پاسخ‌های زودهنگام ترانسکریپتوم نخود زراعی به تنش سرما

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشجوی دکتری گروه زراعت و اصلاح نباتات پردیس کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه تهران

2 استاد گروه زراعت و اصلاح نباتات پردیس کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه تهران

3 استادیار موسسه تحقیقات کشاورزی دیم کشور، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، مراغه

4 دانشگاه RMIT ، ملبورن استرالیا

چکیده

در این مطالعه، پاسخ­های ترانسکریپتوم دو ژنوتیپ نخود متحمل (Sel96th11439) و حساس ILC533)) به تنش سرمای کوتاه مدت (چهار درجه سانتی­گراد پس از 24 ساعت)، به کمک روش RNA-seq بررسی شد. تحت تنش سرما، محتوی پراکسید هیدروژن، پراکسیداسیون چربی­های غشا و نشت الکترولیتی غشا در گیاهان حساس در مقایسه با گیاهان متحمل، به­طور معنی­داری افزایش یافت. در ژنوتیپ متحمل در مقایسه با گیاهان شاهد (بدون تنش سرما)، 526 ژن، تغییر بیان معنی­دار نشان دادند، به­طوری که 261 و 265 ژن، به­ترتیب افزایش و کاهش بیان معنی­دار داشتند. در ژنوتیپ حساس در مقایسه با گیاهان شاهد (بدون تنش سرما)، 901 ژن تغییر بیان معنی­دار نشان دادند که 295 و 606 ژن، به­ترتیب افزایش و کاهش بیان معنی­دار داشتند. نتایج نشان داد که ژن‏های دارای بیان کاهشی، فراوانی بیشتری در مقایسه با ژن‏های دارای بیان افزایشی در هر دو  ژنوتیپ‏ داشتند. همچنین تعداد ژن‏های دارای بیان کاهشی ژنوتیپ حساس، 3/2 برابر در مقایسه با ژنوتیپ متحمل بود. بیان 216 ژن در ژنوتیپ متحمل افزایش یافت در حالی که این ژن­ها در ژنوتیپ حساس کاهش بیان داشتند که تقریباً 15 درصد آن­ها، ژن­های فاکتور رونویسی بودند. بر اساس الگوهای رونوشت شناسایی شده، بیان ژن­های مسیر سنتز برخی متابولیت­ها در ژنوتیپ متحمل، افزایش و در ژنوتیپ حساس، کاهش یافت. تحت تنش سرما، 31 ژن در ژنوتیپ حساس افزایش و در ژنوتیپ متحمل کاهش بیان نشان دادند که ژن­های مولد هیستون­ها، تقریباً 10 درصد این ژن‏ها بودند. نتایج این مطالعه بیانگر نقش تعیین کننده پاسخ­های زودهنگام، به­خصوص فاکتورهای رونویسی و تغییرات اپی ژنتیکی در تحمل به تنش سرما در نخود بود.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Transcriptome profiling of the early-response in chickpea to cold stress

نویسندگان [English]

  • Yasin Khaledian 1
  • Reza Maali-Amiri 2
  • Rahmat Mohammadi 3
  • Nitin Mantri 4
1 Department of Agronomy and Plant Breeding, University College of Agriculture and Natural Resources, University of Tehran, Iran
2 . Department of Agronomy and Plant Breeding, University College of Agriculture and Natural Resources, University of Tehran, Iran
3 Dryland Agricultural Research Institute, Ministry of Jihad-e-Agriculture Research and Education Organization, Maraghe, Iran
4 School of Science, RMIT University, Melburn, Australia.
چکیده [English]

In this study, transcriptome responses of cold-tolerant (Sel96Th11439) and cold-sensitive (ILC533) chickpea genotypes were evaluated under short-term cold stress (4˚C). The hydrogen peroxide (H2O2), lipid peroxidation (MDA) and electrolyte leakage content increased significantly under cold stress in sensitive more than tolerant plants. In tolerant genotype, 526 genes showed significant expressions; 261 and 265 genes were up-and down-regulated, respectively, while in sensitive genotype, 901 genes showed significant patterns of expression; 295 and 606 genes showed increases and decreases in their expressions, respectively. In both genotypes and under cold conditions, the down-regulated genes had more frequencies than up-regulated genes. Also, the down-regulated genes in sensitive plants were 2.3-fold compared to tolerant ones. 216 genes, which were up-regulated in tolerant plants, showed decreased expression in sensitive plants under cold stress, among which 15% were transcription factors. Based on identified transcript patterns, those genes involved in biosynthetic pathway of some metabolites were significantly increased in tolerant genotype whereas they were decreased in sensitive genotype. The level of transcript in 31 genes showed significant increase and decrease in sensitive and tolerant genotypes, respectively and10% of these genes were histone producer. Findings indicate the crucial role of early responses, particularly transcription factors and epigenetic changes in cold tolerance in chickpea seedlings.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Chickpea
  • cold responses
  • gene expression
  • RNAseq
  • sequencing

مقدمه


سرما یکی از عوامل اصلی محدود کننده تولید در گیاهان زراعی محسوب می­شود. با توجه به این‌که گیاهان، قابلیت جابه­جا شدن ندارند و نمی­توانند محل زندگی خود را تغییر دهند، از طریق تغییر در الگوی بیان ژن­­ها که منجر به فرآیندهای بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی می­شود، به تنش سرما پاسخ می­دهند. گیاهان حساس، تحت تنش­ سرما خسارت می‌بینند، درحالی­که  گیاهان متحمل، قابلیت سرما سازگاری نشان می­دهند (Heidarvand & Maali-Amiri, 2013).

نخود زراعی با نام علمی .Cicer arietinum L سومین گیاه لگوم با اهمیت در دنیا می­باشد. تعداد کم کروموزوم (2n=2x=16)، اندازه ژنوم نسبتاً کوچک (Mb 740)، خودگشن بودن و چرخه تکثیر نسبتاً کوتاه، نخود را به گیاهی مناسب برای مطالعات ژنتیکی تبدیل کرده است. با توجه به مزایای تغذیه­ای و غنی سازی خاک، امروزه نخود در 52 کشور جهان، به­ویژه در نواحی خشک و نیمه خشک کشت می­شود (Varshney et al., 2009). کشت بهاره این گیاه در نواحی خشک و نیمه خشک سبب شده است تا محصول، در معرض تنش خشکی و گرمای انتهای فصل قرار گیرد و با کاهش عملکرد همراه باشد. از طرفی در کشت زود هنگام پاییزه و زمستانه، با دسترسی مطلوب­تر به آب، میزان محصول تا بیش از دو برابر افزایش می­یابد. در نتیجه، راهکار تغییر فصل کاشت از بهار به پاییز، نه تنها راهکاری در مقابله با تنش­های خشکی انتهای فصل محسوب می‌شود، بلکه با استفاده از فصل رشد طولانی، عملکرد محصول به میزان معنی­داری افزایش می‌یابد (Yadav et al., 2006; Habibpour et al., 2012). با این وجود، حساسیت گیاه نخود به تنش سرما، به‌عنوان مهم­ترین چالش در کشت­های پاییزه و زمستانه مطرح شده است. بنابراین، اجرای برنامه­های به­نژادی تحمل به تنش سرما در جهت درک سازوکار‏های دخیل در تحمل، راهبردی مهم در افزایش عملکرد این گیاه می­باشد (Heidarvand et al., 2011). شناسایی فرایندهای موثر در تحمل به سرما و انتقال این صفات، منجر به افزایش تحمل به سرما و در نتیجه افزایش سطح زیر کشت نخود در مناطق با آب و هوای سرد می­شود. بر این اساس، ارقام نخود سارال، آتا، آنا، نصرت و سعید، به‌عنوان ارقام متحمل به سرما در مناطق سردسیر و ارقام منصور، عادل، آزاد، هاشم، ثمین و آرمان، در مناطق معتدل و گرم کشت می شوند. با این وجود، برخی از این ارقام معرفی شده، با چالش­هایی روبه‌رو بوده‌اند که لزوم پژوهش­های بیشتر در جهت معرفی ارقام جدید را ضروری می­سازد. به­طور مثال، اگرچه رقم سارال از تحمل مطلوبی به سرما برخوردار است اما دانه­ ریز است که موجب کاهش تقاضا برای کشت و بازارپسندی آن‌شده است.

پاسخ­ گیاهان به تنش سرما به دو گروه زودهنگام و دیرهنگام دسته­بندی می­شود (Schade et al., 2004; Yun et al., 2010). پژوهش­های پیشین نشان داده است که روش­های اندازه­گیری سریع و کوتاه مدت می­تواند نتایج قابل اعتماد و موثری تولید نماید و در غربال­گری سریع مواد گیاهی تحت تنش سرما مفید باشد. این پاسخ­ها، بیانگر سرعت پاسخ­دهی و آمادگی گیاه است و عامل تعیین کننده در چگونگی ارائه پاسخ­های دیرهنگام می­باشد (Heidarvand & Maali-Amiri, 2013)، بنابراین به زنده‌مانی گیاه در تنش­های طولانی مدت کمک خواهد کرد (Hannah et al., 2005). تنش سرما سبب افزایش غلظت گونه­های فعال اکسیژن[1] (ROS) مانند پراکسید هیدروژن (H2O2) در گیاهان می‌شود و بدین ترتیب، بروز تنش اکسیداتیو[2] را به‌عنوان یک تنش ثانویه در پی دارد که سبب القا پراکسیداسیون چربی­های غشایی (MDA[3]) و نشت الکترولیتی غشا (ELI[4]) می­شود. با وجود اثرات مخرب، ROSها به عنوان مولکول‌های پیام رسان ثانویه[5]، در بسیاری از فرآیندهای سلولی از ­جمله پاسخ به تنش‌های سلولی شناخته شده‌‌اند. این‌که ROSهای سلولی به­عنوان مولکول‌های پیام­رسان عمل کنند و یا این‌که موجب خسارت اکسیداتیو به سلول‌ها شوند، بستگی به تعادل در تولید ROS و سیستم‌های حفاظتی و حذف کننده آن­ دارد که در اثر فعالیت ژن­ها ایجاد می­شوند (Wu et al., 2014).

درک سازوکار­های مولکولی فعال و شناسایی ژن­های کاندید تحمل به سرما، پیش­نیاز روش­­های اصلاح مولکولی و مهندسی ژنتیک تحت تنش سرما تلقی می­شود (Heidarvand & Maali-Amiri, 2010; Heidarvand & Maali-Amiri, 2013). تاکنون ژن­های متعددی به کمک روش­های مولکولی، در پاسخ به تنش­های محیطی در گیاه نخود شناسایی شده‌اند اما هنوز پژوهش­های انجام شده برای درک سازوکار­های مولکولی تحت تنش سرما قابل توجه نیستند. با استفاده از روش دورگ­گیری افتراقی[6]، تعداد 101 رونوشت پاسخ­دهنده به تنش دهیدراسیون در گیاه نخود شناسایی شدند (Boominathan et al., 2004). همچنین 210 ژن در پاسخ به تنش سرما در گیاه نخود، با استفاده از تکنیک ریزآرایه[7] شناسایی شدند (Mantri et al., 2007). اگرچه این مطالعات تا حدودی به درک ما از پاسخ به تنش سرما در گیاه نخود کمک می­کند، اما به­دلیل عدم دسترسی به ژنوم/ترانسکریپتوم رفرنس در نخود، اطلاعات ارائه شده محدود است و در بررسی پاسخ کل ژنوم از طریق تغییر بیان ژن، محدودیت داشته­اند. دسترسی به اطلاعات ذکر شده در نخود و روش­های توالی­یابی نسل جدید (NGS)[8]، امکان مطالعه کل ترانسکریپتوم را در بافت و زمان خاص فراهم کرده است (Garg et al., 2011; Jain et al.,2013; Varshney et al., 2013). توانایی روش توالی­یابی RNA (RNA-seq)[9] برای تعیین تعداد رونوشت­های کل ژنوم، در مطالعات زیادی به اثبات رسیده است (Pertea1 et al., 2016)؛ بنابراین استفاده از روش RNA-seq می­تواند به درک بیشتر ما از پاسخ گیاه نخود به تنش سرما کمک کند. Garg et al. (2015) پاسخ نخود دسی را در پنج ساعت اول تنش سرما، با استفاده از تکنیک RNAseq و پلت فرم Illumina بررسی کردند. نتایج نشان داد که 4145 ژن در پاسخ به تنش سرما بیان معنی­دار داشتند. به‌علاوه، این ژن­ها متعلق به گروه فاکتورهای رونویسی، ژن‏های مرتبط با فسفریلاسیون، متابولیت­های ثانویه، هورمون­ها، کیتین­ها و پروتئین کینازها بودند. با این وجود، تاکنون در خصوص بررسی ترانسکریپتوم تحت تنش سرما در نخود زراعی که سطح کشت زیادی در کشور دارد، پژوهشی انجام نشده است. در تحقیق حاضر و در راستای شاخص­های فیزیولوژیکی بیوشیمیایی، پاسخ کل ترانسکریپتوم گیاه نخود زراعی متحمل و حساس به تنش سرما، با استفاده از تکنولوژی RNAseq بررسی شد. این مطالعه، چشم­انداز جدیدی را برای پاسخ مولکولی به تنش سرما در نخود مشخص خواهد کرد. در خصوص ارزیابی و شناسایی ژنوتیپ­های نخود تحت شرایط مزرعه و گلخانه تحقیقات گسترده ای توسط مولفین این مقاله انجام شده است (Heidarvand et al., 2011; Heidarvand and Maali-Amiri, 2013; Rakei et al., 2016). نتیجه این تحقیقات فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی، شناسایی یک ژنوتیپ کاندید برای تحمل به سرما بوده است. کشت پاییزه این ژنوتیپ در چند ناحیه، بیانگر تحمل مطلوب این ژنوتیپ به سرما و بهبود عملکرد در مقایسه با ژنوتیپ­های دیگر نخود بوده است. بنابراین، پژوهش حاضر که برنامه­ریزی ژنومی این ژنوتیپ را تحت تنش سرما نشان می­دهد، شروع تحقیقات در زمینه تحمل به سرمای نخود نیست، بلکه تایید کننده نتایج گذشته نیز خواهد بود.

 

مواد و روش­ها

مواد گیاهی و شرایط آزمایش

آزمایش به صورت فاکتوریل و در قالب طرح کاملا تصادفی با سه تکرار انجام شد. فاکتور اول شامل دو ژنوتیپ نخود کابلی Sel96th11439 (متحمل به سرما) و ILC533 (حساس به سرما) که از موسسه تحقیقات دیم مراغه تهیه ‌شدند و فاکتور دوم شامل تیمارهای دمایی در دو سطح شامل تنش سرما و شاهد بود. بذرها با هیپوکلریت سدیم 5/2 درصد و به مدت یک دقیقه ضدعفونی شدند و پس از شستشو با آب مقطر، بر روی کاغذ صافی، در پتری­دیش با رطوبت لازم قرار گرفتند. پتری­دیش‌ها در شرایط بدون نور و دمای 23 درجه سانتی­گراد نگهداری شدند و پس از جوانه‌زنی، گیاهچه‌ها به گلدان‌ها منتقل شدند. گلدان‌ها در اتاقک‌ رشد آزمایشگاه گروه زراعت و اصلاح نباتات پردیس کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه تهران، با نور 200 میکرومول بر مترمربع بر ثانیه و شرایط نوری 16 ساعت روز و هشت ساعت شب و دمای 23 درجه سانتی­گراد و رطوبت نسبی 75 درصد قرار داده شدند. جهت بررسی پاسخ‌های گیاهی به تنش سرما، در روز بیست و یکم، گیاهچه­ها به اتاقک رشد با دمای چهار درجه سانتی­گراد منتقل شدند. در بررسی پاسخ‌های زودهنگام گیاه نخود، چهار نمونه جهت توالی­یابی ارسال شد که از هر نمونه، سه تکرار (شامل سه تکرار بیولوژیک) در نظر گرفته شد. نمونه‌گیری در روز اول تنش سرما (24 ساعت پس از شروع تنش) انجام گرفت و نمونه گیری برای آزمایش‌های فیزیولوژیکی و اندازه‌گیری های RNAsec، به صورت جداگانه ولی همزمان صورت گرفت.

استخراج و سنجش فعالیت پراکسید هیدروژن (H2O2)

میزان 35/0 گرم نمونه برگی، با نیتروژن مایع در هاون چینی به پودر تبدیل شد. پودر تهیه شده به فالکون 15 میلی‌لیتری انتقال یافت و سپس پنج میلی‌لیتر محلول تری‌کلرواستیک اسید یک درصد (محلول در حمام یخ) به تیوب اضافه شد و تیوب­‎‌‌ها تا یکنواخت‌ شدن نمونه‌ها، در حمام یخ قرار داده ‌شدند. تیوب حاوی نمونه یکنواخت شده، به مدت  15 دقیقه و در دمای چهار درجه سانتی­گراد، با سرعت × g 12000 سانتریفوژ شد. سپس 5/0 میلی‌لیتر از مایع رویی به یک تیوب جدید حاوی یک میلی‌لیتر محلول یک مولار یدید پتاسیم و 5/0 میلی‌لیتر بافر فسفات 10 میلی‌مولار افزوده شد و پس از چندبار وارونه کردن تیوب در محیط تاریک برای یکنواخت نمودن محتوی آن، مقدار جذب هر نمونه در طول موجnm  390 اندازه‌گیری شد (Loreto & Velikova 2001).

اندازه ­گیری میزان پراکسیداسیون سلولی بر اساس مالون دی آلدهید

میزان پراکسیداسیون ژنوتیپ­های نخود، بر اساس تجمع مالون دی آلدهید برگ و با استفاده از تیوباربیتوریک اسید تعیین شد (Heath & Packer, 1968). میزان 300 میلی­گرم نمونه برگی در پنج میلی لیتر بافر استخراج (1/0 مولار Tris-Hcl، 6/7=pH حاوی NaCl) کوبیده شد تا یک محلول یکنواخت به‌دست آید. سپس سه میلی لیتر از این محلول با دو میلی لیتر محلول تیوباربیتوریک اسید، حاوی اسید تری کلرواستیک در لوله آزمایش مخلوط شد و در حمام آب جوش (100 درجه سانتی­گراد) به مدت 30 دقیقه قرار گرفت. پس از سانتریفوژ با × g 12000 و به‌مدت 10 دقیقه، چگالی نمونه در طول موج 532 نانومتر در دستگاه اسپکتروفتومتر (Shimadzu UV-160, Japan) تعیین شد. غلظت مالون دی­آلدهید، بر اساس فرمول زیر محاسبه شد که در آن، D: چگالی و E: ضریب تمایز مولار (مول/سانتی‌متر 105×56/1) است.

 

اندازه‌گیری تحمل سرما بر اساس شاخص نشت الکترولیتی غشا (ELI)

میزان 80 میلی‌گرم برگ‌ نخود، به لوله آزمایش حاوی ده میلی لیتر آب مقطر انتقال یافت. جهت جذب بهتر آب، هوای درون محیط با استفاده از پمپ خلا خارج شد و لوله‌های آزمایش به مدت سی دقیقه در دستگاه شیکر قرار گرفتند. سپس میزان نشت الکترولیتی نمونه‌ها (EC1) با استفاده از دستگاه EC متر (Inolab، آلمان) خوانده شد و میزان نشت الکترولیتی نمونه‌ها (EC2)  پس از 10 دقیقه قرار گرفتن در حمام آب جوش (95 درجه سانتی­گراد) و 30 دقیقه قرارگیری در دستگاه شیکر تعیین شد و در نهایت، میزان شاخص خسارت، بر اساس فرمول زیر محاسبه شد (Popov et al., 2005).

I= EC1/EC2*100

آزمایش توالی­یابی RNA-Seq

استخراج RNAبه­کمک روش بایوزول[10]

بررسی کمیت و کیفیت RNA توسط نانودراپ، ژل آگارز و Bioanalyser انجام شد. برای توالی‏یابی از Ion Proton استفاده شد و توالی­هایی با طول 600 تا 700 جفت باز، تولید شدند.کیفیت خوانش­ها (reads) توسط QC-Ion-torrent suite & quadtrium مورد بررسی قرار گرفت و  Mapping توالی­ها به‌وسیله Tophat (v 2.1.1) (Trapnell et al., 2009) و Bowite2 (Langmead & Salzberg, 2012) و با استفاده از ژنوم مرجع نخود (Varshney et al., 2013) انجام شد. توالی پروتئوم نخود موجود در پایگاه داده NCBI به‌عنوان مرجع برای ارزیابی سرهم‌بندی استفاده شد.

شناسایی ژن­های با تغییر بیان (DEGs) از طریـق محاسـبه تعـداد قطعـات نقشه­یابی شده یک رونوشت خاص در بین کتابخانه­های مختلـف صورت گرفت و برای نرمال‌سازی از تکنیک TMM (Trimmed mean of M-values) استفاده شد (Robinson and McCarthy, 2010). شمارش خوانش­ها به­وسیله HTSEQ (Anders et al., 2014) و مقایسه بیان ژن توسط برنامه برخط EdgeR و با استفاده از نرم‌افزار (V 3.5) R اجرا شد (Robinson et al., 2010). همچنین برای شناسایی ایزوفرم‌ها با بیان مختلف، از Cuffdiff  استفاده  شد (Trapnell et al., 2010).

 

نتایج و بحث

بررسی الگوی تغییر ROS (در این مطالعه محتوی H2O2)، احتمالا برخی از سازوکار‌های تحمل به تنش سرما را در گیاه نخود مشخص کرده است. همچنین میزان H2O2  می‌تواند نشان‌دهنده درجه آسیب ایجاد شده توسط تنش سرما نیز باشد (Heidarvand & Maali-Amiri, 2013). تنش سرما بر الگوی تغییر H2O2 تاثیر داشت، به­طوری­که تفاوت معنی­داری بین ژنوتیپ­ها و اثر متقابل آن­ها مشاهده شد. بیشترین میزان H2O2(4/111 میلی­گرم بر وزن تر) در شرایط تنش، در ژنوتیپ حساس و کمترین مقدار آن، در ژنوتیپ متحمل در تیمار شاهد (34/74 میلی­گرم بر وزن تر) مشاهده شد. اختلاف معنی­داری بین H2O2تجمع یافته در ژنوتیپ حساس، بین دو تیمار شاهد و تنش مشاهده شد، درحالی‌که در ژنوتیپ متحمل، این اختلاف معنی­دار نبود. این نتایج نشان­دهنده تفاوت در درجه پاسخ ژنوتیپ­ها به تنش سرما بود که این مساله، بیانگر ظرفیت ژنتیکی ژرم­پلاسم نخود تحت شرایط محیطی می­باشد (شکل A1).

غلظت مالون­دی­آلدهید، به‌عنوان شاخص تنش اکسیداتیو وارد شده به چربی­های غشا طی تنش سرما اندازه­گیری شد. اختلاف معنی­داری بین غلظت مالون‌دی­آلدهید تولید شده در دو ژنوتیپ تحت تنش سرما مشاهده شد. نتایج نشان داد که پراکسیداسیون غشا در هر دو ژنوتیپ با کاهش دما افزایش یافت و در ژنوتیپ حساس در تیمار تنش سرما، بعد از یک روز، به حداکثر مقدار (با میانگین23/4 میکرومول در گرم وزن تر) رسید (شکل B1). کمترین میزان غلظت مالون‌دی­آلدهید نیز در ژنوتیپ متحمل در تیمار شاهد مشاهده شد. تولید مالون‌دی­آلدهید، حاصل تجزیه زنجیره چربی­های غیر اشباع در اثر فعالیت­های آنزیمی و غیر آنزیمی تحت تنش سرما رخ می­دهد (Nejadsadeghi et al., 2014). توانایی یک ژنوتیپ برای ایجاد تعادل بین آنزیم­های تبدیل کننده اسید چرب اشباع به غیر اشباع، عامل مهمی در کاهش پراکسیداسیون لیپیدهای غشا و در نتیجه افزایش تحمل به سرما است که با توجه به نتایج، ژنوتیپ متحمل در مقایسه با ژنوتیپ حساس، درجه تحمل بالاتری نشان ­داد.

ژنوتیپ­های نخود از نظر درصد نشت الکترولیت­ها نیز با یکدیگر اختلاف معنی­دار داشتند، به­طوری­که بیشترین درصد نشت الکترولیتی را ژنوتیپ حساس (9/42 درصد) در تنش سرما به خود اختصاص داد و ژنوتیپ متحمل نیز در تیمار شاهد کمترین میزان (4/27 درصد) نشت را نشان داد (شکل C1). با کاهش دما، میزان نشت الکترولیت در هر دو ژنوتیپ افزایش یافت اما شیب افزایش نشت در دو ژنوتیپ متفاوت بود که احتمالا ناشی از تفاوت آن­ها در میزان تحمل به دماهای پایین است. این امر نشان می­دهد که در شرایط تنش، سرعت نشت الکترولیت در ژنوتیپ­ متحمل در مقایسه با ژنوتیپ­ حساس، کمتر بود. افزایش در نشت الکترولیت­ها تحت تنش سرما، در اثر اختلال در ساختار غشای سلولی می­باشد که حاصل این تغییرات، کاهش سیالیت و انسجام غشاها و غیر فعال شدن آن می­باشد (Heidarvand & Maali-Amiri, 2010).

 

 

 

نتایج مطالعات فیزیولوژیکی بیوشیمیایی نشان داد که شاخص­های خسارت سلولی، از یک طرف ممکن است به‌عنوان نشانگری آگاهی­بخش در ارزیابی تحمل به تنش سرما در ژنوتیپ­های نخود مفید باشند و از طرف دیگر، بررسی این شاخص­ها در بسیاری موارد ممکن است به­طور غیرمستقیم، میزان فعالیت سیستم­های دفاعی گیاه را نیز نشان دهند. بنابراین و بر اساس نتایج، به‌نظر می­رسد که سیستم­های دفاعی گیاهان متحمل در مقایسه با گیاهان حساس، پاسخ­های مطلوب­تری به تنش سرما نشان دادند. به‌منظور بررسی چنین فرضیه­ای، الگوی ترانسکریپتوم این دو ژنوتیپ تحت تنش سرما، به کمک تکنولوژی RNA-seq  بررسی شد.

تجزیه و تحلیل داده­های حاصل از بیان ژن،‏ به‌کمک RNAseq نشان داد که تحت تنش سرما، در ژنوتیپ متحمل در مقایسه با گیاهان شاهد (بدون تنش سرما)، 526 ژن تغییر بیان معنی­دار داشتند، به­طوری که  261 و  265 ژن، به­ترتیب افزایش و کاهش بیان معنی­دار داشتند (جدول 1).

 

 

جدول 1- پاسخ ژن‏های بررسی شده تحت تنش سرما در ژنوتیپ متحمل (Sel96Th11439) و حساس (ILC 533) نخود زراعی.

Table 1. Response of genes expression in tolerant (Sel96Th11439) and susceptible (ILC 533) genotypes under cold stress.

Down-regulated

genes

Up-regulated

genes

Modified genes number

Gene numbers

Genotypes

265

261

526

15924

Sel96Th11439

606

295

901

15595

ILC 533

 

 

تحت چنین شرایطی در ژنوتیپ حساس، 901 ژن تغییر بیان معنی­دار نشان دادند که  295 و 606 ژن، به­ترتیب افزایش و کاهش بیان معنی­دار داشتند. بنابراین ژن‏های با بیان کاهشی، فراوانی بیشتری در مقایسه با ژن‏های با بیان افزایشی در هر دو ژنوتیپ‏ نخود داشتند (شکل 2). این نتایج نشان می­دهد که تنش سرما احتمالا سبب کاهش سوخت و ساز و فعالیت سلول‏ها در گیاهچه نخود شده است؛ پاسخ­های مولکولی که منجر به اختلال در فتوسنتز و کاهش تنفس می­شود. چنین پاسخ­هایی می­توانند به‌عنوان ویژگی گیاهان حساس به تنش سرما از جمله نخود معرفی شوند (Longo et al., 2017).

در مطالعات اخیر، بالاتر بودن فراوانی ژن‏های با بیان کاهشی تحت تنش­های غیر زیستی از جمله تنش سرما در بادام (Mousavi et al., 2014)، تنش دهیدراسیون در سویا (Belamkar et al., 2014) و تنش خشکی در Haloxylon ammodendron (Long et al., 2014) گزارش شده است. نتایج مطالعه Wu et al.  (2014) بر روی Ammopiptanthus mongolicus تحت تنش سرما و خشکی نشان داد که با طولانی شدن زمان تنش، فراوانی ژن‏های با بیان کاهشی افزایش می­یابد. با این وجود، نتایج پژوهش در نخود نشان داد که پاسخ­های تحمل در ژنوتیپ Sel96Th11439 در مقایسه با ژنوتیپ   ILC533 متمایز بوده است که گویای نوعی پاسخ اولیه تحمل به تنش سرما می­باشد. چنین نتایجی، به‌وجود تنوع و ظرفیت ژنتیکی در جمعیت­های گیاهی نخود تحت تنش سرما اشاره کرده است؛ تفاوت­هایی که احتمالا به تمایز پاسخ­ها در میزان خسارت­های سلولی منجر شده است (Heidarvand &Maali-Amiri, 2013). بنابراین در بسیاری از موارد، کاهش بیان ژن در ژنوم، دلیل بر خسارت و اختلال در فرآیند نیست. از آن‌جا که تحت تنش سرما، میزان انرژی سلول در اثر کاهش سوخت و ساز و فتوسنتز کاهش می­یابد، سلول در جهت صرفه­جویی در مصرف انرژی، تنها به تولید پروتئین­هایی اقدام می­کند که در جهت افزایش توان دفاعی و کاهش خسارت فعالیت می­کنند. بنابراین کاهش بیان اغلب ژن‏های غیر ضروری تحت تنش، پاسخی هوشمندانه سلول در نظر گرفته می­شود (Kundu et al., 2018).  

در مقایسه ژن‏های تغییر بیان یافته در ژنوتیپ‏های حساس و متحمل، تنها یک ژن با بیان کاهشی مشترک وجود داشت. از تفاوت­های بارز ژنوتیپ متحمل و حساس، الگوی بیان متمایز آن­ها در پاسخ­های زودهنگام می­باشد، به­طوری­که ژنوتیپ متحمل، پاسخ­های زودهنگام مطلوبی به تنش سرما نشان داد.

 

شکل 2- ژن‏های تغییر بیان یافته در ژنوتیپ‏های حساس (ILC533) و متحمل (Sel96Th11439) نخود زراعی تحت تنش سرما. ژن‏های با بیان افزایشی در ژنوتیپ متحمل (Tolerant-OE)، ژن‏های با بیان افزایشی در ژنوتیپ حساس (Sensitive-OE)، ژن‏های با بیان کاهشی در ژنوتیپ متحمل (Tolerant-DE) و ژن‏های با بیان کاهشی در ژنوتیپ حساس (Sensitive-DE) نمایش داده شده است.

Figure 2. Differential gene expression in chickpea tolerant and sensitive genotypes under cold stress. Up-regulated genes in tolerant and sensitive genotypes (Tolerant-OE and Sensitive-OE, respectively) and Down-regulated genes in tolerant and sensitive genotypes (Tolerant-DE and sensitive-DE, respectively) have been shown.

 

 

برای مشخص شدن نحوه پاسخ مطلوب ترانسکریپتوم نخود، ژن‏هایی که در یک ژنوتیپ، افزایش و در ژنوتیپ دیگر، کاهش بیان داشتند بررسی شدند. تجزیه و تحلیل داده­ها نشان داد که تحت تنش، 216 ژن در ژنوتیپ متحمل افزایش بیان یافتند، درحالی­که در ژنوتیپ حساس، بیان این ژن­ها کاهش یافت (شکل 2). از جمله ژن‏هایی که در پاسخ­های اولیه گیاه، تغییر بیان داشتند، گروه ژن‏های فاکتورهای رونویسی (TF[11]) و ژن‏های دخیل در مسیرهای پیام­رسانی هستند (Usadel et al., 2008; Garg et al., 2015). میزان 7/13 درصد ژن‏هایی که در ژنوتیپ متحمل و  حساس، به‌ترتیب افزایش و کاهش بیان نشان داشتند، از گروه TFs، شامل فاکتورهای رونویسیNAC، Zinc finger، WRY، APR، bHLH130 و MYB بودند. نقش مهم TFs در پاسخ به تنش­های غیر زنده و همچنین تغییر بیان آن­ها در پاسخ به تنش سرما، قبلاً گزارش شده است (Ray et al., 2011; Priya & Jain, 2013). CBF1، CBF2 و CBF3 متعلق به دمن­های[12] خانواده AP2/ERF متصل به DNA هستند و خانواده­های AP2، در پاسخ به تنش­های غیر زیستی نقش دارند (Liu et al., 1998; Mizoi et al., 2012). پروتئین­های Zinc-finger باعث تحمل به تنش­های غیر زیستی می­شوند (Davletova et al., 2005). به­علاوه چندین TF از خانواده­های NAC و MYB در پاسخ به تنش­های غیر زیستی در گیاهان شناسایی شده­اند (Nakashima et al., 2012; Bhattacharjee & Jain, 2013).  تغییر بیان TFs در برنامه­ریزی دوباره ترانسکریپتوم در ژنوتیپ متحمل ممکن است در درک و انتقال پیام تنش سرما و فعال­سازی مسیرهای دفاعی دخالت داشته باشد و منجر به سازگاری گیاه و حفاظت در برابر تنش سرما ­شود. چنین پاسخ­های زودهنگام گیاهان متحمل تحت تنش سرما، اغلب از گیاهان حساس متمایز است و مرتبط با درک و پیام­رسانی جهت القای بیان ژن­های درگیر در مسیر متابولیسمی، دفاعی و فتوسنتز می­باشد (Garg et al., 2015). افزایش بیان غیر معنی­دار H2O2در ژنوتیپ متحمل، احتمالا می­­تواند عاملی در فعالیت مسیر سیگنالینگ تنش سرما و القای ژن­های پاسخ به تنش باشد. افزایش بیان ژن­های فاکتور رونویسی، تایید کننده این نتایج می­باشد. با این وجود، به علت توان ژنتیکی محدود در ژنوتیپ حساس، افزایش معنی­دار H2O2نتوانست سبب القا فعالیت این مسیرها و پاسخ­های تنش شود، به‌طوری‌که چنین سلولی، قادر به مهار ROS نیست و بقا آن تضمین نمی­شود.

نتایج نشان داد که ژن‏های دخیل در مسیر سنتز هورمون­ها، در ژنوتیپ متحمل افزایش و در ژنوتیپ حساس، کاهش بیان داشتند. ژن‏های
 Ethylene-responsive transcription factor
(در مسیر سنتز اتیلن) (Stockinger et al., 1997) (Caarls et al., 2017) وindole-3-acetic acid-induced protein ARG2و Auxin-induced protein (در مسیر سنتز اکسین) از آن­ جمله هستند

(Jain & Khurana, 2009; Shi et al., 2017). هورمون­های اتیلن، سالیسیلیک اسید (SA) و آبسیزیک­اسید (ABA) در درک و تنظیم پاسخ به تنش سرما نقش دارند (Atici & Nalbantoglu, 2003). همچنین، پیشنهاد شده است که برهم­کنش بین ABA، اکسین و اتیلن برای سازگاری یک بافت خاص یا کل گیاه به تنش­های محیطی، بسیار مهم است. اکسین در افزایش طول ساقه نقش دارد؛ به­طوری­که کاهش بیان ­ژن‏های مسیر متابولسیم اکسین ممکن است با کاهش طول ساقه در ژنوتیپ حساس تحت تنش سرما در ارتباط باشد. بنابراین به­نظر می­رسد که طی تنش سرما، رشد و نمو ژنوتیپ حساس احتمالاً محدود شود
(Park & Han, 2003). افزایش بیان ژن­های مسیر هورمون­های ذکر شده، بیانگر نوعی سازگاری نسبی در ژنوتیپ متحمل می­باشد. بر این اساس و تحت چنین شرایطی، به­دلیل فعالیت بیشتر سازوکار­های دفاعی، گیاه دچار خسارت اکسیداتیو نمی‌شود؛ بنابراین شرایط رشد همچنان می­تواند ادامه یابد. با این وجود، در این تحقیق، طول دوره سرمادهی کوتاه بود؛ بنابراین اگر دوره تنش طولانی و شدت آن کاهش یابد، احتمالاً طول ساقه ژنوتیپ متحمل، تغییراتی نشان خواهد داد،  به­طوری که طول ساقه در ژنوتیپ متحمل بیشتر خواهد شد.

 آنزیم­های مسیر لیگنین و تولید متابولیت­های ثانویه نیز در ژنوتیپ متحمل و حساس، به‌ترتیب افزایش و کاهش بیان داشتند. آنزیم­های مسیر فنیل پروپانوئید که منجر به تولید ترکیبات فنلی می­شود، از جمله نخستین پاسخ­های گیاهان به شرایط تنش می­باشند (Khaledian & Maali-Amiri, 2015 Wen et al., 2008;). متابولیت­های ثانویه و ازجمله این ترکیبات گفته شده، در تحمل و  سازگاری به تنش­های غیر زیستی نقش دارند (Jain 2013; Davies et al., 2018). از میان ژن‏های دفاعی، ژنCinnamoyl-CoA reductase  از آنزیم­های کلیدی در بیوسنتز لیگنین است. سنتز لیگنین در دیواره سلولی می­تواند باعث تقویت دیواره سلولی در مقابله با تنش­های زیستی و غیر زیستی شود (Khaledian & Maali-Amiri, 2015; Smith et al., 2017 Wen et al., 2008;). افزایش بیان ژن Glycine-rich cell wall proteinنشان داد که با افزایش سنتز لیگنین در ژنوتیپ متحمل و کاهش آن در ژنوتیپ حساس، احتمالاً مسیر متابولیتی گیاه به سمت تقویت دیواره سلولی سوق می­یابد.

 ژن putative 12-oxophytodienoate reductase که در سنتز متابولیت­های مسیر اکسی­لیپین نقش دارد (Schaller et al., 2000) نیز در ژنوتیپ متحمل افزایش و در ژنوتیپ حساس کاهش بیان نشان داد. تجزیه و تحلیل موتاسیون­ها در آرابیدوپسیس نشان داد که اکسی‌لیپین به عنوان مولکول پیام­رسان در گیاه فعالیت می‌کند و در تحمل به تنش نقش دارد (Böttcher & Pollmann, 2009; Grebner et al., 2013).

 افزایش بیان ژن‏های Pathogenesis-related protein شامل  Dehydrin DHN3-like، Pathogenesis-related protein PR-4-like، Cationic peroxidase 2-like،Cationic peroxidase 2-like، Peroxidase P7-like، Polyphenol oxidase و Polygalacturonase  inhibitor که جزء سیستم دفاعی محسوب می­شوند نیز در ژنوتیپ متحمل مشاهده شد. پژوهش­ها نشان داده که دهیدرین­ها (DHNs) به عنوان تنظیم کننده­های اسمزی و همچنین به‏عنوان حذف کننده رادیکال­های آزاد اکسیژن فعالیت دارند (Hara et al., 2003). همچنین DHNs، احتمالا به عنوان ناقلان یونی فعالیت می‌کنند و آسیب­های غشایی جدی ناشی از افزایش غلظت یون­ها در طول تنش دهیدراسیون در سیتوپلاسم را کاهش می­دهند (Hara et al., 2005). القای ژن‏های Pathogenesis-related protein نیز در پاسخ به تنش­­های غیر زیستی گزارش شده است (Seki et al., 2002) اما به‌دلیل پیچیدگی پاسخ­های گیاهی تحت تنش سرما، نقش آن­ها کاملاً مشخص نیست. Cationic peroxidases که به عنوان ژن‏های Pathogenesis-related proteinشناسایی شده‌اند، طی تنش سرما در ژنوتیپ متحمل القا می‌شوند و در تحمل به تنش سرما نقش دارند (Llorente et al., 2002).

دو ایزوفرم ژن Gluthatione S-transferase (GST) در ژنوتیپ متحمل افزایش و در ژنوتیپ حساس کاهش بیان داشتند. اعتقاد بر این است که این ژن، به‌عنوان آنتی­اکسیدان عمل می‌کند و در حذف رادیکال­های آزاد اکسیژن نقش دارد. در آرابیدوپسیس در پاسخ به تنش سرما و شوری، دو رونوشت GST افزایش بیان داشتند و در همان حال، سه رونوشت GST کاهش بیان نشان دادند. به‌نظر می­رسد که تغییرات متفاوت ایزوفرم­های این ژن، امکان بروز طیفی از پاسخ­ها را در برابر تنش فراهم می­سازد  (Seki et al., 2002)

ژن‏های دخیل در سنتز و افزایش استحکام دیواره سلولی مانند Expansin-like A2 و Cellulose synthase-like protein E1 در ژنوتیپ متحمل افزایش و در ژنوتیپ حساس کاهش بیان نشان داشتند. نقش فیزیکی و ضخامت دیواره سلولی گیاهان در تحمل به تنش سرما به اثبات رسیده است (Abuqamar et al., 2014 Yin et al., 2009;)، نتایج مربوط به سنتز متابولیت­ها در مسیر لیگنین نیز این نتایج را تایید می­کند. احتمالاً افزایش استحکام دیواره سلولی، بخشی از سازوکار نخود برای افزایش تحمل به سرما است.

ژن‏های­Galactinol-sucrose galactosyltransferase، Sugar transport protein، Sugar transporter و Beta-amylaseکه در مسیر کربوهیدرات­ها نقش دارند، در ژنوتیپ متحمل و حساس، به‌ترتیب افزایش وکاهش بیان نشان دادند. کربوهیدرات­های محلول، علاوه بر نقش اسمولیت­های سازگار برای گیاه، می­توانند انرژی مورد نظر گیاه را طی دوره تنش سرما تامین کنند. مسیرهای سیگنالینگ قند نیز فرآیند­های سازگاری گیاه به سرما را تنظیم می­کنند. قندها غلظت اسمولیت‌های درون سلولی را افزایش  و در نتیجه نقطه انجماد سیتوپلاسم را کاهش می­دهند. در کلروپلاست نیز نشاسته به‌وسیله بتا آمیلاز در تولید مالتوز، هیدرولیز می­شود (Kaplan et al., 2004). سازگاری به تنش، فرایند پیچیده‌ای است و سیگنال­دهی کربوهیدرات­ها در این مسیر، نقش مهمی در پاسخ به تنش­های محیطی ایفا می­کند (Rekarte-Cowie et al., 2008). با تغییر میزان قندها در شرایط تنش، گیاهان می­توانند از آن­ها در سیگنال­دهی مربوط به تنظیم رشد و نمو استفاده کنند. به­طور مثال، ساکارز باعث القای پروموتور COR78[13] شده است (Rekarte-Cowie et al., 2008). موتانت gin6 گلوکز در آرابیدوپسیس، از بیان فاکتور رونویسی ABI4 که در مسیر پاسخ به ABA نقش دارد جلوگیری می­کند (Arenas-Huertero et al., 2000). در فرآیند سرما سازگاری، کربوهیدرات­ها از جمله ساکارز و رافینوز در گیاهان تجمع می­یابند؛ بنابراین ژن‏های متابولیسم کربوهیدرات­ها با توجه به‌نقشی که در ساخت، متابولیسم و انتقال کربوهیدرات­ها دارند، به دمای پایین پاسخ می‌دهند (Kaplan & Guy, 2004; Rekarte-Cowie et al., 2008; Shahryar & Maali-Amiri, 2016) و به عنوان سیگنال مولکولی می­توانند بیان برخی ژن‏های COR مانند Beta-amylase را تنظیم کنند (Kaplan & Guy, 2004). 

از ژن­های مهم دیگر در مسیر کربوهیدرات­ها، ژن
 Beta-glucosidase 24-like است که در ژنوتیپ متحمل و حساس، به‌ترتیب افزایش و کاهش یافت. با این وجود، ژن Beta-glucosidase 12-like با افزایش در ژنوتیپ متحمل و عدم تغییر معنی­دار در ژنوتیپ حساس همراه بود؛ این دو ژن، دی­ساکارید­ها را به مونوساکارید تبدیل می­کنند. احتمالاً ژنوتیپ متحمل ترجیح می­دهد که از مونوساکاریدها به عنوان اسمولیت­ برای تحمل به سرما استفاده کند. در تحقیقات مختلف، القای ژن‏های  Beta-glucosidase تحت تنش غیرزنده گزارش شده است (Seki et al., 2002; Khazaei et al., 2015). این پروتئین باعث آزادسازی گلوکز از ABA-glucose می‌شود، به­طوری که ABA از حالت غیر فعال، به فعال تبدیل می‌شود و بنابراین می­تواند بیان ژن­های دفاعی را فعال کند (Sun et al., 2015).

نکته جالب آن است که ژن α-α-trehalose-phosphate synthaseکه در ساخته شدن ترهالوز نقش دارد، در ژنوتیپ حساس افزایش بیان و در ژنوتیپ متحمل کاهش بیان معنی­دار داشت. به­نظر می­رسد که ژنوتیپ حساس در تنش سرما، بیشتر از فرم قندی ترهالوز به عنوان اسمولیت استفاده می‌کند، درحالی­که ژنوتیپ متحمل، تمایل کمتری به استفاده از ترهالوز به عنوان اسمولیت در شرایط تنش سرما نشان می­دهد. قبلاً کاهش بیان ژن ترهالوز در ژنوتیپ متحمل نخود (Mantri et al., 2007) گزارش شده است. بیان این نکته ضروری است که ژن Probable α-α-trehalose-phosphate synthaseرفتار معکوسی تحت تنش سرما در این آزمایش  نشان داد که بیانگر نقش ایزوفرم­های متفاوت ژن‏های ترهالوز در شرایط تنش سرما است. 

در مسیر سنتز لیپید، بیان ژن‏های Fatty acid desaturase  4 و Fatty acyl-CoA reductase 3-like کلروپلاستی نیز افزایش یافت. افزایش معنی­دار مالون‌دی­آلدهید و نشت الکترولیتی غشا به موازات افزایش معنی­دار H2O2 در ژنوتیپ حساس در مقایسه با ژنوتیپ متحمل، تاییدکننده فعالیت محدود ژن­های دخیل در حفظ ساختار غشا از جمله دساتورازها می­باشد. افزایش بیان ژن‏هایی که در سنتز لیپیدها و  فسفولیپیدها نقش دارند، به پایداری غشا تحت تنش سرما کمک می­کند (Gigon et al., 2004; Upchurch, 2008). انتقال گیاهان به دمای صفر تا چهار درجه سانتی­گراد، باعث تغییر در ترکیبات لیپیدی و سیالیت غشا می‌شود (Somerville & Browse, 1996) و منجر به تغییر در بیان ژن‏­هایی می­شود که خصوصیات فیزیکی غشایی پلاسمایی را تغییر می­دهند. تولید سیب­زمینی­ و E.coli تراریخته با ژن delta-12 acyl lipid desaturase  باعث افزایش اسیدهای چرب غیراشباع بیشتر و بهبود تحمل به تنش سرما شده است (Maali et al., 2007; Maali et al., 2010).

تغییرات پس از ترجمه[14]، نقش اساسی در تعیین عملکرد و پایداری پروتئین­ها دارند. فسفریلاسیون، یکی از مهم­ترین تغییرات پس از ترجمه است که موجب انتقال پیام در تنش­های غیر زیستی می­شود (Tanaka et al., 2012; Liu et al., 2013; Osakabe et al., 2013). افزایش ژن‏های مرتبط با فسفریلاسیون در ژنوتیپ متحمل و کاهش آن­ها در ژنوتیپ حساس در روز اول تنش سرما، احتمالاً با توانایی بیشتر ژنوتیپ متحمل در درک تنش­های محیطی در ارتباط است.

در این آزمایش و تحت تنش سرما، 31 ژن به‌طور معنی­داری در ژنوتیپ حساس، افزایش بیان و در ژنوتیپ متحمل، کاهش بیان داشتند؛ هیستون­ها تقریباً 10 درصد از این ژن‏ها بودند. همچنین ژن  SNF2 domain-containing protein بدون تغییر معنی­دار در ژنوتیپ متحمل، در ژنوتیپ حساس افزایش بیان یافت. تغییر معنی­دار در بیان هیستون­ها و ژن‏های دخیل در فرآیندهای اپی­ژنتیکی و فراساختار کروموزومی، احتمالاً تا انداز­ه­ای بیانگر پاسخ زودهنگام ژنوتیپ حساس به تنش سرما می‌باشد.

تعداد ژن‏هایی که در روز اول تنش سرما در ژنوتیپ متحمل و حساس کاهش بیان نشان دادند، به‌ترتیب  265 و 606 ژن بودند که نشان می­دهد فعالیت ژن‏های ژنوتیپ حساس را در مقایسه با ژنوتیپ متحمل، 3/2 برابر کاهش یافته است. این تفاوت در بیان، احتمالاً تا اندازه­ای به تغییر ساختار کروماتین، در نتیجه بیان ژن‏های هیستون و ژن‏های SNF2 domain-containing protein وابسته است. SNF2 که از خانوادهhelicase-like proteins   است، در بازآرایی مجدد کروماتین نقش دارد و تنظیم ساختار کروماتین، امکان تنظیم ژن‏های موجود در DNA را فراهم می­کند (Ryan & Owen-Hughes, 2011). گزارش شده است که تغییرات اپی­ژنتیک در پاسخ به تنش­های محیطی از جمله سرما در نخود نقش دارد (Tan, 2010; Kumar et al., 2012; Mastan et al., 2012; Rakei et al., 2015) دارد. همچنین ­ژن‏های درگیر در سنتز دیواره سلولی مانند Patellin-6-like، Proteins WALLS ARE THINو Protein trichome birefringence-like (Ranocha et al., 2010) در ژنوتیپ متحمل و حساس، به‌ترتیب کاهش و افزایش بیان نشان دادند. این نتایج نشان می­دهد که تقویت دیواره سلولی، یکی از سیستم­های دفاعی فعال در ژنوتیپ حساس تحت تنش سرما است. همچنین ژن­های دو فاکتور رونویسیbHLH در ژنوتیپ حساس افزایش بیان و در ژنوتیپ متحمل کاهش بیان نشان دادند. افزایش بیان این دو فاکتور رونویسی، تلاش ژنوتیپ حساس را در مقابله با خسارت اکسیداتیو نشان می­دهد. به­نظر می­رسد که پدیده تحمل، صفتی چندژنی است و با برآیند اثر ژن‏های متعدد در ارتباط می­باشد. بنابراین در ژنوتیپ حساس، کاهش تولید انرژی با کاهش فعالیت بیان بسیاری از ژن­ها همراه است و اگرچه سلول، تلاش می‌کند تا زنده بماند، اما به دنبال خسارت­های زیادی که در اثر ناکارآمدی سیستم­های دفاعی وارد می‌شود، احتمالاً در این شرایط از بین خواهد رفت.

 

نتیجه­ گیری کلی

نتایج بررسی­های فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی نشان داد که دو ژنوتیپ تحت تنش سرما، تفاوت معنی­داری در میزان خسارت‌های سلولی و الگوی پاسخ‌های دفاعی داشتند. بررسی شاخص­های خسارت می­تواند به‌طور غیرمستقیم به پاسخ­های دفاعی گیاه نیز اشاره کند. نظر به این‌که در پژوهش­های گذشته، شاخص­های دفاعی متعددی در این دو ژنوتیپ تحت تنش سرما بررسی شده بود، تجزیه و تحلیل ترانسکریپتوم می­تواند احتمالا تایید کننده نتایج پژوهش­های گذشته در این ژنوتیپ­ها باشد. نتایج این پژوهش­ها نشان می­دهد که ژنوتیپ متحمل با برنامه­ریزی مجدد ژنومی، پاسخ­های مطلوبتری به تنش سرما در مقایسه با ژنوتیپ حساس ارائه می­دهد که می­تواند منجر به بهبود درجه تحمل به سرما شود. ارزیابی شاخص­های خسارت که نشانگر فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی در این تحقیق معرفی می­شوند، تایید کننده این نتایج می­باشد. نتایج RNA-seq نشان داد که فاکتورهای رونویسی، بیشترین تاثیر را در پاسخ زودهنگام به تنش سرما در گیاه نخود دارند، به­طوری‌که فاکتورهای رونویسی، بیشترین درصد ژن­هایی بودند که در ژنوتیپ متحمل افزایش و در ژنوتیپ حساس کاهش بیان داشتند. همچنین تعداد زیادی از ژن مرتبط با سیستم­های دفاعی، کربوهیدرات­ها، متابولیت­های ثانویه، دیواره سلولی، هورمون­ها و فتوسنتز، در ژنوتیپ متحمل افزایش و در ژنوتیپ حساس کاهش بیان نشان دادند. به­نظر می­رسد که بخشی از عدم توانایی تحمل به تنش سرما در ژنوتیپ حساس، در اثر تغییرات کروماتینی و اپی­ژنتیکی بوده است که این نتیجه، از تعداد زیاد هیستون­های بیان شده و ژن‏های دخیل در مسیر اپی­ژنتیکی قابل استنباط است. پیشنهاد می­­شود که به­دلیل اهمیت فاکتورهای رونویسی در پیام رسانی و القای بیان ژن­های دفاعی، تحقیقات آینده تحمل نخود به سرما، روی فاکتورهای رونویسی انجام شود. شناسایی فرآیندهای تحمل به سرما و انتقال ژن­های پاسخ دهنده به تنش سرما، منجر به افزایش تحمل به سرما و در نتیجه افزایش سطح زیر کشت این گیاه در مناطق با آب و هوای سرد می­شود.

سپاسگزاری

مقاله حاضر بخشی از زحمات مرحوم آقای دکتر رحمت محمدی، دانشجوی با اخلاق و پرتلاش اینجانب است که بدین وسیله ضمن سپاس و قدردانی و یاد آن عزیز، برای ایشان آمرزش و علو درجات از خداوند بزرگ خواستارم.

 

 

 

 

REFERENCS

  1. Anders, S., Pyl, P. T. & Huber, W. (2014). HTSeq–A python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics, 31 (2), 166-169.
  2. Arenas-Huertero, F., Arroyo, A., Zhou, L., Sheen, J. & Leon, P. (2000). Analysis of Arabidopsis glucose insensitive mutants, gin5 and gin6, reveals a central role of the plant hormone ABA in the regulation of plant vegetative development by sugar. Genes & Development, 14(16), 2085-2096.
  3. Belamkar, V., Weeks, N. T., Bharti, A. K., Farmer, A. D., Graham, M. A. & Cannon, S. B. (2014). Comprehensive characterization and RNA-Seq profiling of the HD-Zip transcription factor family in soybean (Glycine max) during dehydration and salt stress. BMC Genomics, 15(1), 950.
  4. Bhattacharjee, A. & Jain, M. (2013). Transcription factor mediated abiotic stress signaling in rice. Plant Stress, 7, 16-25.
  5. Boominathan, P., Shukla, R., Kumar, A., Manna, D., Negi, D., Verma, P. K. & Chattopadhyay, D. (2004). Long term transcript accumulation during the development of dehydration adaptation in Cicer arietinum. Plant Physiology, 135(3), 1608-1620.
  6. Böttcher, C. & Pollmann, S. (2009). Plant oxylipins: plant responses to 12-oxo-phytodienoic acid are governed by its specific structural and functional properties. Federation of European Biochemical Societies Journal, 276 (17), 4693–4704.
  7. Caarls, L., Van der Does, D., Hickman, R., Jansen, W., Verk, M. C. V., Proietti, S., Lorenzo, O., Solano, R., Pieterse, C. M. & Van Wees, S. (2017). Assessing the role of ethylene response factor transcriptional repressors in salicylic acid-mediated suppression of jasmonic acid-responsive genes. Plant and Cell Physiology58(2), 266-278.
  8. Davletova, S., Schlauch, K., Coutu, J. & Mittler, R. (2005). The zinc-finger protein Zat12 plays a central role in reactive oxygen and abiotic stress signaling in Arabidopsis. Plant Physiology, 139(2), 847-856.
  9. Garg, R., Bhattacharjee, A. & Jain, M. (2015). Genome-scale transcriptomic insights into molecular aspects of abiotic stress responses in chickpea. Plant Molecular Biology Reporter, 33(3), 388-400.
  10. Garg, R., Patel, R. K., Jhanwar, S., Priya, P., Bhattacharjee, A., Yadav, G., Bhatia, S., Chattopadhyay, D., Tyagi, A. K. & Jain, M. (2011). Gene discovery and tissue-specific transcriptome analysis in chickpea with massively parallel pyrosequencing and web resource development. Plant Physiology, 156, 1661–1678.
  11. Grebner, W., Stingl, N. E., Oenel, A., Mueller, M. J. & Berger, S. (2013). Lipoxygenase6-dependent oxylipin synthesis in roots is required for abiotic and biotic stress resistance of Arabidopsis. Plant Physiology, 161, 2159-2170.
  12. Gigon, A., Matos, A. R., Laffray, D., Zuily-Fodil, Y. & Pham-Thi, A. T. (2004). Effect of drought stress on lipid metabolism in the leaves of Arabidopsis thaliana (ecotype Columbia). Annals of Botany, 94(3), 345-351.
  13. Hara, M., Fujinaga, M. & Kuboi, T. (2005). Metal binding by Citrus dehydrin with histidine-rich domains. Journal of Experimental Botany, 56(420), 2695-2703.
  14. Hara, M., Terashima, S., Fukaya, T. & Kuboi, T. (2003). Enhancement of cold tolerance and inhibition of lipid peroxidation by citrus dehydrin in transgenic tobacco. Planta, 217(2), 290-298.
  15. Heidarvand, L. & MaaliAmiri, R. (2013). Physio-biochemi- cal and proteome analysis of chickpea in early phases of cold stress. Journal of Plant Physiology, 170(5), 459-469.
  16. Heidarvand, L. & Maali Amiri, R. (2010). What happens in plant molecular responses to cold stress? Acta Physiologiae Plantarum, 32(3), 419-431.
  17. Heidarvand, L.  Maali Amiri, R., Naghavi, M. R., Farayedi, Y., Sadeghzadeh, B. & Alizadeh, K. H. (2011). Physiological and morphological characteristics of chickpea accessions under low temperature stress. Russian Journal of Plant Physiology, 58(1), 157-163.
  18. Hannah, M. A., Heyer, A. G. & Hincha, D. K. (2005). A global survey of gene regulation during cold acclimation in Arabidopsis thaliana. PLoS Genetics, 1(2): p.e26.
  19. Heath, R. L. & Packer, L. (1968). Photoperoxidation in isolated chloroplasts. 1. Kinetics and stoichoimetry of fatty acid peroxidation. Archives of Biochemistry and Biophysics, 125, 189-215.
  20. Davies, K. M., Albert, N. W., Zhou, Y. & Schwinn, K. E. (2018). Functions of flavonoid and betalain pigments in abiotic stress tolerance in plants. Annual Plant Reviews, 15, 1-41.
  21. Jain, M. (2013). Emerging role of metabolic pathways in abiotic stress tolerance. Journal of Plant Biochemistry and Physiology, 1(108), 10-4172.
  22. Jain, M. & Khurana, J. P. (2009). Transcript profiling reveals diverse roles of auxin-responsive genes during reproductive development and abiotic stress in rice. FEBS Journal, 276(11), 3148-3162.
  23. Kaplan, F. & Guy, C. L. (2004). b-Amylase induction and the protective role of maltose during temperature shock. Plant Physiology, 135(3), 1674-1684.
  24. Kumar, M., Bijo, A. J., Baghel, R. S., Reddy, C. R. K. & Jha, B. (2012). Selenium and spermine alleviate cadmium induced toxicity in the red seaweed Gracilaria duraby regulating antioxidants and DNA methylation. Plant Physiology and Biochemistry, 51, 129-138.
  25. Kundu, P., Gill, R., Ahlawat, S., Anjum, N. A., Sharma, K. K., Ansari, A. A., Hasanuzzaman, M., Ramakrishna, A., Chauhan, N., Tuteja, N. & Gill, S. S. (2018). Targeting the redox regulatory mechanisms for abiotic stress tolerance in crops. In: Biochemical, Physiological and Molecular Avenues for Combating Abiotic Stress Tolerance in Plants. 151-220.
  26. Langmead, B. & Salzberg, S. L. (2012). Fast gapped-read alignment with Bowtie2. Nature Methods, 9(4), 357-359.
  27. Liu, Q., Kasuga, M., Sakuma, Y., Abe, H., Miura, S., Yamaguchi Shinozaki, K. & Shinozaki, K. (1998). Two transcription factors, DREB1 and DREB2, with an EREBP/AP2 DNA binding domain separate two cellular signal transduction pathways in drought- and low-temperature-responsive gene expression, respectively, in Arabidopsis. Plant Cell, 10(8), 1391-1406.
  28. Liu, Q., Zhang, X., Zhao, Y., Lin, J., Shu, C., Wang, C. & Fang, X. (2013). Fullerene-induced increase of glycosyl residue on living plant cell wall. Environmental Science and Technology, 47(13), 7490-7498.
  29. Llorente, F., Lopez-Cobollo, R. M., Catala, R., Martinez-Zapater, J. M. & Salinas, J. (2002). A novel cold-inducible gene from Arabidopsis, RCI 3, encodes a peroxidase that constitutes a component for stress tolerance. Plant Journal, 32(1), 13-24.
  30. Long, Y., Zhang, J., Tian, X., Wu, S., Zhang, Q., Zhang, J., Dang, Z. & Pei, X.W.(2014). De novo assembly of the desert tree Haloxylon ammodendron (CA Mey.) based on RNA-Seq data provides insight into drought response, gene discovery and marker identification. BMC Genomics, 15(1), 1111.
  31. Longo, V., Kamran, R. V., Michaletti, A., Toorchi, M., Zolla, L. & Rinalducci, S. (2017). Proteomic and physiological response of spring barley leaves to cold stress. Cell6, 7.
  32. Loreto, F. & Velikova, V. (2001). Isoprene produced by leaves protects the photosynthetic apparatus against ozone damage, quenches ozone products, and reduces lipid peroxidation of cellular membranes. Plant Physiology, 127:1781-1787.
  33. Maali Amiri, R., Yur’eva, N. O., Shimshilashvili, K. R., Goldenkova-Pavlova, I. V., Pchelkin, V. P., Kuznitsova, E. I., Tsydendambaev, V. D., Trunova, T. I., Los, D. A., Salehi Jouzani, G. & Nosov, A. M. (2010). Expression of acyl-lipid delta12-desaturase gene in prokaryotic and eukaryotic cells and its effect on cold stress tolerance of potato. Journal of Integrative Plant Biology, 52(3), 289-297.
  34. Maali-Amiri, R., Goldenkova-Pavlova, I., Pchelkin, V. P., Tsydendambaev, V. D., Vereshchagin, A. G., Deryabin, A. N., Trunova, T. I., Los, D. A. & Nosov A. M. (2007). Lipid fatty acid composition of potato plants transformed with the Δ12-desaturase gene from Cyanobacterium. Russian Journal of Plant Physiology, 54(5):678-685.
  35. Mantri, N. L., Ford, R., Tristan, E., Edwin, C. & Pang, C. K. (2007). Transcriptional profiling of chickpea genes differentially regulated in response to high salinity, cold and drought. BMC Genomics, 8(1), 303-317.
  36. Mastan, S. G., Rathore, M. S., Bhatt, V. D. & Chikara, Y. J. (2012). Assessment of changes in DNA methylation by methylation-sensitive amplified polymorphism in Jatropha curcas L. subjected to salinity stress. Gene, 508(1), 125-129.
  37. Mizoi, J., Shinozaki, K. & Yamaguchi-Shinozaki, K. (2012). AP2/ERF family transcription factors in plant abiotic stress responses. Biochimica et Biophysica Acta, 1819(2), 86-96.
  38. Mousavi, S., Alisoltani, A., Shiran, B., Fallahi, H., Ebrahimie, E., Imani, A. & Houshmand, S. (2014). De novotranscriptome assembly and comparative analysis of differentially expressed genes in (Prunus dulcisMill.) in response to freezing stress.  PLOS One, 9, e104541.
  39. Nakashima, K., Takasaki, H., Mizoi, J., Shinozaki, K. & Yamaguchi-Shinozaki, K. (2012). NAC transcription factors in plant abiotic stress responses. Biochimica et Biophysica Acta, 1819(2), 97-103.
  40. Nejadsadeghi, L., Maali-Amiri, R., Zeinali, H., Ramezanpour, S. S. and Sadeghzade, B. (2014). Comparative analysis of physio-biochemical responses to cold stress in tetraploid and hexaploid wheat. Cell Biochemistry and Biophysics, 70, 399–408.
  41. Osakabe, Y., Yamaguchi-Shinozaki, K., Shinozaki, K. & Tran, L. S. (2013). Sensing the environment: key roles of membrane-localized kinases in plant perception and response to abiotic stress. Journal of Experimental Botany, 64(2), 445-458.
  42. Popov, V. N., Orlova,  I. V., Kipaikina, N. V., Serebriiskaya, T. S., Merkulova, N. V., Nosov, A. M. & Los, D.A. (2005). The effect of tobacco plant transformation with a gene for acyl-lipid δ9-desaturase from synechococcus vulcanus on plant chilling tolerance. Russian Journal of Plant Physiology, 52(5), 664-667.
  43. Priya, P. & Jain, M. (2013). RiceSRTFDB: a database of rice transcription factors containing comprehensive expression, cis-regulatory element and mutant information to facilitate gene function analysis. Database, bat027.
  44. Rakei, A., Maali-Amiri, R., Zeinali, H. & Ranjbar, M. (2016). DNA methylation and physio-biochemical analysis of chickpea in response to cold stress. Protoplasma, 253(1), 61-76.
  45. Ranocha, P., Denancé, N., Vanholme, R., Freydier, A., Martinez, Y., Hoffmann, L., Köhler, L., Pouzet, C., Renou, J. P., Sundberg, B. & Boerjan, W. (2010). Walls are thin 1 (WAT1), an Arabidopsis homolog of Medicago truncatula NODULIN21, is a tonoplast‐localized protein required for secondary wall formation in fibers. Plant Journal, 63(3), 469-483.
  46. Robinson, M. D. & Oshlack, A. (2010). A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data. Genome Biology, 11(3), R25.
  47. Robinson, M. D., McCarthy, D. J. & Smyth, G. K. (2010) edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics, 26(1), 139-140.
  48. Ray, S., Dansana, P. K., Giri, J., Deveshwar, P., Arora, R., Agarwal, P., Khurana, J. P., Kapoor, S. & Tyagi, A. K. (2011). Modulation of transcription factor and metabolic pathway genes in response to water-deficit stress in rice. Functional & Integrative Genomics, 11(1), 157-178.
  49. Rekarte-Cowie, I., Ebshish, O. S., Mohamed, K. S. & Pearce, R. S. (2008). Sucrose helps regulate cold acclimation of Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany, 59(15), 4205-4217.
  50. Ryan, D. P. & Owen-Hughes, T. (2011). Snf2-family proteins: chromatin remodellers for any occasion. Current Opinion in Chemical Biology, 15(5), 649-656.
  51. Ramezanpour, S., Maali-Amiri, R., Khazaei, M. & Talei, A. R., (2015). Differential transcript accumulation of dhydrin and beta-glucosidase genes to cold-induced oxidative stress in chickpea. Journal of Agriculture Science and Technology, 17, 725-734.
  52. Shi, H., Liu, W., Wei, Y. & Ye, T. (2017). Integration of auxin/indole-3-acetic acid 17 and RGA-LIKE3 confers salt stress resistance through stabilization by nitric oxide in Arabidopsis. Journal of Experimental Botany, 68(5), 1239-1249.
  53. Schaller, F., Biesgen, C., Müssig, C., Altmann, T. & Weiler, E. W. (2000). 12-Oxophytodienoate reductase 3 (OPR3) is the isoenzyme involved in jasmonate biosynthesis. Planta, 210(6), 979-984.
  54. Seki, M., Narusaka, M., Ishida, J., Nanjo, T., Fujita, M., Oono, Y., Kamiya, A., Nakajima, M., Enju, A., Sakurai, T. & Satou, M. (2002). Monitoring the expression profiles of 7000 Arabidopsis genes under drought, cold and high-salinity stresses using a full-length cDNA microarray. Plant Journal, 31(3), 279-292.
  55. Somerville, C. R. & Browse, J. (1996). Dissecting desaturation: plants prove advantageous. Trends in Cell Biology, 6(4), 148-153.
  56. Stockinger, E. J., Gilmour, S. J. & Thomashow, M. F. (1997). Arabidopsis thaliana CBF1 encodes an AP2 domain-containing transcriptional activator that binds to the C-repeat/DRE, a cis-acting DNA regulatory element that stimulates transcription in response to low temperature and water deficit.  Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 94(3), 1035-1040.
  57. Smith, R.  A., Cass, C. L., Mazaheri, M., Sekhon, R. S., Heckwolf, M., Kaeppler, H., Leon, N., Mansfield, S. D., Kaeppler, S. M., Sedbrook, J. C. & Karlen, S.D. (2017). Suppression of CINNAMOYL-CoA REDUCTASE increases the level of monolignol ferulates incorporated into maize lignins. Biotechnology for Biofuels, 10(1), 109.
  58. Shahryar, N. & Maali-Amiri, R. (2016). Metabolic acclimation of tetraploid and hexaploid wheats by cold stress-induced carbohydrate accumulation. Journal of Plant Physiology204, 44-53.
  59. Schade, B., Jansen, G., Whiteway, M., Entian, K. D. & Thomas, D. Y. (2004). Cold adaptation in budding yeast. Molecular Biology of the Cell, 15(12), 5492-502.
  60. Sun, J. H., Dong, Y. H., Li, C. L. & Shen, Y. Y. (2015). Transcription and enzymatic analysis of beta-glucosidase VvBG1 in grape berry ripening. Plant Growth Regulation, 75(1): 67-73.
  61. Tan, M. P. (2010). Analysis of DNA methylation of maize in response to osmotic and salt stress based on methylation-sensitive amplified polymorphism. Plant Physiology and Biochemistry, 48(1), 21-26.
  62. Trapnell, C., Pachter, L. & Salzberg, S. L. (2009). TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq. Bioinformatics, 25(9), 1105-1111.
  63. Trapnell, C., Williams, B. A., Pertea, G., Mortazavi, A., Kwan, G., Van Baren, M. J., Salzberg, S.L., Wold, B.J. & Pachter, L. (2010). Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nature biotechnology, 28(5), 511.
  64. Tanaka, H., Osakabe, Y., Katsura, S., Mizuno, S., Maruyama, K., Kusakabe, K., Mizoi, J., Shinozaki, K. & Yamaguchi-Shinozaki, K. (2012). Abiotic stress-inducible receptor-like kinases negatively control ABA signaling in Arabidopsis. Plant Journal, 70(4), 599-613.
  65. Upchurch, R. G. (2008). Fatty acid unsaturation, mobilization, and regulation in the response of plants to stress. Biotechnol Letters, 30(6), 967-977.
  66. Varshney, R. K., Close, T. J., Singh, N. K., Hoisington, D. A. & Cook, D. R. (2009). Orphan legume crops enter the genomics era, Current Opinion in Plant Biology. 12(2), 202-210.
  67. Varshney, R. K., Song, C. & Saxena, R. K. (2013).  Draft genome sequence of chickpea (Cicer arietinum) provides a resource for trait improvement. Nature Biotechnology, 31(3), 240-246.
  68. Wu, Y., Wei, W., Pang, X., Wang, X., Zhang, H., Dong, B., Xing, Y., Li, X. & Wang, M. (2014). Comparative transcriptome profiling of a desert evergreen shrub, Ammopiptanthus mongolicus, in response to drought and cold stresses. BMC Genomics, 15(1), 671.
  69. Yadav, S. S., Kumar, J., Yadav, S. K., Singh, S., Yadav, V. S., Turner, N. C. & Redden, R. (2006). Evaluation of Helicoverpa and drought resistance in desi and kabuli chickpea. Plant Genetic Resources, 4(3), 198-203.
  70. Yin, Y., Huang, J. & Xu, Y. (2009). The cellulose synthase superfamily in fully sequenced plants and algae. BMC Plant Biology, 9(1), 99.
  71. Yun, K. Y., Park, M. R., Mohanty, B., Herath, V., Xu, F., Mauleon, R., Wijaya, E., Bajic, V. B., Bruskiewich, R. & de los Reyes, B. G. (2010). Transcriptional regulatory network triggered by oxidative signals configures the early response mechanisms of japonica rice to chilling stress. BMC Plant Biology, 10(1), 16.


[1] Reactive oxygen species

[2] Oxidative stress

[3] Malondialdehyde

[4] Electrolyte leakage index

[5] Secondary messengers

[6] Subtractive hybridization

[7] Microarray

[8] Next generation sequencing

[9] RNA sequencing

[10] Biozol

[11] Transcription factor

[12] Domains

[13] Cold-responsive

[14] Post-translational modifications