کشور مثل استآن‌های اصفهان، مرکزی و خرم آباد و... هستند، درحالی‌که جمعیتهای مربوط به گونه T. pubescence متعلق به مناطق ارومیه، سقز و آذربایجان شرقی هستند که این بعد مسافت، سبب رانش ژنتیکی جمعیتهای مربوط به این گونه و در نهایت متمایز شدن این گونه نسبت به سایر گونهها شده است (شکل3).
نتیجه گیری کلی
بهطورکلی نتایج مربوط به تجزیه دادههای ملکولی نشان داد که بیشترین مقدار PIC مربوط به آغازگر 9P با 92/0 بود. میانگین PIC در کل آغازگرهای مورد بررسی، 68/0 بود که نشان دهنده کارایی مناسب آغازگرهای به‌کار برده شده است. علاوه بر این، بیشترین مقدار پلی‌مورفیسم در جمعیتهای یک و دو، با درصد پلی‌مورفیسم 18/77 و 67/66 درصد مشاهده شد. بر اساس نتایج تجزیه واریانس ملکولی، درصد واریانس ملکولی بین جمعیتها برابر با 27 درصد و واریانس ملکولی درون جمعیتی 73 درصد بود که نشان دهنده تنوع بسیار بالا در درون جمعیتهای مختلف مورد بررسی است. در بین گونههای مورد بررسی نیز گونه دنایی و T. lancifolius با 25/98 و 44/75 بیشترین درصد پلی‌مورفیسم و گونه ولگار با درصد 09/35 کمترین درصد پلی‌مورفیسم را داشتند و تنوع درون و بین گونهها، به‌ترتیب 90 و 10 درصد بود.
شکل 3- دندروگرام حاصل از تجزیه کلاستر ژنوتیپهای آویشن، بر اساس الگوریتم UPGMA با روش جاکارد.
Figure 3. UPGMA dendrogram based on Jaccard‘s similarity coefficient among thyme genotypes.
شکل 4- دندروگرام حاصل از تجزیه کلاستر گونههای مختلف آویشن، بر اساس الگوریتم UPGMA با روش جاکارد.
Figure 4. UPGMA dendrogram based on Jaccard‘s similarity coefficient among thyme species.
REFERENCES
REFERENCES
)
