بررسی تأثیر ژن AtEXPA18 آرابیدوپسیس بر صفات ریشه و بذر لاین های تراریخته توتون

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشجوی سابق کارشناسی ارشد بیوتکنولوژی گروه زراعت و اصلاح نباتات، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه تهران

2 دانشیار گروه زراعت و اصلاح نباتات پردیس کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه تهران

چکیده

اکسپنسین‌ها پروتئین‌های غیر‌آنزیمی موجود در دیواره سلولی می‌باشند که عامل اصلی برای طویل شدن سلول محسوب می-شوند. انعطاف پذیری دیواره سلول گیاهی به واسطه اسیدی شدن و فعال شدن اکسپنسین‌ها تنظیم می‌گردد. در این تحقیق تأثیر انتقال ژن AtEXPA18 بر ریشه و بذر لاین‌های توتون تراریخته بررسی شد.‌ برای اثبات تراریختگی گیاهان پس از استخراج RNA ، cDNA ساخته شد و با استفاده از آغازگرهای اختصاصی طراحی ‌شده ژن برای AtEXPA18 آزمایش PCR صورت گرفت. بذور در محیط کشت انتخابیMS  حاوی کانامایسین کشت ‌شدند. گیاهچه‌های تراریخته در محیط کشت حاوی کانامایسین به خوبی رشد کردند ولی گیاهچه‌های غیر‌تراریخته سفید شدند و از بین رفتند. سپس گروهی از این گیاهان تراریخته به گلخانه و گروهی به ‌منظور بررسی صفات مورفولوژیک ریشه به گلدان‌های حاوی محلول غذایی هوگلند منتقل‌شدند. بررسی‌های گلخانه‌ای نشان داد گیاهان تراریخته نسبت به گیاهان غیرتراریخته در صفت‌هایی از جمله وزن بذر، وزن کپسول و وزن صد دانه بهتر عمل کردند. گیاهان تراریخته رشد کرده در هوگلند نسبت به گیاهان غیرتراریخته در صفت‌های وزن‌تر و خشک اندام هوایی و ریشه، و ارتفاع ریشه بهتر بودند. به صورت کلی لاین تراریخته L4 بهترین عملکرد را در بین لاین‌های تراریخته از خود نشان داد.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Evaluation of the effect of AtEXPA18 Arabidopsis gene on root and seed traits of tobacco transgenic lines

نویسندگان [English]

  • Sedegeh Yosefi 1
  • Alireza Abasi 2
  • Maryam ChaleKaei 1
  • Meisam Malekpor 1
1 Agronomy and Plant Breeding Dept. University of Tehran
2 Agronomy and Plant Breeding Dept. University of Tehran
چکیده [English]

Expansins are non-enzymatic proteins in the cell wall, which are the main factor for cell elongation.The flexibility of the plant cell wall is regulated by acidification and activation of expansins. In this study, the effects of transferred AtEXPA18 gene on transgenic tobacco plants were investigated. To confirm the transgenic plant, RNA was extracted from the plant leaf sample and then cDNA was synthesized. After that PCR was done via a specific primer of the AtEXPA18 gene. Seeds were cultured in selective MS medium containing kanamycin. Transgenic seedlings tolerate medium which contains kanamycin and Non-transgenic seedlings got white and died. Subsequently, some of these seedlings were grown in the greenhouse and others were grown in Hoagland nutrient solution for evaluating root morphology. Greenhouse studies showed that the transgenic plants were better than non-transgenic plants in some traits such as seed weight, capsule weight, and 100 seed weight. Transgenic plants grown in Hoagland were better than non-transgenic plants in some other traits like shoot and root dry weight, and root length. Consequently, L4 transgenic line had the best performance among transgenic lines.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Cell wall extension
  • Expansin
  • Tobacco
  • Transgenic plant
  • AtEXPA18
 

 

مقدمه

بسیاری از گیاهان بوسیله بذر تکثیر پیدا می­کنند. رشد و توسعه بذر به ژنتیک و مواد مغذی که از والدین به آن منتقل می­شود بستگی دارد. بر اساس مطالعات ژنتیک عوامل مادری و غیر مادری در تنظیم اندازه بذر دخالت دارند و ارتباط بین بافت مادری و تخم می­تواند هماهنگ کننده اندازه بذر باشد (Garcia et al., 2005). اطراف سلول­های گیاهی بوسیله دیواره سلولی احاطه شده است. دیواره سلولی از عناصر مهمی چون پلی­ساکاریدها، پروتئین­ها (Carpita & Gibeaut, 1993) و ترکیبات فنلی و سایر مواد تشکیل شده است و تعیین اندازه و شکل سلول گیاهی توسط دیواره تنظیم می­شود (Varner & Lin, 1989). دیواره سلولی دارای عملکردهای پشتیبانی ساختاری، تعیین شکل سلول، حفاظت در برابر عوامل بیماری زا (پاتوژن ها) و سایر مهاجم­های موجود در محیط زیست، ذخیره سازی و رها کردن سیگنال­های مولکولی، ذخیره کردن کربوهیدرات­ها، یون­ها و مواد دیگر است
(Cosgrove, 1999). برای طویل شدن و به بلوغ رسیدن، سلول گیاهی به صورت انتخابی تغییراتی را در اجزءای دیواره شامل: اکسپنسین­ها، اندوگلوکان­ها، زایلوگلوکان، رادیکال­های آزاد ایجاد می­کند (Cosgrove, 1999, 2000a). اکسپنسین­ها شامل خانواده چند ژنی بزرگی از پروتئین­های سست کننده دیواره سلولی هستند. بر اساس آنالیز توالی­های اکسپنسین چهار خانواده حفاظت شده تکاملی اکسپنسین­ها در همه گیاهان روی زمین وجود دارند، این چهار خانواده شامل: آلفا اکسپنسین (EXPA)، بتا اکسپنسین (EXPB)، شبه آلفا اکسپنسین و شبه بتا اکسپنسین می­باشند (Choi et al., 2006). اکسپنسین­ها جزء عوامل اولیه مختل شدن پیوندهای دیواره و تضعیف پیوندهای غیر­کووالانسی مانند پیوندهای هیدروژنی در لایه سلولز- همی سلولز و در نتیجه افزایش سطح دیواره سلولی هستند، این پروتئین­ها مسئول تنظیم اندازه سلول­های گیاهی هستند که در دیواره سلولی وجود دارند. و وابسته به تغییرات pH می­باشند (McQueen-Mason & Cosgrove, 1994). به عنوان نمونه اکسپنسین A در دیواره­های سلولی میان گره­های برنج با pH اسیدی فعال شده و سبب افزایش رشد دیواره سلولی می­شود (Cho & Kende, 1997). اکسپنسین­ها به عنوان عامل اصلی برای افزایش طول دیواره سلولی درنظرگرفته می­شوند و سایر عوامل به عنوان عامل کمکی برای اکسپنسین­ها محسوب می­شوند (Vissenberg et al., 2000). اکسپنسین­ها به عنوان خانواده­هایی چند ژنی در آرابیدوپسیس، برنج، خیار و گوجه فرنگی شناسایی شده­اند (Cosgrove, 1999). اکسپنسین­ها در طول رسیدگی و حتی بعد از توقف رشد در نرم کردن بافت میوه (Brummell et al., 1999)، در ریزش برگ­ها[1] (Cho & Cosgrove, 2000)، در ساخته شدن لوله گرده (Pezzotti et al., 2002)، تشکیل ریشه موئین (Cho & Cosgrove, 2002)، تمایز آوند چوبی (Milioni et al., 2001)، همزیستی و آلودگی پاتوژن (Fudali et al.,2008) نقش ایفا می­کنند. دو ژن AtEXPA18 و AtEXPA7 بطور اختصاصی در سلول­های ریشه موئین Arabidopsis thaliana بیان شدند (Cho & Cosgrove,2002). با توجه به حضور فیتوهورمون­های اکسین، جیبرلین، اتیلن، سیتوکینین و اسید آبسیزیک بیان ژن­های اکسپنسین در سلول­ها تنظیم می­شود. آنالیز ناحیه پروموتوری اکسپنسین­های برنج نشان می­دهد که آبسیزیک اسید، اکسین، جیبرلین(GA) و اتیلن عناصر پاسخگو[2] و فعال هستند  (Lee et al., 2001). ژن AtEXPA18 در توتون باعث افزایش سطح برگ و طول ساقه و در نتیجه افزایش کلروفیل و فتوسنتز در گیاهان تراریخته نسبت به گیاهان غیرتراریخته گردید، این افزایش رشد به دلیل خاصیت سست شدن دیواره سلولی و افزایش توسعه دیواره سلولی توسط اکسپنسین­ها در نظر گرفته شده است (Malek pour et al., 2013). در تحقیق حاضر تأثیر ژن اکسپنسین AtEXPA18 روی طول ریشه، وزن خشک و تر ریشه و اندام هوایی، اندازه کپسول، تعداد کپسول، وزن بذر و تعداد بذر در کپسول در گیاه توتون مورد بررسی قرار گرفته است.

مواد و روش ها

تراریختگی توتون با سازه pBI121:AtEXPA18  

قطعه ژن AtEXPA18 از DNA استخراج شده گیاه Arabidopsis thaliana جدا و به درون ناقل pGEM-T وارد گردید. این ناقل به همراه ژن مورد نظر ابتدا به باکتری Escherichia coli DH5a مستعدشده منتقل و سپس قطعه ژنی تحت پیش برنده CaMV 35s و خاتمه‌دهنده  NOS‌ به درون ناقل بیانی pBI121 (Clonetech) همسانه­سازی گردید. سازه ساخته شده به سلول­های مستعد آگروباکتریوم سویه LBA4404 منتقل گردید (Shahnejat Bushehri et al., 2010; Malk por et al., 2013).  کلونی­های رشد کرده در محیط LB انتخابی (حاوی کانامایسین و ریفامپسین) برای تلقیح برگ­های توتون استفاده گردید. انتقال­ ژن با روش آگرواینفکشن (Ohta et al., 1990) به گیاه توتون (Nicotiana tabacum) انجام شد.

بررسی گیاهان تراریخته

به منظور جداسازی بذرهای تراریخته شده با سازهpBI121:AtEXPA18  از بذرهای غیر­تراریخته، بذرهای ضدعفونی شده در محیط کشت حاوی کانامایسین کشت شدند. بذرها ابتدا با آب دو بار تقطیر شده، شستشه شده و سپس بعد از قرارگیری به مدت یک دقیقه در الکل 70­% ، مجدداً دو تا سه بار با آب دو بارتقطیر شده شستشو شدند. در مرحله بعد به منظور ضدعفونی سطحی، بذرها به مدت 10 تا 15 دقیقه در هیپوکلرید سدیم 5% قرار گرفتند و درآخر 4 تا 5 باربوسیله آب دو بارتقطیر شده شستشو داده شدند. پتری دیش­های حاوی بذرها به منظور رشد بهینه به اتاق کشت (دمای 2 23، 60‌% رطوبت و 16ساعت روشنایی) منتقل شدند. از بین گیاهان غیرتراریخته و تراریخته که به مرحله چهار برگی رسیدند تعدادی به گلدان­های پلاستیکی کوچک (200 گرمی) حاوی کوکوپیت و پرلیت منتقل شدند و بعد از رشد مناسب، گیاهان به گلدان­های بزرگتر (دو کیلوگرمی) حاوی ترکیبات خاک: ماسه بادی: کوکوپیت و پرلیت با نسبت های 1:2:2:2 منتقل شدند و گلدان­ها به محیط گلخانه (دمای 2 25 و 16ساعت روشنایی) منتقل و تا انتهای مرحله زایشی نگهداری‌شدند. صفات تعداد کپسول، وزن کپسول و  بذرهای داخل کپسول و وزن صد دانه بررسی شدند. گیاهان در این مرحله در قالب طرح کاملاً تصادفی با هشت تکرار مورد مطالعه قرار‌گرفتند.

تعدادی دیگر از گیاهچه­ها برای بررسی مناسب­تر خصوصیات ریشه به محلول غذایی هوگلند (بدون هوادهی) منتقل شدند و در شرایط اتاقک رشد (دمای  2 23، 60‌% رطوبت و 16ساعت روشنایی) به­منظور بررسی بهتر ریشه نگهداری ‌شدند. طی آزمایش همه روزه مقداری از حجم محلول از پای گیاهان کاهش و به همان میزان محلول تازه هوگلند اضافه می‌شد. در این بخش صفات ارتفاع ریشه، وزن تر اندام هوایی، وزن خشک اندام هوایی، وزن­تر ریشه، وزن خشک ریشه، نسبت ریشه به اندام هوایی تر و نسبت ریشه به اندام هوایی خشک مورد بررسی قرار گرفت. گیاهان در  این مرحله در قالب طرح کاملاً تصادفی با چهار تکرار مورد مطالعه قرار­گرفتند.

نتایج و بحث

انتقال ژن و تأیید تراریختگی لاین‌های انتخابی

بعد از رشد گیاهچه‌های توتون در محیط کشت، انتقال ژن به قطعات برگی تهیه شده به روش آگرواینفکشن انجام گرفت و بعد از دو روز قرار گرفتن در محیط همکشت به محیط انتخابی جدید منتقل شدند (شکل 1-a). سپس بازا شدن ریز نمونه­های گیاهی در محیط کشت MS انتخابی حاوی کانامایسین (برای گزینش گیاه تراریخته احتمالی) و سفوتاکسیم (کاهش رشد باکتری در محیط کشت) صورت گرفت. براساس (شکل 1-b) باززایی سلول­ها به این صورت بود که سلول­ها از قسمت­های زخم خورده برگ­ها رشد کردند. گیاهچه­های بازا شده به محیط انتخابی داخل لیوان انتقال پیدا کردند و برای گلخانه انتخاب شدند. بر اساس (شکل1- c) گیاهچه­های بازا شده تراریخته سبز باقی ماندند و رشد کرده و توانستند تولید ریشه و ساقه  قوی کنند.   

                                                       

شکل1- انتقال سازه ژنی به برگ­های توتون بوسیله آگروباکتریوم و بررسی تراریختگی­لاین­های انتخابی. -a برگ­های تلقیح شده با آگروباکتریوم در محیط انتخابی با کانامایسین و سفوتاکسیم، -b باززایی سلول‌های تراریخته احتمالی در محیط­کشتMS  ،  -c گیاهان تراریخته احتمالی رشد کرده در محیط انتخابی، -d قطعات حاصل از تکثیر DNA توتون با آغازگرهای ویژه آن روی ژل آگارز یک درصد(گیاهان غیرتراریخته (control)، L1-L5: گیاهان تراریخته مثبت، :Plasmid نمونه پلاسمید اگروباکتری حاوی پلاسمیدpBI121::AtEXPA18 (کنترل مثبت)، :Ladderنشانگر وزن مولکولی  λ/EcoRI +HindIII. )، e- قطعات حاصل از تکثیر cDNA توتون با آغازگرهای ویژه آن روی ژل آگارز یک و نیم درصد. -f بذور گیاهان تراریخته  35S::AtEXPA18و گیاهان غیرتراریخته در محیط کشت MS  انتخابی حاوی آنتی بیوتیک.

Fig.1- transformation gene construct into tobacco leaves by Agrobacterium  and evaluation of selected lines. a- incubated leaves with Agrobacterium on the selective medium containing kanamycin and cefotaxime., b- Regeneration of putative transgenic cells on MS medium, c- Putative transgenic plants grown on selective MS medium,  d- fragments of tobacco DNA amplification by specific primers on 1 percent agarose gel.( non-transgenic plants (control), L1-L5: Positive transgenic plants, Plasmid: Samples of the agrobacterium plasmids containing plasmid pBI121::AtEXPA18 (Positive control), Ladder: Molecular weight markers λ/EcoRI +HindIII (Qiagen).),  e-fragments of tobacco cDNA amplification by specific primers on 1.5 percent agarose gel, .f- Seeds of transgenic plants  35S::AtEXPA18  and non- transgenic plants in selective MS medium containing antibiotic.

 

 

.

 

 به منظور اثبات تراریختگی گیاهان، استخراجaseDNA آنها به روش CTAB انجام گرفت. سپس ژن AtEXPA18با استفاده از آغازگرهای طراحی شده و به کمک تکنیک PCR تکثیر شد. مرحله اول PCR، واسرشت ­سازی 94درجه و به مدت 3 ساعت، مرحله دوم اتصال در 60 درجه و به مدت 1 ساعت و مرحله تکثیر در دما 72 درجه و به مدت 2 ساعت به طول انجامید. محصول PCR هر کدام از نمونه­های گیاهی در چاهک­های مشخصی بر روی ژل آگارز، الکتروفورز شد و پس از آن، ژل توسط دستگاه ژل داک[3] و زیر نور فرابنفش مورد بررسی قرار گرفت. با توجه به (شکل 1-d) در چاهک اول از سمت راست نمونه گیاه غیرتراریخته (به عنوان کنترل منفی) بارگیری شد و همانطور که انتظار می­رفت هیچ باندی نشان نداد. چاهکهای 2 الی 5 و 7 الی 9 حاوی  DNAتکثیر شده گیاهان مورد آزمون می­باشند. چاهک6 نیز نشانگر وزن مولکولی را داراست که حاوی دی­ان­ای(DNA)ِ لاندای هضم شده با آنزیم­های   EcoRIو  HindIمی­باشد. همچنین پلاسمید استخراج شده از آگروباکتریوم (به عنوان کنترل مثبت) در چاهک 9 بارگذاری شد. در نهایت، باندهای  DNAایجاد شده زیر نور فرابنفش مشاهده و عکسبرداری شد. در نتیجه با توجه به اندازه قطعات تکثیر شده در نمونه­های   DNAاستخراج شده، پنج لاین تراریخته (L1-L5)که باندی هم ردیف با باند حاصل از کنترل مثبت و در حدود 1228 جفت باز (طول CDSژن (AtEXPA18 را نشان دادند، مشخص شدند به این ترتیب تراریختگی پنج لاین از گیاهان توتون در سطح ژنوم تأیید شد و لاین­های تراریخته L2، L4 و L5 برای آنالیزهای بعدی انتخاب شدند. برای اثبات بیشتر تراریختگی cDNA ساخته شد و از لاین های تراریخته و گیاهان غیرتراریخته نمونه­گیری انجام شد و با استفاده از دو پرایمر اختصاصی، PCR انجام شد و محصولات پرایمر در لاین­های تراریخته L2,L4,L5 و پلاسمید به عنوان کنترل مثبت دارای قطعه تکثیری 183 جفت باز مشخص شدند و در گیاهان غیرتراریخته باندی مشاهده نشد (شکل1-e ). به منظور تأیید نتایج PCR و اثبات انتقال ژن به نسل بعدی بذرهای گیاهان تراریخته و غیر­تراریخته در گلخانه جمع‌آوری و پس از ضدعفونی در محیط کشت انتخابی (حاوی کانامایسین) کشت شدند. بذور گیاهان تراریخته به دلیل دارا بودن ژن مقاومت به کانامایسین می­توانند در محیط­کشت حاوی این آنتی­بیوتیک رشد کنند که پس از چهار برگی شدن به رشدشان ادامه دادند اما گیاهان غیرتراریخته و تفرق­یافته زردشده ( یا سفید شده) و از بین‌­رفتند. در این مرحله تعداد بذور جوانه زده و سبز مانده شمارش شد و نسبت جوانه زنی (برای تعیین تعداد درج ژن در ژنوم توتون) محاسبه شد و نسبت 3:1 مشاهده شد (شکل1-f).

- بررسی مورفولوژیک گیاهان کشت شده در گلخانه

بعد از رشد مناسب گیاهان غیرتراریخته و تراریخته در گلخانه به منظور بررسی عملکرد گیاهان، صفاتی مورد سنجش قرار گرفت، در ابتدا وزن بذر داخل کپسول اندازه­گیری شد و مشخص شد که لاین تراریخته L4  دارای بیشترین وزن بذر نسبت به گیاهان غیرتراریخته بوده است و گیاهان غیرتراریخته دارای وزن بذر کمتری بودند. بیشترین اثر ژن در لاین L4 دیده شد و  این اثر به میزان کمی هم در لاین L5 و L2 مشاهده شد (شکل2). افزایش وزن بذر می تواند ناشی از دو عامل افزایش در اندازه بذر (افزایش تقسیم سلول ها و یا افزایش اندازه سلول­های بذر) و یا افزایش تعداد بذر داخل کپسول و یا به دلیل هر دو عامل ایجاد شده باشد. برای بررسی این دو فرضیه و رسیدن به جواب مناسب اندازه گیری صفات دیگری چون وزن کپسول، تعداد کپسول پر، تعداد بذر در کپسول و وزن صد دانه انجام شد.

 

 

 

شکل2- مقایسه صفت وزن کل بذر در گیاهان غیرتراریخته(WT) و گیاهان تراریخته L2, L4, L5)) در شرایط گلخانه

Fig. 2- Comparision of seed weight in the non-transgenic plants (WT) and transgenic plants (L2, L4, L5) in greenhouse conditions

 

                                                                    

                                      

 

مشخص شد بیشترین تعداد کپسول پر برای گیاهان غیرتراریخته و کمترین تعداد کپسول پر برای گیاهان لاین L4 بوده است (شکل3-a)، لاین­های تراریخته L2 و L5 که دارای وزن بذر کمتر از لاین تراریخته L4 بوده­اند دارای تعداد کپسول پر بیشتری بوده­اند. ولی گیاهان غیرتراریخته با وجود دارا بودن وزن بذر کمتر دارای تعداد کپسول پر بیشتری بوده است. بنابراین می­توان نتیجه گرفت که ژن هیچ اثری روی افزایش تعداد کپسول پر نداشته است. بنابراین، در این لاین­ها یا تعداد بذر داخل کپسول بیشتر است و یا اندازه بذر از بذر سایر لاین ها بزرگتر است. برای مشخص شدن موضوع، وزن کپسول و تعداد بذر در کپسول با استفاده از فرمول‌های زیر بررسی شدند.

تعداد کپسول پر / وزن کل بذر  = وزن کپسول

 وزن صد دانه / 100 × وزن کپسول = تعداد بذر در کپسول

بیشترین میزان وزن کپسول مربوط به لاین تراریخته L4 بود و کمترین میزان وزن کپسول برای گیاهان غیرتراریخته بوده است،  وزن کپسولی لاین­های تراریخته L2 و L5 نیز از گیاهان غیرتراریخته بیشتر بود (شکل3- b). همانطورکه در (شکل3- c) مشخص است، وزن صد دانه گیاهان غیرتراریخته کمترین مقدار و وزن صد دانه لاین تراریخته L4 بیشترین مقدار و دو لاین L2 و L5 حد وسط این دو بوده و با یکدیگر نیزتفاوت معنی­داری داشتند. در نهایت تعداد بذر در کپسول مورد ارزیابی قرار گرفت و مشخص شد که بیشترین تعداد بذر در کپسول در لاین L4 و کمترین تعداد بذر در کپسول در گیاهان غیرتراریخته بود (شکل3-d). با بررسی­ها مشخص شد که وزن کپسول L5 بیشتر از کپسول گیاهان غیرتراریخته می­باشد بنابراین یکی از دلایل این افزایش وزن می­تواند افزایش تعداد بذر لاین L5 نسبت به گیاهان غیرتراریخته باشد. با این بررسی­ها مشخص شد که وزن کل بذر، وزن کپسول و وزن صد دانه در لاین L4 و بعد از آن در لاین L5 بیشتر از بقیه لاین ها بوده است که این افزایش می­تواند نتیجه افزایش در اندازه بذر باشد و افزایش اندازه بذر یا با افزایش اندازه سلول­ها و یا با افزایش تعداد سلول­ها و یا هر دو ممکن است رخ داده باشد. آزمایشات زیادی وجود یک همبستگی مثبت بین ژن­های اکسپنسین و هورمون­هایی چون اکسین، جیبرلین، سیتوکینین، آبسیزیک اسید و اتیلن را تأیید کرده­اند. این فیتوهورمون­ها با تنظیم میزان بیان ژن­های اکسپنسین فعالیت آنها را تنظیم می­کنند. بر اساس اطلاعات موجود، هورمون‌های اکسین و جیبرلین‌ها به­عنوان تنظیم کننده‌های تقسیم و بسط سلولی شناخته می‌شوند (Davies, 2010)، هورمون اکسین از طریق کاهش pH دیواره سلولی فعالیت اکسپنسین­ها را افزایش می­دهد و به عنوان عامل افزایش طول سلول بیان برخی از ژن­های اکسپنسین را افزایش می­دهد(Cosgrove, 2000b) . بنابراین هورمون­های اکسین و جیبرلین با افزایش تقسیمات سلولی و همچنین تأثیر مثبت بر اکسپنسین­ها و شل شدن پیوند­های موجود در دیواره سلولی سبب افزایش تقسیمات سلولی و افزایش اندازه سلول می­شوند. هورمون های اکسین و جیبرلین نقش مهمی در شروع گلدهی و بذر­دهی پس از لقاح، دارند (Ruan et al., 2012). این دو هورمون در بذرهای نخود فرنگی موجب القای رشد (طولی و وزن تر) پریکارب و در‌نهایت افزایش رشد اندام زایشی می‌شوند (Ozga & Reinecke, 1999) بنابراین افزایش فعالیت هورمون­های اکسین و جیبرلین سبب افزایش اندازه بذر شده و در نتیجه سبب افزایش وزن صد دانه و وزن کپسول­ می­شوند، فعالیت بیشتر این دو هورمون سبب افزایش وزن صد دانه و وزن کپسول در لاین L4 نسبت به گیاهان غیرتراریخته شده است. درگیاه گوجه فرنگی تیمار اکسین موجب افزایش تعداد سلول‌های پریکارب و جیبرلین سبب کاهش تعداد سلول‌های پریکارب ولی افزایش اندازه آن­ها شده است. براساس تحقیق دیگری مشخص شده‌است که جیبرلین‌ها و علاوه بر آن اکسین‌ها نیاز بذر را از نظر حفظ تقسیم و توسعه سلولی خصوصاً در اوایل نمو دانه تأمین می‌کنند و این دو هورمون برای دستیابی به رشد سلولی مناسب تا رشد کامل اندام زایشی مورد نیاز هستند (Ozga et al., 2002).

- بررسی گیاهان رشد یافته در محلول غذایی هوگلند

بعد از حدود 4 هفته رشد مناسب گیاهان در محیط مایع هوگلند، قبل از مرحله گلدهی و در زمان هفت تا هشت برگی بودن، وزن تر اندام هوایی و وزن تر ریشه توسط ترازو حساس و اندازه طول ریشه بوسیله یک خط کش مناسب اندازه گیری شد، سپس اندام هوایی و ریشه گیاهان درون پاکت­های مناسب قرار داده شدند و به مدت 48 ساعت درون آون 70 درجه سانتی گراد قرار گرفته، بعد از این مدت بلافاصله وزن خشک اندام هوایی و وزن خشک ریشه اندازه گیری شدند.

بعد از اندازه گیری وزن تر اندام هوایی لاین های تراریخته و شاهد، مشخص شد که وزن تر اندام هوایی لاین L4 به طور معنی‌داری از بقیه لاین ها بیشتر است ، لاین L2 نیز نسبت به لاین های L5 و WT برتر بود (شکل4-a). وزن خشک اندام هوایی لاین L4 نسبت به سه لاین دیگر به‌طور معنی‌داری بیشتر بود (شکل4-b ). وزن تر ریشه لاین L4 نیز نسبت به بقیه لاین ها بیشتر بود. لاین های تراریخته L2 وL5 نیز وزن تر ریشه بیشتری نسبت به شاهد داشتند. می­توان افزایش وزن تر ریشه لاین های تراریخته را به دلیل بلندتر بودن ریشه نسبت به شاهد و همچنین تولید ریشه های موئین به دلیل عملکرد ژن اکسپنسین در نظر گرفت (شکل4- c). در وزن خشک ریشه لاین ها تفاوت معنی داری با یکدیگر نداشتند.

 

 

                      

        

 

بعد از اندازه­گیری ارتفاع ریشه مشخص شد که طول ریشه لاین L4 بیشتر از سه لاین دیگر است و ارتفاع ریشه دو لاین دیگر تراریخته L2 و L5 بیشتر از گیاهان غیرتراریخته می باشد (شکل 4- d).

ریشه برای بدست آوردن آب و غذا شکل می­گیرد (Schiefelbein et al., 1997). سیستم ریشه به عنوان یک سیستم برای توسعه شناسایی شده است. ریشه یک اندام ساده است و از تعداد کمی سلول تمایز یافته تشکیل شده است (Aeschbacher et al., 1994). رشد گیاه در نتیجه تقسیم شدن و بزرگ شدن سلول­ها و همراه با افزایش سطح دیواره سلولی اتفاق می افتد (Cosgrove, 1993). اهمیت دیواره سلولی در رشد و توسعه گیاهان نشان می­دهد که رشد و گسترش آنها تحت مقرراتی منظم کنترل می­شود. برخی از موارد سبب تضعیف پیوندهای دیواره سلولی می­شوند. و برخی از موارد هم سبب افزایش سختی پیوندهای دیواره سلولی می­شوند (Cosgrove, 2000b). در اغلب بذرها یا دانه­ها گسترش ریشه­ چه از طریق ساختارهای اطراف جنین صورت می گیرد که این امر خاتمه جوانه­زنی و آغازی برای رشد نهال است (Bewley, 1997a). در دانه جنین در میان آندوسپرم سخت و محکم تعبیه شده است و در آندوسپرم بخش کوچکی به نام کلاه آندوسپرموجود دارد که محل شروع تقسیمات سلولی برای تولید ساقه­ چه است. در ابتدا برای این قسمت محدودیت تقسیم و رشد وجود دارد زیرا ابتدا باید ریشه چه جوانه زده و رشد کند  (Groot et al., 1988). تضعیف کلاه آندوسپرم با هیدرولیز دیواره سلولی در ارتباط است (Watkins et al., 1985). آنزیم endo-β-mannanase برای کنترل روند تضعیف پیوندهای دیواره سلولی در نظرگرفته شده است و افزایش فعالیت این آنزیم سبب ظهور ریشه چه می­شود  (Nonogaki & Morohashi, 1996; Nonogaki et al., 2000). آنزیم endo-β-mannanase برای جوانه زنی ضروری است ولی قطعاً کافی نیست. علاوه بر آنزیم  endo-β-mannanase، آنزیم­های دیگری شامل: مانوزیداز، گالاکتوزیداز، سلولاز، پکتین متیل استراز، پلی گالاکتوروناز، آرابینوزیداز، زایلوگلوکان اندوترانس گلیکوزیلاز، β-1و3- گلوکاناز و کیتیناز در طول جوانه زنی بذر گوجه فرنگی بیان می­شوند (Groot et al., 1988). آنزیم­های هیدرولاز به تنهایی قادر به تضعیف دیواره سلولی و ظهور ریشه چه نیستند و قطعاً وجود فاکتورهای دیگری ضروری است (Bewley, 1997b; Toorop et al., 2000). پروتئین­های اکسپنسین یکی از فاکتورهای لازم برای تضعیف دیواره و جوانه زنی محسوب می­شوند. آنزیم β-گلوکورونیداز بیان ژن اکسپنسین را در زمان جوانه زدن بذر در کلاهک ریشه و مناطقی از ریشه که تفکیک سلول­ها صورت می گیرد سبب می شود (Cosgrove, 1998).  بنابراین می­توان نتیجه گرفت که در گیاهان تراریخته به دلیل داشتن ژن اکسپنسین خود گیاه و همچنین ژن اکسپنسین انتقالی فعالیت این آنزیم ها افزایش پیدا کرده و در نتیجه رشد ریشه و همچنین تشکیل ریشه­های موئین می­تواند افزایش پیدا کند. قابلیت انعطاف پذیری سلول گیاهی به واسطه اسیدی شدن دیواره و فعال شدن بیان پروتئین­های غیر­آنزیمی ویژه ای به نام اکسپنسین­ها تنظیم می­گردد. اکسپنسین­ها اساساً به عنوان عامل اصلی برای طویل شدن سلول محسوب می شوند، درحالیکه دیگر مواد نیز می­توانند ساختار دیواره سلولی را تغییر دهند و با عامل اصلی یعنی اکسپنسین­ها برای بسط دیواره همکاری کنند. در تعریفی دیگر، اکسپنسین­ها پروتئین­های دیواره سلولی هستند که در کل گیاهان روی زمین وجود دارند و توسعه دیواره وابسته به pH یا به عبارتی رشد اسیدی را القا می­کنند. این پروتئین­ها از طریق سست کردن پیوندهای هیدروژنی بین میکروفیبریل­های سلولز و پلیمر ماتریکس باعث تغییر شکل تدریجی دیواره می­شوند  و در نتیجه دیواره شل شده و سلول­ها کشیده می­شوند (McQueen-Mason & Cosgrove 1994, Cosgrove 1999). اکسپنسین­ها پروتئین­های سست­کننده دیواره سلولی و عناصر مهمی در بسیاری از فرایندهای فیزیولوژیکی گیاهان هستند (Cho & Cosgrove 2002). این پروتئین­ها به عنوان عامل اصلی برای افزایش طول دیواره سلولی درنظرگرفته می­شوند و سایر عوامل به عنوان عامل کمکی برای اکسپنسین­ها محسوب می­شوند .(Vissenberg et al., 2000) در مطالعه دیگری مشخص شد که ریشه­های ذرت در شرایط کم آبی به دلیل افزایش فعالیت اکسپنسین­ها و در نتیجه افزایش توسعه­پذیری دیواره سلولی و افزایش اندازه سلول قادر به ادامه رشد هستند
(Wu et al., 2001). در هیپوکوتیل (ساقه) خیار تعدادی از اکسپنسین­ها مسئول رشد سلول­ها می­باشند (McQueen-Mason, 1995). در برنج­های کشت شده در مناطقی که آب­های زیر زمینی در عمق وجود دارند، افزایش بیان ژن اکسپنسین ارتباط مستقیمی با افزایش رشد میان گره ریشه­ها دارد(Lee & Kende, 2001, 2002) . در شرایط آزمایشگاهی مشخص ­شد که اکسپنسین­ها در رشد سلول­های هیپوکوتیل Arabidopsis thaliana، و ایجاد ریشه موئین خیار نقش دارند (Moore et al., 1995). نتایج نشان داد، بیان اکسپنسین­ها سبب تشکیل ریشه موئین در آرابیدوپسیس شده است.  (Cho & Cosgrove, 2002) همچنین افزایش بیان ژن اکسپنسین A سبب افزایش طول ریشه برنج(Shin et al., 2005) ، ذرت(Kam et al., 2005)  و سویا(Lee et al., 2003)  می­شود. نتایج حاصل از آنالیز لاین­های تراریخته توتون با سازه pBI121:AtEXPA18  مشخص نمود که لاین L4 در اندازه­گیری­های گلخانه و محلول غذایی هوگلند نسبت به تمام لاین­های دیگر بهترین عملکرد را داشته است و می­توان نتیجه گرفت که افزایش بیان ژن اکسپنسین در سلول­ها صورت گرفته که سبب تضعیف پیوندهای هیدروژنی دیواره­های سلولی شده و اندازه سلول­ها افزایش پیدا کرده و در نتیجه طول ریشه لاین­های L4 نیز افزایش پیدا کرده است. در نتیجه با افزایش طول ریشه میزان وزن تر ریشه نیز به دلیل بزرگ تر شدن سلول­ها افزایش می­یابد و میزان وزن خشک ریشه نیز به دلیل طول بیشتر ریشه از سایر لاین­ها بیشتر است. افزایش اندازه سلول­ها در اندام­های هوایی نیز دیده شده است و در نتیجه مشاهده شده است که لاین L4 نیز به دلیل بزرگ شدن سلول­ها و جذب آب بیشتر، دارای بیشترین وزن تر و وزن خشک اندام هوایی نسبت به سایر لاین­ها می­باشد.

 

 

References:

  1. Aeschbacher, R. A., Schiefelbein, J. W., & Benfey, P. N. (1994). The genetic and molecular basis of root development. Annual Review of Plant Biology45(1), 25-45.‏
  2. Bewley, J. D. (1997a). Seed germination and dormancy. The Plant Cell9(7), 1055.‏
  3. Bewley, J. D. (1997b). Breaking down the walls—a role for endo-β-mannanase in release from seed dormancy? Trends in Plant Science, 2(12), 464-469.‏
  4. Brummell, D. A., Harpster, M. H., Civello, P. M., Palys, J. M., Bennett, A. B., & Dunsmuir, P. (1999). Modification of expansin protein abundance in tomato fruit alters softening and cell wall polymer metabolism during ripening. The Plant Cell, 11(11), 2203-2216.‏
  5. Carpita, N. C., & Gibeaut, D. M. (1993). Structural models of primary cell walls in flowering plants: consistency of molecular structure with the physical properties of the walls during growth. The Plant Journal, 3(1), 1-30.‏
  6. Cho, H. T., & Cosgrove, D. J. (2002). Regulation of root hair initiation and expansin gene expression in Arabidopsis. The Plant Cell, 14(12), 3237-3253.‏
  7. Cho, H. T., & Kende, H. (1997). Expression of expansin genes is correlated with growth in deepwater rice. The Plant Cell, 9(9), 1661-1671.‏
  8. Choi, D., Cho, H. T., & Lee, Y. (2006). Expansins: Expanding importance in plant growth and development.  Physiologia Plantarum, 126(4), 511-518.‏
  9. Cosgrove, D. J. (1993). Water uptake by growing cells: an assessment of the controlling roles of wall relaxation, solute uptake, and hydraulic conductance.International Journal of Plant Sciences, 10-21.
  10. ‏Cosgrove, D. J. (1998). Cell wall loosening by expansins. Plant Physiology, 118(2), 333-339.‏
  11. Cosgrove, D. J. (1999). Enzymes and other agents that enhance cell wall extensibility. Annual Review of Plant Biology, 50(1), 391-417.‏
  12. Cosgrove, D. J. (2000a). Expansive growth of plant cell walls. Plant Physiology and Biochemistry, 38(1), 109-124.‏
  13. Cosgrove, D. J. (2000b). Loosening of plant cell walls by expansins. Nature,407(6802), 321-326‏
  14. Davies, P. J. (2010). The plant hormones: their nature, occurrence, and functions. In Plant Hormones (pp. 1-15). Springer Netherlands.‏
  15. Dunsmuir, P. (1999). Differential expression of expansin gene family members during growth and ripening of tomato fruit. Plant Molecular Biology, 39(1), 161-169.‏
  16. Fudali, S., Janakowski, S., Sobczak, M., Griesser, M., Grundler, F. M., & Golinowski, W. (2008). Two tomato α‐expansins show distinct spatial and temporal expression patterns during development of nematode‐induced syncytia. Physiologia Plantarum, 132(3), 370-383.‏
  17. Garcia, D., Gerald, J. N. F., & Berger, F. (2005). MateRNAl control of integument cell elongation and zygotic control of endosperm growth are coordinated to determine seed size in ArabidopsisThe Plant Cell, 17(1), 52-60.‏
  18. Groot, S. P., Kieliszewska-Rokicka, B., Vermeer, E., & Karssen, C. M. (1988). Gibberellin-induced hydrolysis of endosperm cell walls in gibberellin-deficient tomato seeds prior to radicle protrusion. Planta, 174(4), 500-504.‏
  19. Kam, M. J., Yun, H. S., Kaufman, P. B., & Chang, S. C. (2005). Two expansins, EXP1 and EXPB2, are correlated with the growth and development of maize roots. Journal of Plant Biology48(3), 304-310.‏
  20. Lee, D. K., Ahn, J. H., Song, S. K., Do Choi, Y., & Lee, J. S. (2003). Expression of an expansin gene is correlated with root elongation in soybean.Plant Physiology, 131(3), 985-997.‏
  21. Lee, Y., Choi, D., & Kende, H. (2001). Expansins: Ever-expanding numbers and functions. Current Opinion in Plant Biology4(6), 527-532.‏
  22. Malekpour M., & Abbasi, A. R., (2013). Height and leaf increase of transgenic tobacco AtEXPA18 plant Iranian Journal of Crop Science, 45(3), 389-398. (In Persian)
  23. McQueen-Mason, S. J. (1995). Expansins and cell wall expansion. Journal of Experimental Botany, 46(11), 1639-1650.‏
  24. McQueen-Mason, S., & Cosgrove, D. J. (1994). Disruption of hydrogen bonding between plant cell wall polymers by proteins that induce wall extension. Proceedings of the National Academy of Sciences91(14), 6574-6578.‏
  25. Milioni, D., Sado, P. E., Stacey, N. J., Domingo, C., Roberts, K., & McCann, M. C. (2001). Differential expression of cell-wall-related genes during the formation of tracheary elements in the Zinnia mesophyll cell system. In Plant Cell Walls (pp. 221-238). Springer Netherlands.‏
  26. Moore, R. C., Flecker, D., & Cosgrove, D. J. (1995). Expansin action on cells with tip growth and diffuse growth. Journal of Cellular Biochemistry Supplement. 21A., 457. (Abstract J5–312).
  27. Nonogaki, H., & Morohashi, Y. (1996). An endo-[beta]-mannanase develops exclusively in the micropylar endosperm of tomato seeds prior to radicle emergence. Plant Physiology, 110(2), 555-559.‏
  28. Nonogaki, H., Gee, O. H., & Bradford, K. J. (2000). A germination-specific endo-β-mannanase gene is expressed in the micropylar endosperm cap of tomato seeds. Plant Physiology, 123(4), 1235-1246.‏
  29. Ohta, S., Mita, S., Hattori, T., & Nakamura, K. (1990). Construction and expression in tobacco of a β-glucuronidase (GUS) reporter gene containing an intron within the coding sequence. Plant and Cell Physiology, 31(6), 805-813.‏
  30. Ozga, J. A., & Reinecke, D. M. (1999). Interaction of 4-chloroindole-3-acetic acid and gibberellins in early pea fruit development. Plant Growth Regulation, 27(1), 33-38.‏
  31. Ozga, J. A., van Huizen, R., & Reinecke, D. M. (2002). Hormone and seed-specific regulation of pea fruit growth. Plant Physiology, 128(4), 1379-1389.‏
  32. Pezzotti, M., Feron, R., & Mariani, C. (2002). Pollination modulates expression of the PPAL gene, a pistil-specific β-expansin. Plant Molecular Biology, 49(2), 187-197.‏
  33. Ruan, Y. L., Patrick, J. W., Bouzayen, M., Osorio, S., & Fernie, A. R. (2012). Molecular regulation of seed and fruit set. Trends in Plant Science17(11), 656-665.‏
  34. Sánchez, R. A., Sunell, L., Labavitch, J. M., & Bonner, B. A. (1990). Changes in the endosperm cell walls of two Datura species before radicle protrusion.Plant Physiology, 93(1), 89-97.‏
  35. Schiefelbein, J. W., Masucci, J. D., & Wang, H. (1997). Building a root: the control of patterning and morphogenesis during root development. The Plant Cell, 9(7), 1089.‏
  36. Shahnejat Bushehri, S., Abbasi, A. R., Alizadeh, H. (2012). Overexpression of AtEXPA18 in Arabidopsis thaliana. Modern Genetics, 7(4), 363-370. (In Farsi)
  37. Shin, J. H., Jeong, D. H., Park, M. C., & An, G. (2005). Characterization and transcriptional expression of the α-Expansin gene family in rice. Molecules and Cells, 20(2), 210-218.‏
  38. Toorop, P. E., van Aelst, A. C., & Hilhorst, H. W. (2000). The second step of the biphasic endosperm cap weakening that mediates tomato (Lycopersicon esculentum) seed germination is under control of ABA. Journal of Experimental Botany51(349), 1371-1379.‏
  39. Varner, J. E., & Lin, L. S. (1989). Plant Cell Wall ArchitectureCell56(2), 231-239.‏
  40. Vissenberg, K., Martinez-Vilchez, I. M., Verbelen, J. P., Miller, J. G., & Fry, S. C. (2000). In vivo colocalization of xyloglucan endotransglycosylase activity and its donor substrate in the elongation zone of Arabidopsis roots. The Plant Cell, 12(7), 1229-1237.‏
  41. Watkins, J. T., Cantliffe, D. J., Huber, D. J., & Nell, T. A. (1985). Gibberellic acid stimulated degradation of endosperm in pepper. Journal of the American Society for Horticultural Science110(1), 61-65.‏
  42. Whitney, S. E., Gidley, M. J., & McQueen‐Mason, S. J. (2000). Probing expansin action using cellulose/hemicellulose composites. The Plant Journal, 22 (4), 327-334.‏
  43. Wu, Y., Thorne, E. T., Sharp, R. E., & Cosgrove, D. J. (2001). Modification of expansin transcript levels in the maize primary root at low water potentials. Plant Physiology126(4), 1471-1479.‏
  44. YIM, K. (2000). Gene expression prior to radicle emergence in imbibed tomato seeds. In Seed Biology: Advances and Applications: Proceedings of the Sixth International Workshop on Seeds, Mérida, México, 1999 (p. 231). CABI.‏


[1] abscission

[2] responsive elements

[3] Gel documentation

  1. References:

    1. Aeschbacher, R. A., Schiefelbein, J. W., & Benfey, P. N. (1994). The genetic and molecular basis of root development. Annual Review of Plant Biology45(1), 25-45.‏
    2. Bewley, J. D. (1997a). Seed germination and dormancy. The Plant Cell9(7), 1055.‏
    3. Bewley, J. D. (1997b). Breaking down the walls—a role for endo-β-mannanase in release from seed dormancy? Trends in Plant Science, 2(12), 464-469.‏
    4. Brummell, D. A., Harpster, M. H., Civello, P. M., Palys, J. M., Bennett, A. B., & Dunsmuir, P. (1999). Modification of expansin protein abundance in tomato fruit alters softening and cell wall polymer metabolism during ripening. The Plant Cell, 11(11), 2203-2216.‏
    5. Carpita, N. C., & Gibeaut, D. M. (1993). Structural models of primary cell walls in flowering plants: consistency of molecular structure with the physical properties of the walls during growth. The Plant Journal, 3(1), 1-30.‏
    6. Cho, H. T., & Cosgrove, D. J. (2002). Regulation of root hair initiation and expansin gene expression in Arabidopsis. The Plant Cell, 14(12), 3237-3253.‏
    7. Cho, H. T., & Kende, H. (1997). Expression of expansin genes is correlated with growth in deepwater rice. The Plant Cell, 9(9), 1661-1671.‏
    8. Choi, D., Cho, H. T., & Lee, Y. (2006). Expansins: Expanding importance in plant growth and development.  Physiologia Plantarum, 126(4), 511-518.‏
    9. Cosgrove, D. J. (1993). Water uptake by growing cells: an assessment of the controlling roles of wall relaxation, solute uptake, and hydraulic conductance.International Journal of Plant Sciences, 10-21.
    10. ‏Cosgrove, D. J. (1998). Cell wall loosening by expansins. Plant Physiology, 118(2), 333-339.‏
    11. Cosgrove, D. J. (1999). Enzymes and other agents that enhance cell wall extensibility. Annual Review of Plant Biology, 50(1), 391-417.‏
    12. Cosgrove, D. J. (2000a). Expansive growth of plant cell walls. Plant Physiology and Biochemistry, 38(1), 109-124.‏
    13. Cosgrove, D. J. (2000b). Loosening of plant cell walls by expansins. Nature,407(6802), 321-326‏
    14. Davies, P. J. (2010). The plant hormones: their nature, occurrence, and functions. In Plant Hormones (pp. 1-15). Springer Netherlands.‏
    15. Dunsmuir, P. (1999). Differential expression of expansin gene family members during growth and ripening of tomato fruit. Plant Molecular Biology, 39(1), 161-169.‏
    16. Fudali, S., Janakowski, S., Sobczak, M., Griesser, M., Grundler, F. M., & Golinowski, W. (2008). Two tomato α‐expansins show distinct spatial and temporal expression patterns during development of nematode‐induced syncytia. Physiologia Plantarum, 132(3), 370-383.‏
    17. Garcia, D., Gerald, J. N. F., & Berger, F. (2005). MateRNAl control of integument cell elongation and zygotic control of endosperm growth are coordinated to determine seed size in ArabidopsisThe Plant Cell, 17(1), 52-60.‏
    18. Groot, S. P., Kieliszewska-Rokicka, B., Vermeer, E., & Karssen, C. M. (1988). Gibberellin-induced hydrolysis of endosperm cell walls in gibberellin-deficient tomato seeds prior to radicle protrusion. Planta, 174(4), 500-504.‏
    19. Kam, M. J., Yun, H. S., Kaufman, P. B., & Chang, S. C. (2005). Two expansins, EXP1 and EXPB2, are correlated with the growth and development of maize roots. Journal of Plant Biology48(3), 304-310.‏
    20. Lee, D. K., Ahn, J. H., Song, S. K., Do Choi, Y., & Lee, J. S. (2003). Expression of an expansin gene is correlated with root elongation in soybean.Plant Physiology, 131(3), 985-997.‏
    21. Lee, Y., Choi, D., & Kende, H. (2001). Expansins: Ever-expanding numbers and functions. Current Opinion in Plant Biology4(6), 527-532.‏
    22. Malekpour M., & Abbasi, A. R., (2013). Height and leaf increase of transgenic tobacco AtEXPA18 plant Iranian Journal of Crop Science, 45(3), 389-398. (In Persian)
    23. McQueen-Mason, S. J. (1995). Expansins and cell wall expansion. Journal of Experimental Botany, 46(11), 1639-1650.‏
    24. McQueen-Mason, S., & Cosgrove, D. J. (1994). Disruption of hydrogen bonding between plant cell wall polymers by proteins that induce wall extension. Proceedings of the National Academy of Sciences91(14), 6574-6578.‏
    25. Milioni, D., Sado, P. E., Stacey, N. J., Domingo, C., Roberts, K., & McCann, M. C. (2001). Differential expression of cell-wall-related genes during the formation of tracheary elements in the Zinnia mesophyll cell system. In Plant Cell Walls (pp. 221-238). Springer Netherlands.‏
    26. Moore, R. C., Flecker, D., & Cosgrove, D. J. (1995). Expansin action on cells with tip growth and diffuse growth. Journal of Cellular Biochemistry Supplement. 21A., 457. (Abstract J5–312).
    27. Nonogaki, H., & Morohashi, Y. (1996). An endo-[beta]-mannanase develops exclusively in the micropylar endosperm of tomato seeds prior to radicle emergence. Plant Physiology, 110(2), 555-559.‏
    28. Nonogaki, H., Gee, O. H., & Bradford, K. J. (2000). A germination-specific endo-β-mannanase gene is expressed in the micropylar endosperm cap of tomato seeds. Plant Physiology, 123(4), 1235-1246.‏
    29. Ohta, S., Mita, S., Hattori, T., & Nakamura, K. (1990). Construction and expression in tobacco of a β-glucuronidase (GUS) reporter gene containing an intron within the coding sequence. Plant and Cell Physiology, 31(6), 805-813.‏
    30. Ozga, J. A., & Reinecke, D. M. (1999). Interaction of 4-chloroindole-3-acetic acid and gibberellins in early pea fruit development. Plant Growth Regulation, 27(1), 33-38.‏
    31. Ozga, J. A., van Huizen, R., & Reinecke, D. M. (2002). Hormone and seed-specific regulation of pea fruit growth. Plant Physiology, 128(4), 1379-1389.‏
    32. Pezzotti, M., Feron, R., & Mariani, C. (2002). Pollination modulates expression of the PPAL gene, a pistil-specific β-expansin. Plant Molecular Biology, 49(2), 187-197.‏
    33. Ruan, Y. L., Patrick, J. W., Bouzayen, M., Osorio, S., & Fernie, A. R. (2012). Molecular regulation of seed and fruit set. Trends in Plant Science17(11), 656-665.‏
    34. Sánchez, R. A., Sunell, L., Labavitch, J. M., & Bonner, B. A. (1990). Changes in the endosperm cell walls of two Datura species before radicle protrusion.Plant Physiology, 93(1), 89-97.‏
    35. Schiefelbein, J. W., Masucci, J. D., & Wang, H. (1997). Building a root: the control of patterning and morphogenesis during root development. The Plant Cell, 9(7), 1089.‏
    36. Shahnejat Bushehri, S., Abbasi, A. R., Alizadeh, H. (2012). Overexpression of AtEXPA18 in Arabidopsis thaliana. Modern Genetics, 7(4), 363-370. (In Farsi)
    37. Shin, J. H., Jeong, D. H., Park, M. C., & An, G. (2005). Characterization and transcriptional expression of the α-Expansin gene family in rice. Molecules and Cells, 20(2), 210-218.‏
    38. Toorop, P. E., van Aelst, A. C., & Hilhorst, H. W. (2000). The second step of the biphasic endosperm cap weakening that mediates tomato (Lycopersicon esculentum) seed germination is under control of ABA. Journal of Experimental Botany51(349), 1371-1379.‏
    39. Varner, J. E., & Lin, L. S. (1989). Plant Cell Wall ArchitectureCell56(2), 231-239.‏
    40. Vissenberg, K., Martinez-Vilchez, I. M., Verbelen, J. P., Miller, J. G., & Fry, S. C. (2000). In vivo colocalization of xyloglucan endotransglycosylase activity and its donor substrate in the elongation zone of Arabidopsis roots. The Plant Cell, 12(7), 1229-1237.‏
    41. Watkins, J. T., Cantliffe, D. J., Huber, D. J., & Nell, T. A. (1985). Gibberellic acid stimulated degradation of endosperm in pepper. Journal of the American Society for Horticultural Science110(1), 61-65.‏
    42. Whitney, S. E., Gidley, M. J., & McQueen‐Mason, S. J. (2000). Probing expansin action using cellulose/hemicellulose composites. The Plant Journal, 22 (4), 327-334.‏
    43. Wu, Y., Thorne, E. T., Sharp, R. E., & Cosgrove, D. J. (2001). Modification of expansin transcript levels in the maize primary root at low water potentials. Plant Physiology126(4), 1471-1479.‏
    44. YIM, K. (2000). Gene expression prior to radicle emergence in imbibed tomato seeds. In Seed Biology: Advances and Applications: Proceedings of the Sixth International Workshop on Seeds, Mérida, México, 1999 (p. 231). CABI.‏