تجزیه ارتباطی صفات زراعی آفتابگردان روغنی (Helianthus annuus L.) با نشانگرهایREMAP و IRAP تحت شرایط نرمال و تنش کمبود فسفر

مقدمه

آفتابگردان (Helianthus annuus L.) از گیاهان مهم زراعی است که عمدتاً به خاطر روغن خوراکی کشت می­شود. دانه­های روغنی بعد از غلات، دومین منبع مهم تأمین انرژی مورد نیاز جوامع انسانی به شمار می­روند و از دیرباز کشت این دسته از گیاهان در بسیاری از کشورهای جهان رواج دارد. سطح زیر کشت آفتابگردان روغنی در جهان در سال 2018 برابر با 26668101 هکتار و میزان تولید 51954777 تن برآورد شده است (FAO, 2018).

در سطح جهان، تولیدِ بیشتر در اغلب محصولات زراعی، به شدت به استفاده از کودهای تجاری وابسته است؛ موردی که باعث افزایش هزینه برای تولید کنندگان می­شود. این امر در مورد کود فسفر بیشتر واقعیت دارد، زیرا این عنصر به دلیل تثبیت زیاد در خاک و سرعت انتشار آهسته، سخت­ترین عنصرِ درشت­مغذیِ قابلِ اخذ توسط گیاهان هست (Gong et al., 2016). معمولاً در بیشتر زراعت­ها در ابتدای فصل و قبل از کشتِ محصول، کود فسفر به زمین اضافه می­شود، اما کمتر از 20 درصد فسفر در سالِ کاربرد مصرف می­شود و بقیه در مخازن کم- فسفر موجود در خاک[1] وارد می­شود و یا در بعضی موارد، جابجایی از محل و مشارکت در آلودگی موادِ مغذیِ سیستم­های ساحلی [2](واسط بین اکوسیستم­های زمینی و آبی) رخ می­دهد (McLaughlin et al., 1988). جستجوی فرصت­هایی برای بهبود راندمان مصرف کود برای به حداکثر رساندن تولید دانه با مصرف کمتر کود، یک چالش جهانی است که به احتمال زیاد به "انقلاب دوم سبز" منجر خواهد شد (Yan et al., 2006). جدا از نیاز به راهکارهای مدیریتی بلند مدت برای رفع این مشکل، اصلاح محصولات زراعی با بهره­وریِ بالا و قادر به پاسخگویی بهتر به فسفر و یا استفاده از فسفرِ بومیِ خاک، یک چشم­انداز جذاب است؛ بنابراین بهبود راندمانِ مصرفِ فسفر از طریق تولید و توسعه محصولات زراعی و مرتعی، مدتی است که مورد علاقه اصلی به­نژادگران و متخصصان ژنتیک قرار گرفته است، اما تا به امروز با موفقیت محدودی همراه بوده است (Gourley et al., 1994; Bovill et al., 2013).

اساس و پایه­ برنامه­های به­نژادی از جمله انتخاب به کمک نشانگر^[3]، آگاهی از نواحی ژنومیِ کنترل کننده­ صفات مورد نظر است. در سال­های اخیر، روش­های ژنتیک مولکولی با استفاده از چندشکلی DNA، به‌طور فزاینده­ای برای تعیین مشخصه و شناسایی ژن‌هایِ مسئولِ تغییرات ژنتیکی صفات مهم زراعی در برنامه­های اصلاحی گیاهان استفاده شده‏اند. نشانگرهای مبتنی بر رتروترنسپوزون­ها، یکی از نشانگرهای مولکولی مهم در این زمینه هستند. یکی از نشانگرهای این خانواده،  IRAP[4]است که توسط Kalendar et al. (1996) معرفی شد. نشانگرهای IRAP، چندشکلی مبتنی بر الحاق رتروترنسپوزون­ها را با تکثیر ناحیه­ بین دو عنصر رتروترنسپوزونی آشکار می­سازند. در این روش، طراحی آغازگرها بر اساس توالی انتهایی رتروترنسپوزون­ها (LTR[5]ها) صورت می­گیرد و جهت تکثیر قطعات بین دو رتروترنسپوزون به‌کار برده می­شوند (Shimamura  et al., 1997). این نشانگرها به دلیل طولانی بودن توالی آغازگرها و تکرار­پذیریِ بالا، شبیه نشانگرهای ریزماهواره­ هستند (Kalendar et al., 1999). نشانگر دیگر این خانواده، REMAP[6] است که آن هم توسط Kalendar et al. (1996) معرفی شد. این نشانگر، شبیه نشانگرهای IRAP است، ولی یکی از دو آغازگر مورد استفاده، مطابق یکی از موتیف­های SSR با یک یا چند باز لنگر غیرریزماهواره­ای در انتهای '3 آن طراحی می­شود. در تحقیقی، بررسی تنوع ژنتیکی 23 ژنوتیپ از گونه­های مختلف جنس Vitis ، با  نشانگرهایS-SAP ، IRAP و REMAP  مبتنی بر رتروترنسپوزون­ها و نشانگرهای SSR، ISSR و AFLP انجام گرفت. نتایج نشان داد نشانگرهای رتروترنسپوزونی REMAP روابط ژنتیکی بین نمونه­های مورد مطالعه را بهتر از نشانگرهای دیگر نمایان می­سازد (D'Onofrio et al., 2010).

در دهه­های گذشته، تحقیقات بسیاری برای شناسایی ژن‌هایِ مسئولِ تغییرات ژنتیکی صفات مهم زراعی با استفاده از نقشه‌های پیوستگی در نسل­های در حال تفرق صورت گرفته است. با توجه به وجود تنوع ژنتیکی طبیعی وسیع برای صفات کمّی در ژرم‏پلاسم و مجموعه‌های گیاهی، در سال­های اخیر تجزیه ارتباط[7]، جایگاه خود را در ژنومیک گیاهی همانند ژنتیک انسانی برای شناساییِ نشانگرهایِ پیوسته با عوامل ژنتیکیِ کنترل کننده­ صفات پیدا کرده است (Alipour & Darvishzadeh, 2019). در این روش، مجموعه بزرگی از افراد یک جمعیّت به‌طور تصادفی جمع­آوری می­شوند و تجزیه بر اساس عدم تعادل پیوستگی^[8]  انجام می‏گیرد.

مطالعات قبلی نشان داده است که تحمل گیاهان به مقدار کمِ فسفر، توسط چندین ژن تنظیم می­شود (Su et al., 2006; Oono et al., 2013). تحمل به کمبودِ فسفر و تجزیه و تحلیل QTL صفاتِ مرتبط در برنج (Wissuwa et al., 1998)، ذرت (Zhu et al., 2005)، کلزا (Yang et al., 2011)، لوبیا (Liao et al., 2004) و سویا (Li et al., 2005) انجام گرفته است. Yang et al (2011) با استفاده از رگه­های خویش­آمیخته­ نوترکیب ([9]RILs) در کلزا  طی یک مطالعه تجزیه QTL، شش صفت فنوتیپی را در مرحله رویشی، تحت شرایط نرمال و تنش کمبود فسفر ارزیابی کردند. در کل برای صفات مورد مطالعه، 72 QTL روی 13 گروه پیوستگی شناسایی کردند که از این بین، 28 QTL برای صفات در شرایط کمبود فسفر، 22 QTL  در شرایط نرمال و 21 QTL برای صفاتی بود که به‌صورت نسبی با در نظر گرفتن دو شرایط محاسبه شده بودند. با ارزیابی یک جمعیت RILs در برنج تحت شرایط کمبودِ فسفر، ژنِ مرتبط با تحمل به کمبود فسفر به نام PSTOL1 شناسایی شد (Wissuwa et al., 1998). تجزیه بیان ژن مذکور تحت شرایط کمیِ فسفر خاک نشان داد که این ژن به‌طور معنی­دار باعث افزایش عملکرد دانه می­شود. مطالعات تکمیلی نشان داد که ژن مذکور به‌طور معنی­داری باعث افزایش طول ریشچه می­شود و بدین ترتیب توانایی جذب فسفر را بهبود می­بخشد (Gamuyao et al., 2012).

علی­رغم اهمیّت آفتابگردان روغنی در ایران، تحقیقات زیادی در زمینه شناسایی نشانگرهای مولکولی و مکان‌های ژنی صفات مهم مرتبط با دانه در شرایط تنش کمبود فسفر در این گیاه، صورت نگرفته است؛ هر چند در زمینه مکان‌یابی ژنتیکی برخی صفات مهم زراعی در شرایط تنش خشکی (Soleimani et al., 2018)، شوری (Ahmadpour et al., 2018) و مقاومت به بیماری‌ها (Najafzadeh et al., 2018) تحقیقاتی انجام گرفته است. هدف از مطالعه حاضر، شناسایی نشانگرهای مرتبط با صفات زراعی در آفتابگردان روغنی با استفاده از نشانگرهای مبتنی بر رتروترنسپوزون IRAP و REMAP در شرایط فراهمی (نرمال) و تنش کمبود فسفر است.

مواد و روش­ها

در این پژوهش، فنوتیپ 100 لاین خالص آفتابگردان روغنی در دو شریط فراهمی (بهینه یا نرمال) و کمبودِ فسفر در قالب طرح پایه کاملاً تصادفی با سه تکرار در شرایط گلدانی و در فضای باز در گروه تولید و ژنتیک گیاهی دانشکده کشاورزی دانشگاه ارومیه در سال زراعی 97 - 1396 ارزیابی شد (شکل 1). منشاء لاین­های مورد مطالعه از کشورهای آمریکا، فرانسه، صربستان، مجارستان و ایران بود (فایل تکمیلی 1). برای کشت و بر اساس نتایج تجزیه خاک (Ali Ehyaei & Behbehani Zadeh, 1993)، خاک منطقه خان ارخی (Khan Arkhi) دانشگاه ارومیه با طول جغرافیایی 5/45 دقیقه­ شرقی، عرض جغرافیایی 32/37 دقیقه­ی شمالی و با ارتفاع 1320 متر از سطح دریا، از عمق صفر تا 30 سانتی متر با میزان فسفر پایین (mg/kg 2/7) انتخاب شد (فایل تکمیلی 2). تعداد 600 گلدان 15 کیلویی تهیه شد که به دو دسته 300 تایی تقسیم شدند. در هر دو دسته، گلدان­ها با خاک با میزان فسفر پایین و ماسه به نسبت دو به یک پر شدند. البته خاک با میزان فسفر پایین قبل از استفاده با عناصر مختلف کودی (mg/kg 100 ازت به‌صورت اوره در دو تقسیط، mg/kg 100 پتاسیم به‌صورت سولفات پتاسیم، پنج mg/kg آهن به‌صورت سکوسترین آهن 138، mg/kg 15 روی به‌صورت سولفات روی، پنج mg/kg منگنز به‌صورت سولفات منگنز، mg/kg 5/2 مس به‌صورت سولفات مس و mg/kg 5/2 بور به‌صورت اسید بوریک) تقویت شد (Sepehr et al., 2009). با توجه به این‌که در آزمایش‌های بررسی واکنش ژنوتیپ‏ها تحت تنش کمبود فسفر، گیاه در سطح کفایت عنصر مورد بررسی نباید با تنش آن عنصر مواجه شود، در 300 گلدان مربوط به شرایط فراهمی، فسفر به میزان mg/kg 80 به‌عنوان سطح کفایت در نظر گرفته شد (Sepehr et al., 2009) و به خاک گلدان­ها (300 گلدان شرایط فراهمی) از منبع سوپرفسفات تریپل اضافه شد، درحالی‌که در دسته دوم (300 گلدان مربوط به شرایط کمبود فسفر)، کود فسفری به خاک گلدان­ها اضافه نشد. فاصله­ دو ردیف گلدان از هم 50 سانتی‌متر و فاصله گلدان­ها از هم در روی ردیف، 30 سانتی‌متر در نظر گرفته شد. در فایل تکمیلی 2، به برخی از خصوصیات فیزیکی و شیمیایی خاک مورد استفاده در آزمایش اشاره شده است. در هر گلدان، چهار عدد بذر آفتابگردان کشت شد. در روزهای اول آزمایش، آبیاری گلدان‌ها به‌وسیله­ آب­باش هر سه روز یک بار، ولی بعد از جوانه­زدن بذرها و رویت گیاهچه­ها (سبز شدن مزرعه) و مصادف شدن با فصل گرما، آبیاری به‌صورت روزانه با سامانه آبیاری قطره­ای انجام گرفت. پس از سبز شدن گیاهچه­ها در مرحله چهار برگی، دو گیاه در هر گلدان نگهداری شد. مبارزه با علف­های‌هرز به‌صورت وجین دستی و با توجه به نیاز انجام گرفت. بعد از گلدهی، صفات مختلف از قبیل روز تا گلدهی (DF[10]; day)،  تعداد برگ ([11]Nleaf)،  طول دمبرگ (PL[12]; cm) میزان کلروفیل با استفاده از [13]SPAD و قبل از ظهر قبل از گرم شدن هوا (Chlo[14]; SPAD)، دمای کانوپی توسط دماسنج مادون قرمز (CanopyTemp[15]; °C)، ارتفاع بوته (PH[16]; cm)، قطر ساقه (StemD[17]; cm)، طول برگ (Llenght[18]; cm)، عرض برگ (Lwide[19]; cm)، سطح برگ (LS[20]; cm²)، محتوای نسبی آب برگ (درصد) (% RWC[21];)، روز تا رسیدگی (DM[22]; day)، زاویه­ برگ (Langle[23]; °)، قطر طبق (HD[24]; cm)، وزن بوته (Pweigh[25]; gr)، وزن هزار دانه (GW1000[26]; gr)، وزن طبق (Hwieght[27]; gr)، درصد روغن (% Oil;)، درصد فسفر بوته  (P[28]; %) و عملکرد تک بوته (Yield; gr) اندازه‌گیری شدند.

ارزیابی ژنوتیپی

در این پژوهش، از داده­های ژنوتیپی که با نشانگرهای مبتنی بر رتروترنسپوزونREMAP  و IRAP توسط Basirnia et al. (2016) با 28 ترکیب آغازگر رتروترنسپوزون تهیه شده بود استفاده شد. برای نمونه، پروفایل مولکولی تعدادی از افراد با نشانگرهای IRAP وREMAP  در شکل 2 و 3 نشان داده شده است. به‌طور خلاصه در تهیه پروفایل مولکولی افراد، واکنش‌های زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) در حجم نهایی 20 میکرولیتر، حاوی 20 نانوگرم DNA ژنومی، دو میکرولیتر از بافر PCR 10X (500 mM KCl, 500 mM Tris-HCl pH 8.4)، 75/1 میلی­مولار کلرید منیزیم (شرکت سیناژن، تهران، ایران)، 25/0 میلی­مولار از هر dNTP (BioFluxbiotech; http://biofluxbiotech.com) و 1/1 واحد آنزیم تک­پلی­مراز (شرکت سیناژن، تهران، ایران) و 10 میکرومولار از هر آغازگر‌ به همراه آب دیونیزه در ترموسایکلر 96 پایه (Eppendorf master cycler gradient Type 5331; Eppendorf AG, Hamburg, Germany) انجام شد. چرخه‌های دمایی برای تکثیر به‌صورت زیر برنامه‌ریزی شد: مرحله اول: واسرشت‌سازی اولیه در 94 درجه سانتی‌گراد به‌مدت چهار دقیقه، مرحله دوم: 37 چرخه که هر چرخه شامل دمای واسرشت‌سازی در 94 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 40 ثانیه، دمای اتصال 53 تا 60 درجه سانتی‌گراد (بسته به ساختار آغازگر) به‌مدت 40 ثانیه و دمای توسعه در 72 درجه سانتی‌گراد به‌مدت دو دقیقه و مرحله سوم: دمای توسعه‌ نهایی در 72 درجه سانتی‌گراد به‌مدت پنج دقیقه. جداسازی قطعات با استفاده از الکتروفورز ژل آگارز 8/1% (Invitrogen ultra-pure) به‌مدت چهار ساعت در 65 ولت صورت گرفت. رنگ­آمیزی قطعات با استفاده از اتیدیوم بروماید با غلظت یک میلی‌گرم بر میلی‌لیتر انجام شد. عکس­برداری و ذخیره اطلاعات با استفاده از سیستم ژل داکیومنتیشن (Gel Logic 212 PRO, USA) زیر نور UV انجام گرفت.

شکل 1- نمایی از آزمایش ارزیابی صفات آگرومورفولوژیک در 100 لاین خالص آفتابگردان روغنی تحت شرایط نرمال و تنش کمبود فسفر

Figure 1. A view of experiment conducted to study the agro-morphological traits of 100 oil seed sunflower lines under normal and phosphorous deficit stress conditions.

تجزیه­های آماری

تجزیه ‌داده‌ها در هر یک از شرایط نرمال و تنش کمبود فسفر، بر اساس مدل آماری طرح پایه کاملاً تصادفی با رویه مدل خطی عمومی در نرم­افزار SAS نسخه 4/9 انجام گرفت. برای این منظور، نخست نرمال بودن توزیع خطاها با روش شاپیرو-ویلک در نرم­افزار SAS بررسی شد. آماره­های توصیفی برای داده­های حاصل از ارزیابی واکنش ژنوتیپ­ها تحت شرایط نرمال و تنش کمبود فسفر در نرم­افزار SAS محاسبه شد و توزیع نرمال داده­های حاصل از ارزیابی واکنش ژنوتیپ­ها تحت شرایط نرمال و تنش کمبود فسفر با آزمون کلموگروف اسمیرنوف در نرم­افزار SPSS نسخه­ 25 محاسبه شد. تجزیه ساختار جمعیت، دسته­بندی دقیق ژنوتیپ­ها به زیرجمعیت­های مناسب و تشخیص ژنوتیپ­های مختلط با روش Bayesian در نرم­افزار Structure 2.3.4 انجام گرفت (Pritchard et al., 2000). بین یک تا 10 زیرجمعیت فرضی اولیه در نظر گرفته شد و برای افزایش دقت برای هر کدام از زیرجمعیت­ها، پنج تکرار منظور شد. در تجزیه­ها، از مدل ترکیبی Admixture با استقلال فراوانی آللی، 000/100 تکرار Burn-in و 000/100 تکرار Markov Chain Monte Carlo استفاده شد تا منحنی حداکثر درست­نمایی حاصل شود. تجزیه ارتباطی جهت بررسی ارتباط نشانگر­های مولکولی با تنوع فنوتیپی صفات با استفاده از نرم­افزار TASSEL 3.0 انجام گرفت. از آن‌جا که اطلاعات ژنوتیپی 88 فرد از 100 فرد در دسترس بود، به همین خاطر تجزیه ساختار جمعیت و تجزیه ارتباط با اطلاعات فنوتیپی و ژنوتیپی 88 فرد انجام گرفت. برای تجزیه ارتباطی از رویکرد مدل خطی مخلوط (MLM^[29]) استفاده شد. در تجزیه ارتباطی صفات، از میانگین سه تکرار هر ژنوتیپ استفاده شد؛ در حقیقت نوسانات بین تکرارها، نشان­دهنده­ خطای آزمایشی بود و بهترین برآورد برای تعیین مقدار حقیقی اثر تیمار (ژنوتیپ)، میانگین تیمار مربوطه می‌باشد؛ بنابراین ارتباطی ارزشمند خواهد بود که نشانگر با میانگین صفت نشان داده باشد.

نتایج و بحث

تجزیه تنوع فنوتیپی

تجزیه واریانس تک­متغیره، اختلاف معنی داری بین لاین ها برای کلیه صفات مورد بررسی در هر یک از شرایط فراهمی و تنش کمبود فسفر نشان داد (جدول 1 و 2) که بیانگر وجود تنوع در میان لاین­های مورد مطالعه برای صفات مورد بررسی در هریک از شرایط می­باشد. مقادیر ضریب تغییرات محیطی (CV) در جدول تجزیه واریانس، بین 70/1 درصد تا 86/52 درصد متغیر بود. کمترین CV مربوط به صفت روز تا رسیدگی در شرایط فراهمی و بیشترین مقدار مربوط به صفت وزن خشک گیاه در شرایط تنش کمبود فسفر بود (جدول 1 و 2). Nooryazdan et al (2010) بیشترین مقدار ضریب تغییرات را برای صفات وزن دانه (عملکرد دانه)، طول دمبرگ و قطر ساقه در آفتابگردان روغنی گزارش نمودند. ضریب تغییرات، دقت آزمایش را نشان می­دهد و مقادیر کمتر از 30 درصد، حاکی از دقت بالای آزمایش است، ولی اگر ضریب تغییرات بیش از 30 درصد باشد، نشان دهنده لزوم تکرار آزمایش است (Jayaraman, 1999). البته در مواقعی اگر آماره F تیمار معنی­دار باشد، لازم به تکرار آزمایش نیست. اعتقاد بر این است در چنین مواقعی، اختلاف بین تیمارها به حدی است که با وجود بالا بودن ضریب تغییرات (بالا بودن واریانس اشتباه آزمایشی)، باز اختلافات خود را نشان داده­اند و این مورد در چندین اثر پژوهشی گزارش شده است (Xu et al., 2000; Zarei et al., 2007). آماره­های توصیفی برای داده­های حاصل از ارزیابی واکنش ژنوتیپ­ها تحت شرایط فراهمی و تنش کمبود فسفر در جدول 3 و 4 خلاصه شده است. بیشترین درصد ضریب تغییرات فنوتیپی در شرایط فراهمی فسفر، به‌ترتیب برای وزن طبق خالی (84/69)، وزن خشک بوته (92/68) و عملکرد دانه (07/55) و کمترین آن، به‌ترتیب برای صفات روز تا رسیدگی (95/3)، روز تا 50 درصد گلدهی (28/7) و دمای کانوپی (65/7) مشاهده شد (جدول 3). در شرایط کمبود فسفر نیز بیشترین درصد ضریب تغییرات فنوتیپی، به‌ترتیب به وزن طبق خالی (72/69)، عملکرد دانه (17/66) و وزن خشک بوته (16/54) و کمترین آن، به‌ترتیب به صفات روز تا رسیدگی (48/4)، دمای کانوپی (95/6) و روز تا 50 درصد گلدهی (33/8) تعلق داشت (جدول 4). بنابراین می­توان نتیجه گرفت در بین لاین­های آفتابگردان روغنی مورد بررسی در هر دو شرایط فراهمی و کمبود فسفر و از نظر صفات عملکرد دانه و وزن خشک بوته، بیشترین تنوع وجود دارد که می­توان از این صفات به‌منظور انتخاب و اصلاح برای دستیابی به لاین­های مطلوب آفتابگردان روغنی بهره جست. تنوع زیاد برای یک صفت در مواد اصلاحی، موفقیت پروژه‌های به‌نژادی را تضمین می‌کند؛ به همین دلیل پارامتر ضریب تغییرات فنوتیپی، یکی از مهم‌ترین و با ارزش‌ترین شاخص‌های برآورد تنوع در جمعیت­ها به شمار می­رود. این معیار تحت تأثیر واحد اندازه‌گیری صفت و یا دامنه تغییرات آن قرار نمی­گیرد؛ به همین دلیل نسبت به دیگر معیارهای تنوع از اهمیت بیشتری برخوردار است. صفات با ضریب تغییرات فنوتیپی پایین، پاسخ به گزینش کمتری نشان خواهند داد.

جدول 1- تجزیه واریانس صفات مورد بررسی در 100 لاین آفتابگردان روغنی تحت شرایط فراهمی فسفر

Table 1. Variance analysis of the studied traits in 100 oil seed sunflower lines under optimal phosphorus conditions.

df: درجه آزادی؛ CV: ضریب تغییرات؛ ns، *، **: به‌ترتیب غیر معنی دار، معنی دار در سطح احتمال پنج و یک درصد.

df: degree of freedom; CV: Coefficient of variation. ns, *, **: Not significan and significan at 5% and 1% of probability levels, respectively.

جدول 2- تجزیه واریانس صفات مورد بررسی در 100 لاین آفتابگردان روغنی تحت شرایط کمبود فسفر

Table 2. Variance analysis of the studied traits in 100 oil seed sunflower lines under phosphorus deficit conditions.

df: درجه آزادی؛ CV: ضریب تغییرات؛ ns، *، **: به‌ترتیب غیر معنی دار، معنی دار در سطح احتمال پنج و یک درصد.

df: degree of freedom; CV: Coefficient of variation. ns, *, **: Not significan and significan at 5% and 1% of probability levels, respectively

تجزیه ساختار جمعیت

با 28 آغازگر مورد استفاده در این تحقیق، در کل 248 مکان تکثیر شدند که از این تعداد جایگاه ژنومی، 128 جایگاه مربوط به نشانگرهای IRAP و 120 جایگاه مربوط به نشانگرهای REMAP بود. برای نمونه، پروفایل مولکولی تعدادی از افراد با نشانگرهای IRAP وREMAP  در شکل 2 و 3 نشان داده شده است. بر اساس نتایج تجزیه ساختار جمعیت بر اساس داده‌های نشانگرهای مبتنی بر رتروترنسپوزون IRAP و REMAP، دو زیر جمعیت احتمالی (دوK=) در پانل ارتباطی مورد مطالعه شناسایی شد (شکل 4). بر اساس نتایج ارائه شده در بارپلات (شکل 5)، با در نظر گرفتن احتمال بیشتر از 70 درصد برای عضویت هر لاین در گروه، 15 لاین در زیر گروه اول (رنگ قرمز) و 36 لاین در زیر گروه دوم (رنگ سبز) گروه­بندی شدند؛ درحالی‌که 37 لاین با احتمال عضویت کمتر از 70 درصد، به‌عنوان لاین­های مختلط شناسایی شدند. ساختار یک جمعیت، نتیجه انتخاب و در سطوح بالاتر، حاصل اختلاط در آن جمعیت می­باشد که منجر به عدم تعادل پیوستگی بین نشانگرهای غیرپیوسته (نشانگرهای با فاصله زیاد در روی یک کروموزوم یا نشانگرهای واقع در کروموزوم­های مختلف) می­شود (Cardon & Palmer, 2003; Rostok et al., 2006). آگاهی از ساختار جمعیت، به‌عنوان یک پیش­نیاز در تجزیه ارتباطی می‏تواند برای جلوگیری از ارتباطات مثبت و دروغین بین نشانگرها و صفات استفاده می­شود (Pritchard & Donnelly, 2001).

جدول 3- آماره­های توصیفی صفات مورد بررسی در 100 لاین آفتابگردان روغنی تحت شرایط فراهمی فسفر

Table 3. Descriptive statistics of studied traits of 100 oil seed sunflower lines under optimal phosphorus conditions.

جدول 4- آماره­های توصیفی صفات مورد بررسی در 100 لاین آفتابگردان روغنی تحت شرایط کمبود فسفر

Table 4. Descriptive statistics of studied traits of 100 oil seed sunflower lines under phosphorus deficit conditions.

شکل 2- تصویر انگشت نگاره IRAP تعدادی از لاین­های آفتابگردان مورد مطالعه با استفاده از آغازگر‌های 1063-1064

Figure 2. IRAP fingerprints of some sunflower lines using 1063-1064 primers. Fist lane from left to right: M, 1kb DNA ladder (Fermentas) in base pairs.

شکل 3- تصویر انگشت نگاره REMAP تعدادی از لاین­های آفتابگردان مورد مطالعه با استفاده از ترکیب آغازگری 1065-UBC818

Figure 3. REMAP fingerprints of some sunflower lines using 1066-UBC818 primers. Fist lane from left to right: M, 1kb DNA ladder (Fermentas) in base pairs.

عدم تعادل پیوستگی

در تجزیه ارتباطی که مکان­یابی QTLها بر اساس عدم تعادل پیوستگی صورت می­گیرد، علاوه بر اطلاع از ساختار جمعیت، اطلاع از گستره عدم تعادل پیوستگی (LD) در ژنوم نیز از اهمیت بالایی برخوردار است، به‌طوری‌که توان آماره تجزیه ارتباطی به‌وسیله مقدار LD بین چندشکلی علّی و اندازه جمعیت مورد استفاده تعیین می­شود (Al-Maskri et al., 2012). در طول زمان، میزان LD در نتیجه اتفاقات نوترکیبی کاهش می‌یابد. درصورتی‌که تعداد اتفاقات نوترکیبی بیشتری بین دو مکان ژنی اتفاق افتد، LD سریع‌تر زوال پیدا می‌کند. اگر LD داخل یک منطقه‌ خیلی سریع زوال پیدا کند، برای پویش آن منطقۀ ژنومی به تعداد زیادی نشانگر در آن ناحیه نیاز خواهد بود. از طرف دیگر، اگر LD خیلی آهسته زوال پیدا کند، اندازه بلوک‌های هاپلوتایپی بسیار بزرگ خواهد بود و در نتیجه به‌طور واضح نمی‌توان مکان ژنی علّی را شناسایی کرد. به عبارت دیگر، زوال LD روی فاصله فیزیکی در جمعیت‌های مورد مطالعه، تراکم نشانگری مورد نیاز و سطح وضوح مطالعه نقشه‌یابی تأثیر می­گذارد. در این مطالعه، از بین 10075 جفت نشانگر IRAP & REMAP، 04/3 درصد در سطح احتمال یک درصد در عدم تعادل پیوستگی بودند (شکل 6). از آن‌جا که اندازه پنجره نرم­افزار TASSEL برای نمایش نمودار LD ماتریسِ جفت نشانگرها محدود می­باشد، به این دلیل از تمامی جفت نشانگرهای ممکن (10075 جفت نشانگر)، تنها بخشی نمایش داده شده است. این نمودار صرفاً نمایش کلی از عدم تعادل پیوستگی بین نشانگرها را ارایه می دهد. برای تفاسیر و بررسی عدم تعادل پیوستگی بین جفت نشانگرها از داده‌های خام خروجی نرم­افزار استفاده می‌شود.

شکل 4- تعیین ساختار جمعیت بر اساس نشانگرهای IRAP و REMAP با نرم­افزار Structure 2.3.4. محور عمودی مقدار K و محور افقی تعداد زیر جمعیت را نشان می­دهد.

Figure 4. Determining the structure of population based on IRAP and REMAP markers with Structure 2.3.4 software. Vertical and horizontal axis shows the K value and the number of subpopulations, respectively.

تجزیه ارتباطی صفات

بر اساس نتایج آزمون کلموگروف-اسمیرنف روی داده­ها در هر یک از شرایط نرمال و تنش کمبود فسفر، تعدادی از صفات توزیع نرمال نداشتند. از آن‌جا که نرمال­سازی داده­ها از طریق تبدیل داده ممکن است با کشیدن دم­های کج به سمتِ مرکز توزیع، تفاوتِ بین افراد را نادرست نشان دهد (Doerge & Churchill, 1994, Mutschler et al., 1996; Poormohammad Kiani et al., 2009)، تمام تجزیه و تحلیل­های ارتباطی بر روی داده­های بدون تغییر انجام شد. در این مطالعه که یک بررسی ابتدایی است، تصحیح بونفرونی انجام نگرفت، چرا که در صورت انجام، ممکن است نشانگرهایی که نسبتاً معنی‌دار هستند حذف شده و در مطالعات تکمیلی در نظر گرفته نشوند. بنابراین بهتر است در مطالعات اولیه که تعداد نشانگر و جمعیت اولیه کمی در اختیار است، با سخت‌گیری بسیار زیاد، خیلی از نشانگرها را به راحتی حذف ننمود. در تجزیه ارتباطی بر اساس مدل خطی مخلوط، 17 نشانگر رتروترنسپوزونی IRAP و REMAP پیوسته با صفات در شرایط فراهمی فسفر شناسایی شد که از این تعداد، سه نشانگر رتروترنسپوزونی با صفت دمای کانوپی، چهار نشانگر با صفت وزن هزار دانه، چهار نشانگر با صفت سطح برگ، یک نشانگر با صفت طول برگ، دو نشانگر با صفت تعداد برگ، یک نشانگر با صفت طول دمبرگ، یک نشانگر با صفت قطر طبق، یک نشانگر با صفت درصد فسفر و سه نشانگر با صفت درصد روغن پیوسته بوند. نشانگر cfcr8-1 بین صفات وزن هزار دانه و تعداد برگ مشترک بود (جدول 5).

شکل 5- گروه­بندی 88 ژنوتیپ آفتابگردان با استفاده از نشانگرهایIRAP  و  REMAPدر نرم­افزار Structure 2.3.4 بر اساس مدل Bayesian هر رنگ، یک زیر جمعیت را نشان می­دهد (2K=).

Figure 5. Bayesian model-based grouping of 88 oilseed sunflower lines using IRAP and REMAP markers in Structure 2.3.4 software. Each color represents a subpopulation (K=2).

شکل 6- پلات عدم تعادل پیوستگی (LD plot) بین جفت مکان‏های نشانگرها در 88 لاین­ آفتابگردان با استفاده از نرم­افزار TASSEL 3.0. بالای قطر نشان­دهنده میزان عدم تعادل پیوستگی با استفاده از آماره D´  و پایین قطر P-value عدم تعادل بین جفت نشانگرها را نشان می­دهد.

Figure 6. Linkage disequilibrium plot (LD plot) between pairs of molecular markers loci in sunflower lines using TASSEL 3.0 software. Above of diameter indicates the degree of linkage disequilibrium using the D´ statistic and the lower of diameter indicates the P-value Linkage disequilibrium between pairs of markers.

جدول 5-  نشانگرهای IRAP و REMAP شناساسی شده برای صفات ارزیابی شده آفتابگردان در شرایط بهینه فسفر با مدل خطی مخلوط

Table 5. Identified IRAP and REMAP markers for evaluated sunflower traits under optimal phosphorus conditions with mixed linear model

در تجزیه ارتباطی در شرایط کمبود فسفر، تعداد 19 نشانگر رتروترنسپوزونی IRAP و REMAP پیوسته با صفات مورد مطالعه شناسایی شد (جدول 6) که از این تعداد دو نشانگر رتروترنسپوزونی با صفت دمای کانوپی، یک نشانگر با صفت روز تا گلدهی، سه نشانگر با صفت وزن هزار دانه، یک نشانگر با صفت طول دمبرگ، دو نشانگر با صفت سطح برگ، چهار نشانگر با صفت عرض برگ، سه نشانگر با صفت قطر طبق، دو نشانگر با صفت وزن طبق، یک نشانگر با صفت وزن بوته، سه نشانگر با صفت روز تا رسیدگی، یک نشانگر با صفت درصد فسفر، یک نشانگر با صفت میزان کلروفیل و یک نشانگر با صفت ارتفاع بوته پیوسته بودند. نشانگر cfcr8-1 بین صفات دمای کانوپی، وزن هزار دانه، قطر طبق، وزن طبق و وزن بوته، نشانگر ufur17 بین صفات وزن هزار دانه و سطح برگ، نشانگر cf1 بین صفات طول برگ، عرض برگ و قطر طبق، نشانگر 655 بین صفات طول برگ، عرض برگ و قطر طبق و نشانگر 61657 بین صفات طول برگ، عرض برگ و ارتفاع بوته مشترک بود. نشانگر cfcr8-1 در شرایط فراهمی و کمبود فسفر مشترک بود.

بر اساس نتایج آماره­های توصیفی، میانگین اکثر صفات مورد مطالعه در شرایط کمبود فسفر در مقایسه با شرایط بهینه کاهش یافت و بیشترین آسیب ناشی از کمبود فسفر، به‌ترتیب در صفات درصد فسفر بوته، عملکرد دانه در بوته، وزن طبق و وزن خشک بوته مشاهده شد. در حدود 7/5 میلیارد هکتار از زمین­های کشاورزی در جهان دارای کمبود[30] فسفر هستند (Batjes, 1997; Heuer et al., 2009). در توافق با یافته­های این تحقیق، مشاهده شده است که کمبود فسفر، رشد و عملکرد گیاهان زراعی دیگر از قبیل برنج (Oryza sativa L.) (Wissuwa & Ae, 2001)، ذرت (Zea mays L.) (Plenet et al., 2000)، گندم (Triticum aestivum L.) (Lazaro et al., 2010)، سورگوم (Sorghum bicolor L.) (Camacho et al., 2002)، لوبیا (Phaseolus vulgaris L.) (Bonser et al., 1996)، سویا (Glycine max L.) (Mahamood et al., 2009) و ارزن دم روباهی (Setaria italica) (Ceasar et al., 2014) را تحت تاثیر قرار می‌دهد. در این وضعیت، کاهش تولید مواد غذایی از اراضی فسفر-فقیر[31] ممکن است منجر به کمبود مواد غذایی شود (Childers et al., 2011).

در این مطالعه و بر اساس نشانگرهای مبتنی بر رتروترنسپوزون با استفاده از مدل خطی مخلوط، به‌ترتیب 17 و 19 نشانگر مولکولی پیوسته با صفات آگرومورفولوژیک مورد مطالعه در شرایط فراهمی و کمبود فسفر شناسایی شدند. از دیدگاه ژنتیک، سه روش برای توسعه محصولات زراعی که به‌طور موثر می­توانند فسفر را از خاک کسب کنند وجود دارد که عبارتند از: به­نژادی به روش­های کلاسیک، به­نژادی مولکولی یا به­نژادی به کمک نشانگرهای مولکولی و مهندسی ژنتیک. قبلاً به­نژادی کلاسیک از طریق روش­هایی مانند تلاقی برگشتی و انتخاب دوره­ای، منجر به توسعه ارقام سویا با صفات زراعیِ عالی شده است که آن‌ها را قادر ساخته است تا در خاک­های با کمبود فسفر، رشد کنند و تولید محصول نمایند. در سال­های اخیر، اصلاح به کمک نشانگرهای مولکولی پس از شناسایی QTL برای صفات تحت تنش کمبود فسفر، محبوبیت زیادی کسب کرده است. در محصولاتی مانند برنج، لوبیا، سویا، Brassica oleracea و ذرت، QTLهایی که تحمل در برابر تنش کمبود فسفر را کنترل می­نمایند، شناسایی شده­اند. جدا از این محصولات و مخصوصاً غلات، شناسایی QTL برای صفات مرتبط با تحمل کمبود فسفر در گیاهان دیگر هنوز مورد توجه قرار نگرفته است. در گیاهانِ مطالعه شده، QTLها عمدتاً برای صفات مرتبط با رشد، تولید زیست توده و صفات مرتبط با عملکرد شناسایی شده­اند. QTLهای شناسایی شده می­توانند برای بهبود بازده مصرف فسفر در گیاهان زراعی از طریق اصلاح به کمک نشانگر (MAS) و اصلاح نژاد مورد استفاده قرار گیرند و بدین ترتیب باعث بهبود عملکرد در خاک­های فسفر-فقیر شوند. توسعه ارقام بهبود یافته و جدید با استفاده از تکنولوژی MAS از طرفی استفاده از کودهای تجدیدناپذیر را تقلیل خواهد کرد و از طرف دیگر منجر به بهبود کارایی استفاده از فسفر در محصولات زراعی در سیستم­های کشاورزی کم نهاده[32] خواهد شد. چندین نمونه موفق وجود دارد که در آن‌ها، استفاده از اطلاعات QTL برای بهبود صفات مرتبط با کارایی فسفر، توسعه ارقام فسفرکارا را تسهیل کرده است که از این بین می­توان به برنج (Chin et al., 2011) و ذرت (Zhang et al., 2013c; Gu et al., 2016) اشاره کرد.

برخی از نشانگرها بین صفات در شرایط فراهمی و تنش کمبود فسفر مشترک بودند. همچنین تعدادی نشانگر مشترک بین صفات در هر یک از شرایط مورد مطالعه شناسایی شد. نشانگر cfcr8-1 بین صفات در شرایط فراهمی و کمبود فسفر مشترک بود. نشانگرهای مشترک برای صفات در بین شرایط، معمولاً دارای اثر متقابل کمتری با شرایط محیطی می­باشند (نشانگرهای پایدار)؛ بنابراین گزینش با آن‌ها برای صفتی در یکی از شرایط (مثلاً شرایط نرمال)، باعث بهبود صفت در شرایط دیگر (تنش) نیز خواهد شد. در کل، وجود نشانگر مشترک بین چندین صفت، معمولاً به دلیل پلیوتروپی و یا پیوستگی شدید ژن­ها می­باشد؛ وجود چنین حالتی، به‌طور بالقوه کارایی گزینش بر اساس نشانگر را بالا می‌برد و موجب می­شود که به دنبال اصلاح یک صفت در یک گیاه، تغییراتی در ارزش صفات همبسته دیگر ایجاد شود  (Ahmadpour et al., 2018). البته در گزینش همزمان نباید از فاز پیوستگی غافل بود؛ بسته به حالت سیس و یا ترانس، فعالیت انتخاب، راحتر و یا دشوارتر خواهد بود.

نتایج به‌دست آمده از این مطالعه، اطلاعات ارزشمندی در زمینه اساس ژنتیکی صفات مورد مطالعه در شرایط تنش کمبود فسفر ارائه می­دهد که می‌توان از این اطلاعات در برنامه‌های به‌نژادی و تولید ارقام هیبرید جدید آفتابگردان با میزان عملکرد بالا و کارایی فسفر بالا بهره برد.

جدول 6-  نشانگرهای IRAP و REMAP شناساسی شده برای صفات ارزیابی شده آفتابگردان در شرایط کمبود فسفر با مدل خطی مخلوط

Table 6. Identified IRAP and REMAP markers for evaluated sunflower characters under phosphorus deficit conditions with mixed linear model.

جمعیت لاین‌های مورد مطالعه در این تحقیق که از کشورهای مختلف و منشأهای اولیه متفاوتی جمع­آوری شده­اند، تنوع گسترده از نظر صفات مختلف تحت شرایط خشکی (Soleimani et al., 2018)، شوری (Ahmadpour et al., 2018) و تنش­های زیستی (Najafzadeh et al., 2018) نیز نشان داده­اند. بنابراین بر اساس مطالعه حاضر و مطالعات قبلی می­توان نتیجه­گیری نمود که جمعیت پانل ارتباطی مورد استفاده بالقوه منبع خوبی برای فعالیت­های اصلاحی در آفتابگردان می­باشد.

REFERENCES

1. Al-Maskri, A. Y., Sajjad, M. & Khan, S. H. (2012). Association mapping: a step forward to discovering new alleles for crop improvement. International Journal of Agriculture & Biology, 14(1), 153-160.
2. Ahmadpour, S., Sofalian, O., Darvishzadeh, R. & Abbaspour, N. (2018). Preliminary evidence of the associations between DNA markers and morphological characters in sunflower under natural and salt stress conditions. Zemdirbyste-Agriculture, 105 (3), 279-286.
3. Ali Ehyaei, M. & Behbehani Zadeh, A. A. (1993). Methods of Soil Chemical Analysis. Technical Publication No. 893. Soil and Water Research Institute of Agricultural Extension and Education, Tehran. Iran. (in Persian)
4. Alipour, H. & Darvishzadeh, R. (2019). Association mapping of quantitative traits in molecular cereal breeding. Cereal Research, 9(3), 271-298. (in Persian)
5. Basirnia, A., Darvishzadeh, R. & Abdollahi Mandoulakani, B. (2016). Retrotransposon insertional polymorphism in sunflower (Helianthus annuus ) lines revealed by IRAP and REMAP markers. Plant Biosystems, 150(4), 641-652.
6. Bovill, W. D., Huang, C. Y. & McDonald, G. K. (2013). Genetic approaches to enhancing phosphorus-use efficiency (PUE) in crops: challenges and directions. Crop Pasture Science, 64, 179-198.
7. Cardon, L. R. & Palmer, L. J. (2003). Population stratification and spurious allelic association. Lancet, 361, 598-604.
8. Doerge, R. W. and Churchill, G. A. (1994). Empirical threshold values for quantitative trait mapping. Genetics, 138, 963-971.
9. Food and Agriculture Organization (2018). FAOSTAT in FAO. Retrieved August 31, 2020, from http://www.fao.org/faostat/en/#data/QC.
10. Gamuyao, R., Chin, J. H., Pariasca-Tanaka, J., Pesaresi, P., Catausan, S., Dalid, C., Slamet-Loedin, I., Tecson-Mendoza, E. M., Wissuwa, M. & Heuer, S. (2012). The protein kinase Pstol1 from traditional rice confers tolerance of phosphorus deficiency. Nature, 7412, 535-539.
11. Gong, X., Wheeler, R., Bovill, W. D. & McDonald, G. K. (2016). QTL mapping of grain yield and phosphorus efficiency in barley in a Mediterranean‑like environment. Theoreticaland Applied Genetics, 129, 1657-1672.
12. Gourley, C. J. P., Allan, D. L. & Russelle, M. P. (1994). Plant nutrient efficiency: a comparison of definitions and suggested improvement. Plant Soil, 158, 29-37.
13. Jayaraman, K. (1999). A Statistical Manual for Forestry Research, Food and Agricultural Organization of the United Nations Regional Office for Asia and the Pacific, Bangkok, 234 pp.
14. Kalendar, R., Grob, T., Regina, M., Souniemi, A. & Schulman, A. H. (1999). IRAP and REMAP: Two new retrotransposon-based DNA fingerprinting techniques. Theoretical and Applied Genetics, 98, 704-711.
15. Li, Y. D., Wang, Y. J., Tong, Y. P., Gao, J. G., Zhang, J. S. & Chen, S. Y. (2005). QTL mapping of phosphorus deficiency tolerance in soybean (Glycine max). Euphytica, 142, 137–142.
16. Liao, H., Yan, X. L., Rubio, G., Beebe, S. E., Blair, M. W. & Lynch, J. P. (2004). Genetic mapping of basal root gravitropism and phosphorus acquisition efficiency in common bean. Functional Plant Biology, 31, 959-970.
17. Mc Laughlin, M. J., Alston, A. M. & Martin, J. K. (1988). Phosphorus cycling in wheat-pasture rotations. I. The source of phosphorus taken up by wheat. Australian Journal of Soil Research, 26, 323-331.
18. Mutschler, M. A., Doerge, R. W., Liu, S. C., Kuai, J. P., Liedl, B. E. and Shapiro, J. A. (1996). QTL analysis of pest resistance in the wild tomato Lycopersicum pennellii: QTLs controlling acylsugar level and composition. Theoretical and Applied Genetics, 92, 709-718.
19. Najafzadeh, R., Darvishzadeh, R., Musa-Khalifani, K., Abrinbana, M. & Alipour, H. (2018). Retrotransposonable regions of sunflower genome having relevance with resistance to Sclerotiniaspecies: sclerotiorum and S. minor. Australasian Plant Pathology, 47, 511-519.
20. Onofrio, C., Orenzis, G., Giordani, T., Natali, L., Cavallini, A. & Scalabrelli, G. (2010). Retrotransposon-based molecular markers for grapevine species and cultivars Tree Genetics and Genomes, 6, 451-466.
21. Oono, Y., Kobayashi, F., Kawahara, Y., Yazawa, T., Handa, H., Itoh, T. & Matsumoto, T. (2013). Characterization of the wheat (Triticum aestivum) transcriptome by de novo-assembly for the discovery of phosphate starvation-responsive genes: Gene expression in Pi-stressed wheat. BMC Genomics, 14, 77.
22. Poormohammad Kiani, S., Maury, P., Nouri, L., Ykhlef, N., Grieu, P. & Sarrafi, A. (2009). QTL analysis of yield-related traits in sunflower under different water treatments. Plant Breeding, 128, 363-373.
23. Pritchard, J. K., Stephens, M., Rosenberg, N. A. & Donnelly, P. (2000). Association mapping in structured populations. American Journal of Human Genetics,67 (1), 170-181
24. Pritchard, J. K. & Donnelly, P. (2001). Case control studies of association in structured or admixed populations. Theoretical Population Biology, 60, 227-237.
25. Rostok, N., Ramsay, L., Mac Kenzie, K., Cardle, L. & Bhat, P. R. (2006). Recent history of artificial outcrossing facilitates whole-genome association mapping in elite inbred crop varieties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 103, 18656-18661.
26. Sepehr, E., Malakouti, M. J., Kholdebarin, B., Samadi, A. & Karimian N. (2009). Genotypic variation in P efficiency of selected Iranian cereals in greenhouse experiment. International Journal of Plant Production, 3(3), 17-28.
27. Shimamura, M., Yasue, H., Ohshima, K., Abe, H., Kato, H., Kishiro, T., Goto, M., Munechika, I. & Okada, N. (1997). Molecular evidence from retrotransposons that wales from a clade within even-toed ungulates. Nature, 88, 666-670.
28. Soleimani Gezeljeh, A., Darvishzadeh, R., Ebrahimi, A. & Bihamta, M. R. (2018). Identification of SSR and retrotransposon-based molecular markers linked to morphological characters in oily sunflower (Helianthus annuus) under natural and water-limited states. Journal of Genetics, 97, 189–203.
29. Su, J. Y., Xiao, Y. M., Li, M., Liu, Q. Y., Li, B., Tong, Y. P., Jia, J. Z. & Li, Z. S. (2006). Mapping QTLs for phosphorus-deficiency tolerance at wheat seedling stage. Plant and Soil, 281, 25-36.
30. Wissuwa, M., Yano, M. & Ae, N. (1998). Mapping of QTLs for phosphorus-deficiency tolerance in rice (Oryza sativa). Theoretical and Applied Genetics, 97, 777-783.
31. Xu, W., Subudhi, P. , Crasta, O. R., Rosenow, D. T., Mullet, J. E. & Nguyen, H. T. (2000). Molecular mapping of QTLs conferring stay-green in grain sorghum (Sorghum bicolor L. Moench). Genome, 43, 461- 469.
32. Yan, X. L., Wu, P., Ling, H. Q., Xu, G. H., Xu, F. S. & Zhang, Q. F. (2006). Plant nutriomics in China: an overview. Annals of Botany, 98, 473-482.
33. Yang, M., Ding, G. D., Shi, L., Xu, F. S. & Meng, J. L. (2011). Detection of QTL for phosphorus efficiency at vegetative stage in Brassica napus. Plant and Soil, 339, 97-111.
34. Zarei, L., Farshadfar, E., Haghparast, R., Rajabi, R. & Mohammadi Sarab Badieh, M. (2007). Evaluation of some indirect traits and indices to identify drought tolerance in bread wheat (Triticum aestivum). Asian Journal of Plant Sciences, 6, 1204- 1210.
35. Zhu, J. M., Kaeppler, S. M. & Lynch, J. P. (2005). Mapping of QTL controlling root hair length in maize (Zea mays) under phosphorus deficiency. Plant and Soil, 270, 299-310.

[1]. Less available soil pools of phosphorous

[2]. Nutrient pollution of riparian systems

[3].Marker assisted selection (MAS)

[4].Inter-retrotransposon amplified polymorphism

[5].Long terminal repeats

[6].Retrotransposon-microsatellite amplified polymorphism

1. Association analysis

[8]. Linkage disequilibrium

[9]. Recombinant inbred lines

[10]. Day to flowering

[11]. Number of leaf

[12]. Petiole length

[13]. The Soil-Plant Analyses Development. Unit of Minolta Camera Co. has developed the SPAD-502 chlorophyll meter (Minolta Camera Co., Japan).

[14]. Chlorophyll rate

[15]. Canopy temperature

[16]. Plant height

[17]. Stem diameter

[18]. Leaf length

[19]. Leaf wide

[20]. Leaf area

[21]. Relative water content

[22]. Day to maturity

[23]. Leaf angle

[24]. Head diameter

[25]. Plant weight

[26]. 1000 grain weight

[27]. Head wieght

[28]. Phosphorous

[29]. Mixed linear model

[30]. Lack

[31]. Phosphorous-deficient soil

[32]. Low input agriculture