مقدمه

درخت سرخدار (Taxus spp, Taxaceae; 2n=2x=24) از خانواده بازدانگان است که عموماً به شکل درختچه‌هایی کند رشد، همیشه‌­سبز در عرض‌های میانی نیمکره‌ی شمالی با کمی نفوذ به مناطق گرمسیری گسترده شده ‌است (Wang et al., 2011). جنس تاکسوس شامل 9 گونه است؛ که تنها گونه‌ی سرخدار اروپایی (Taxus baccata L.) به‌طور گسترده در ایران یافت می‌شود  و در ارتفاع ۹۰۰ تا ۲۰۰۰ متری رشته کوه‌های البرز از آستارا تا جنگل‌های علی‌آباد استان گلستان پراکنده گردیده است (Nasiry et al., 2015 Davarpanah, 2014;). این جنس قادر به تولید گروهی از دی­ترپنوئیدها به­نام تاکسان (Taxane) می‌باشد. پر‌‌‌‌‌‌استفاده‌ترین داروی ضد سرطان یعنی تاکسول (Taxol) همراه با ۲ پیش‌ساز مهم در ساخت نیمه­صنعتی آن یعنی باکاتین تری (III BAC) و۱۰- دی استیل باکاتین تریDAB)  ـ 10) مهم‌ترین تاکسان‌هایی هستند که تاکنون شناخته شده‌اند (Zhao et al., 2015; Cragg & Newman, 2005). غلظت تاکسول و پیش‌سازهای آن در درخت به‌حدی کم است که استخراج به‌طور مستقیم از پوسته درخت و یا نیمه­سنتز از پیش‌سازها مقرون به‌صرفه نمی‌باشد و سنتز کامل تاکسول نیز به‌علت پیچیدگی مولکول و مسیر بیوسنتز مقدور نمی‌باشد (Malik et al., 2011). طی دو دهه گذشته، کشت درون­شیشه‌ای به‌ویژه کشت سلول، مطلوب‌ترین روش در این زمینه شناخته شده است و روش‌هایی چون غربال لاین‌های سلولی با عملکرد بالا، بهینه­سازی شرایط کشت، استفاده از محرک‌ها و پیش‌سازها، کشت دو فاز، مهندسی متابولیت و ... منجر به بهبود عملکرد در کشت سلول گردیده است .(Ranisree et al., 2004)  استفاده از محرک‌ها یکی از موثرترین تکنیک‌هایی است که در حال حاضر برای بهینه‌سازی تولید بیوتکنولوژیکی متابولیت‌های ثانویه به‌کار می‌رود (Ramirez-Estrada et al., 2016 محرک‌ها با تحریک سیگنال‌های سلولی، به‌صورت مستقیم و غیر‌مستقیم، بیان ژن‌های مرتبط با مسیر را تحریک کرده و موجب افزایش تولید متابولیت‌‌های ثانویه می‌گردند (Gorelick & Bernstin, 2014). همچنین از محرک‌ها برای شناسایی مسیرهای سیگنال‌دهی در تولید متابولیت‌های ثانویه استفاده شده است (Zhao et al., 2003) گرچه نحوه عمل محرک‌ها به‌‌خوبی شناخته نشده است اما عوامل متعددی چون پیام رسان‌های یون کلسیم، فسفریلاسیون پروتئین‌ها، فعال­سازی پروتئین کینازها و ... در این زمینه نقش دارند (Angelova et al., 2006). محرک‌ها دارای منشاء زیستی و غیر­زیستی می‌باشند. محرک‌های غیرزیستی شامل عوامل فیزیکی یا ترکیبات معدنی مانند نمک یا یون‌های فلزی می‌باشند که می‌توانند تولید متابولیت ثانویه را در کشت سلول و ریشه مویین گونه‌های مختلف گیاهی افزایش دهند (Baenas et al., 2014).

از محرک‌های مختلف برای مشاهده تاثیر آنها بر افزایش تاکسان‌ها در سرخدار استفاده گردیده است. در بررسی اثر محرک‌های غیر‌زیستی در میزان تجمع تاکسان‌ها در T. media، حداکثر تولید در حضور متیل­جاسمونات و وانادیل­سولفات به‌دست آمد و نشان داده شد که تولید تاکسان‌ها علاوه بر نوع محرک، به مرحله رشدی سلول‌ها نیز وابسته است
.(Bonfill et al., 2003) همچنین اعمال متیل­جاسمونات بر T. cuspidata موجب افزایش متفاوتی در بیان ژن‌های مسیر تولید تاکسول گردید که نشان داد رونوشت ژن‌هایی که در انتهای مسیر قرار دارند بسیار کمتر از رونوشت ژن‌های ابتدای مسیر افزایش می‌یابد که حاکی از اهمیت این ژن‌ها برای مهندسی متابولیت بود (Nims et al., 2006). به‌علاوه نشان داده شد که دو محرک سالیسیلیک­اسید و متیل­جاسمونات فعالیت دو آنزیم۱۰- دی استیل باکاتین III -۱۰ O- استیل ترانسفراز و سیتوکروم P450 را افزایش و تولید تاکسول را القا می‌کنند و در واقع سنتز تاکسول با فعالیت این آنزیم‌ها رابطۀ مستقیم دارد
(Zhang et al., 2011). گرچه در T. yannanesis، یون لنتانوم باعث القا تولید و آزادسازی تاکسول گردید اما در T. chinensis تأثیر چندانی بر تولید تاکسول نداشت که نشان داد اثر محرک به لاین سلولی نیز وابسته است (Wu et al., 2001). به‌طور جالبی استفاده از سه محرک کیتوزان، متیل­جاسمونات و نقره برکشت T. chinensis نشان داد که استفاده ترکیبی از این سه محرک باعث افزایش تاکسول به چهل برابر کنترل، ده برابر استفاده تنها از نقره، شش برابر استفادۀ تنها از کیتوزان و دو برابر استفاده تنها از متیل­جاسمونات می‌باشد که استدلال شد محرک‌‌های مختلف­، پاسخ­های دفاعی متفاوتی را القا می‌کنند. اثر هم‌افزایی محرک‌‌ها بر افزایش بیان ژن‌ها بعد‌ها نیز مورد تایید قرار گرفت (Zhang et al., 2000; Sabater-Jara & Pedrene, 2013). استفاده از ترکیب وانادیل­سولفات، نیترات­نقره و کلرید کبالت در T. baccata میزان تاکسول را به 6/5 برابر کنترل رساند؛ در حالی­که استفاده از ترکیب سالیسیلیک­اسید، متیل­جاسمونات و محرک قارچی آن را به شانزده برابر کنترل رساند (Yari Khosroushahi et al., 2005). نمک‌های مس نیز به­صورت موفقیت­آمیزی در برخی سلول‌های گیاهی مورد استفاده قرار گرفته‌اند. در این زمینه استفاده از سولفات­مس همراه با ترکیب محرک زیستی قارچ باعث افزایش ده برابری سنگوئینارین (Sanguinarine) در خشخاش گردید (Balažová et al., 2008). همچنین استفاده از سولفات­مس در کشت سلولی Thalicrum rugosum  نه تنها باعث افزایش تولید متابولیت بربرین Berberine)) گردید، بلکه با تغییر نفوذ­پذیری غشاء موجب افزایش ترشح بربرین از سلول به محیط کشت شد Kim et al., 1991)). سولفات­مس در گیاه پنیر باد نیز موجب افزایش بیان ژن‌های مسیر تولید ویتافرین(Withaferin)  گردیده و میزان این متابولیت به چهارده برابر شاهد رسید ((Baldi et al., 2008. در پژوهش حاضر با توجه به اهمیت ویژه تاکسان‌ها در صنعت داروسازی جهان، با هدف افزایش این ترکیب دارویی ارزشمند، اثر محرک غیرزیستی سولفات­مس بر میزان تولید تاکسول و۱۰-دی استیل باکاتین  III(10-DAB) در شرایط آزمایشگاهی مورد بررسی قرار گرفت. همچنین به­منظور بررسی مکانیسم عمل محرک بر بیان ژن‌های درگیر در چرخه تولید آنها در کشت سوسپانسیون سلولی  T. baccata مورد مطالعه قرار گرفت.

C                                                   B                                             A                    

شکل ۱. کشت‌های سرخدار A) القا پینه در محیط جامد، B) پینه‌های رشد­یافته پس از پنج واکشت در محیط کشت جامد، C) سوسپانسیون سلولی پس از پنج واکشت در محیط کشت مایع

Figure 1. Taxus baccata cell cultures A) Callus induction in solid medium B) Calluse after five subcultures in a solid culture medium C) Cell suspension after five subcultures in a liquid medium

مواد و روش‌ها

مواد گیاهی و شرایط کشت

سرشاخه‎های جوان گیاه T. baccata   از گیاه مادری کاشته­شده در پردیس کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه تهران جمع‌آوری گردید. ریزنمونه‌ها ابتدا به‌مدت ۳ ساعت آبشویی شده سپس با اتانول۷۰٪ به‌مدت ۳۰ ثانیه و سدیم هیپوکلریت ۵٪ به‌مدت ۱۴ دقیقه ضدعفونی سطحی شده و سپس سه بار شستشو با آب مقطر استریل در زیر هود صورت گرفت. قطعات ساقه به طول ۵/۰ سانتی­متر بریده شده و روی محیط B5 (Gamborge et al., 1968) با ۲ میلی‌گرم بر لیتر نفتالین استیک اسید، ۲/۰ میلی‌گرم بر لیتر کینیتین، ۲/۰ میلی‌گرم بر لیتر توفوردی، ۵۰۰ میلی‌گرم بر لیتر پی­وی­پی، ۳۰ گرم بر لیتر ساکاروز و ۸ گرم بر لیتر آگار در تاریکی و دمای ۲۵ درجه سانتی­گراد برای القاء پینه نگهداری شده و هر سه هفته یکبار واکشت­کردن در محیط یکسان با قبل صورت پذیرفت. پس از حداقل پنج واکشت، ایجاد سوسپانسیون سلولی، با قرار دادن  ۵/۲ گرم پینه شفاف در ۱۰۰ میلی­لیتر محیط کشت در ارلن‌‌های ۲۵۰ میلی‌لیتر آغاز شده و ارلن‌ها بر روی شیکر با سرعت ۱۰۰ دور در دقیقه در تاریکی و دمای ۲۵ درجه سانتی­گراد قرار گرفتند (شکل۱). پس از حداقل سه واکشت و همسان‌سازی سلول‌ها، در فاز نمایی رشد سلول‌ها (روز هفتم)، سوسپانسیون‌ها با محلول سولفات­مس با دو غلظت ۱۲۵/۰، ۶۲۵/۰ میلی‌گرم بر لیتر (به­ترتیب معادل با ۵ و ۲۵ برابر سولفات­مس در محیط کشتB₅ ) تیمار شدند‌. برای هر بازه زمانی یک شاهد در نظر گرفته شد و به ارلن‌های شاهد در حجم برابر با محرک آب مقطر اضافه گردید. پینه‌های رشد­یافته در بازه‌های زمانی، دو روز و هفت روز بعد از اعمال تیمار با استفاده از کاغذ صافی جمع­آوری و در دمای ۸۰- درجه سانتی­گراد نگهداری شدند.

اندازه‌‌‌گیری تاکسول و ۱۰-دی استیل باکاتین III ابتدا جهت عصاره‌گیری، نمونه‌های سلولی توسط فریز درایر، خشک و پس از ۱۶ ساعت شیک­شدن در محلول متانول: آب (1:9 حجمی/حجمی) و ۱۰ دقیقه اولتراسونیک، با کمک ارلن خلاء و فیلتر  ۲۲/۰ میکرو متر صاف شده و جداسازی تاکسان‌ها از سایر مواد با استفاده از قیف جداکننده و حلال دی کلرومتان صورت پذیرفت. در نهایت حلال توسط روتاری تبخیر گردیده و عصاره خشک در ۱ میلی‌لیتر استونیتریل HPLC  حل شد. برای اندازه‌گیری تاکسول و ۱۰- دی استیل باکاتین III  (10-DAB) از دستگاه HPLC مدل کنوئر آلمان (Knauer) همراه پمپ کنوئر (k-1001)، دتکتور کنوئر (k-2800)، ستون C8
 (mm, Perfectsil 250×46) و سیستم پردازش اطلاعات با نرم­افزار کرومگت (Chrom-Gate) استفاده گردید. ترکیب استونیتریل: آب (۵۵:۴۵ حجمی/حجمی) به‌عنوان فاز متحرک، سرعت جریان ۱ میلی­لیتر بر دقیقه و مقدار نمونه تزریق­شده ۲۰ ماکرولیتر بود. شناسایی پیک‌ها با مقایسه زمان خروج پیک (Retention time) و طیف جذبی UV با استانداردهای تاکسول (سیگما) و باکاتینIII (سیگما) که در غلظت‌های متفاوت، پیش‌تر به دستگاه تزریق شده بود صورت گرفت. در نهایت سطح پیک متناسب با میزان تاکسان در نظر گرفته شد.

استخراج RNA، سنتز cDNA و تکثیر ژن

 جهت استخراج RNA از ترکیبی از روش‌های استخراج با CTAB (Liao et al., 2004; Kai et al., 2006; Jaakola et al., 2001; Chang et al., 1993) استفاده گردید که با این روش، کیفیت و کمیت RNA بسیار مناسب بود. به اختصار ‌۲ گرم از سلول پودر شده با ازت مایع، با ۱۰ میلی‌لیتر بافر استخراج توسط ورتکس مخلوط و ۱۰ دقیقه در بن­ماری ۶۵ درجه سانتی­گراد قرار گرفت. سپس با حجم مناسبی از کلروفرم: ایزوآمیل (۲۴:۱ حجمی/حجمی)  مخلوط و ۱۰ دقیقه سانتریفیوژ با ۱۳۰۰ دور در دقیقه در ۴ درجه سانتی­گراد صورت گرفت (دو بار تکرار). در ادامه فاز رویی با ۲/۱ حجم از سدیم­استات ۳ مولار مخلوط و ۳۰ دقیقه در -۲۰ درجه سانتی­گراد قرار گرفت. سپس مایع رویی با ۴/۱ حجم از کلراید لیتیوم ۱۰ مولار مخلوط و ۱۶ ساعت در ۴ درجه سانتی­گراد قرار گرفت. در نهایت ۳۰ دقیقه سانتریفوژ با ۱۴۰۰ دور در دقیقه در ۴ درجه سانتی­گراد صورت گرفته و پلیت RNA توسط اتانول۷۰٪ شسته­شده و پس از خشک­شدن در آب دپس DEPC حل شد. سپس جهت تایید کمیت و کیفیت، غلظت RNA  توسط نانودراپ ((Nano Drop بررسی و از الکتروفورز ژل آگاروز ۱٪ برای تایید کیفیت و یکپارچگی RNA هر نمونه استفاده‌ شد (شکل ۲). برای ساخت cDNA از کیت فرمنتاز(Fermentas)  بر طبق پروتکل شرکت سازنده استفاده شد و کیفیت cDNA با واکنش PCR و ژل آگاروز ۱٪ چک گردید. آنالیزهای  Real time PCRچهار ژن dbat, ts ,bapt ,dbtnbt که توسط Onrubia et al. (2010) از جمله ژن‌‌های کلیدی در مراحل اولیه و انتهایی بیوسنتز تاکسول عنوان شده‌اند و ژن خانه‌دار اکتین Actin)), با استفاده از پرایمرهای اختصاصی (جدول ۱) و کیت سایبرگرین ((SYBER Green PCR Mastermix توسط دستگاه کیاژن ((QIAGEN real time PCR system انجام شد. داده‌های خام به­صورت چرخه آستانه یا Ct (Threshold cycle) به­دست آمده و با در نظر گرفتن سه تکرار برای هر نمونه، تفاوت در مقدار Ct  بین یک نمونه و کنترل به­صورت سطح تغییر نسبت به کنترل بیان گردید. سطوح نسبی رونویسی با استفاده از روش 2 ^-∆∆CT محاسبه گردید.

آنالیز آماری

تمامی آزمایش‌ها با سه تکرار مستقل در قالب یک طرح کاملا تصادفی انجام شدند. میانگین داده‌ها با استفاده از نرم­افزار SAS توسط آزمون دانکن با در نظر گرفتن سطح اطمینان 0.05 ≤ P مورد تجزیه واریانس یک عاملی قرار گرفت.

شکل ۲. نمونه‌ای از RNA کل استخراج­شده از نمونه‌های تیمارشده با سولفات­مس. در ژل، دو باند مربوط به rRNA، S۲۸ و S۱۸به‌وضوح قابل­مشاهده می‌باشند.

Figure 2. A sample of total RNA extracted from samples, which treated with copper sulfate. In the gel, 2 rRNA bands; 28s and 18s are clearly revealed.

نتایج

در مطالعه حاضر نتایج حاصل از اندازه‌گیری میزان تاکسول و 10-DAB در زمان‌ها و غلظت‌های متفاوت توسط دستگاه HPLC نشان داد که تاثیر هر دو عامل زمان و غلظت معنی‌دار می‌باشد (جدول ۲). در ارتباط با تغییر 10-DAB نسبت به کنترل، غلظت متعادل (۱۲۵/۰ میلی‌گرم بر لیتر) سولفات­مس پس از هفت روز باعث افزایش 43٪ در میزان 10-DAB گردید، اما غلظت بالاتر (۶۲۵/۰ میلی‌گرم بر لیتر) گرچه پس از دو روز، افزایش جزیی را در بر‌داشت اما پس از‌ هفت روز منجر به کاهش 23٪ ‌گردید. در ارتباط با تغییر تاکسول نسبت به کنترل، غلظت متعادل سولفات­مس در هر دو زمان (دو و هفت روز) تاثیر معنی‌داری را ایجاد نکرد؛ اما غلظت بالاتر پس از هفت روز منجر به کاهش 16٪ در میزان تاکسول گردید، گرچه طی دو روز اول تاثیر معنی­داری را ایجاد نکرد. از این رو بهترین غلظت ۱۲۵/۰ میلی‌گرم بر لیتر و بهترین زمان هفت روز شناسایی شد و بهترین نتیجه از این تیمار در 10-DAB حاصل گردید (شکل3). در ادامه تحقیق از این غلظت مناسب (۱۲۵/۰ میلی‌گرم بر لیتر) جهت اعمال تیمار به‌منظور بررسی بیان ژن‌ها استفاده گردید. برای اولین بار Nimes et al. (2006) نشان داد که گرچه افزایش بیان در ژن‌های درگیر در مسیر تولید تاکسان‌ها در سرخدار به­سرعت بعد از استفاده محرک رخ می‌دهد، ولی حداکثر میزان تاکسان‌ها با فاصله طولانی‌تر از این زمان و معمولا در انتهای فاز ثابت رخ می‌دهد. این نتایج بارها توسط محققین دیگر نیز تایید گردید (Exposito et al., 2009; Onrubia et al., 2013a; Sabater-Jara & Pdreno, 2013). در توضیح این مطلب در تحقیقی توسط Onrubia et al. (2009) نشان داده شد که آنزیم‌های حاصل از این ژن‌ها، مدت‌ها پس از حذف رونوشت پایدار و فعال باقی می‌مانند. از این­رو مطالعات بررسی بیان ژن‌ها در سرخدار، معمولا در طی ۴۸ ساعت اول پس از اعمال تنش صورت می‌گیرد. در تحقیق حاضر نیز از همین اصل جهت بررسی بیان ژن استفاده و ۱۲، ۲۴ و ۴۸ ساعت پس از اعمال تیمار (۱۲۵/۰ میلی‌گرم بر لیتر سولفات­مس) برداشت سلول‌ها صورت پذیرفت. در آنالیز حاصل از بررسی بیان ژن (شکل4) افزایش قابل­توجهی (۳/۵ برابر کنترل) در میزان بیان ژن  ,dbat۱۲ ساعت پس از اعمال تیمار مشاهده گردید که با روند کندتری (۳/۱ برابر کنترل) تا زمان ۲۴ ساعت ادامه پیدا کرده  و در زمان ۴۸ ساعت هم­سطح با کنترل به صفر نزدیک می‌شود. به­طور جالبی در ارتباط با ژن txs، کاهش بیان نسبت به کنترل مشاهده گردید، گرچه میزان این کاهش در زمان ۱۲ ساعت تفاوت معنی‌داری با کنترل نداشت ولی در زمان ۲۴ ساعت، به‌طور جدی باعث سرکوب میزان بیان (۳/۰ برابر کمتر از کنترل) گردید و همچنان مانندdbat  در زمان ۴۸ ساعت هم­سطح با کنترل به صفر نزدیک شد. در ارتباط با دو ژن bapt وdbtnbt  میزان بیان بسیار کمتر از دو ژن dbat  و  txs و در حد کنترل بود و در هیچ­یک از زمان‌های مورد مطالعه (۱۲، ۲۴ و ۴۸ ساعت) تفاوت معنی‌داری بین نمونه تیمار و کنترل مشاهده نگردید.

جدول ۱. توالی پرایمرهای مورد استفاده برای تکثیر ژن‌های مورد مطالعه.

Table 1. Sequences of the primers used to amplify the genes under study

جدول ۲. تجزیه واریانس میزان تاکسان­ها

Table 2. Variance analysis of Taxan

ns و **: به­ترتیب غیر معنی‌دار و معنی‌دار در سطح احتمال یک درصد

and nonsignificant, respectively  **, ns: significantly different at 1%

شکل3. مقایسه اثر غلظت و مدت زمان تیمار با سولفات­مس بر میزان A) تاکسول B) 10-DAB سرخدار. حروف متفاوت بالای نمودارها نشان‌دهنده معنی‌دار بودن در سطح ۵ درصد است.

Figure 3.  Comparison the effect of exposure time and concentration of copper sulfate on A) Taxol B) 10-DAB production. Signs with different letters indicate significant differences at p ≤ 0.05

شکل 4. سطوح بیان نسبی ژن‌های A) txs B   ) dbat، C   ) bapt، D) dbtnbt در کشت سوسپانسیون سلولی سرخدار تیمار­شده با غلظت ۱۲۵/۰ میلی‌گرم بر لیتر سولفات­مس. حروف متفاوت بالای نمودارها نشان‌دهنده معنی‌دار بودن در سطح ۵ درصد است.

Figure 4. Relative expression level of A) txs, B) dbat, C) bapt, D) dbtnbt genes in T.baccata cell suspension cultures treated with 0.125 mg/L copper sulfate. Signs with different letters indicate significant differences at p ≤ 0.05

استفاده از محرک‌های زیستی و غیر‌زیستی سبب افزایش تجمع متابولیت‌های ثانویه در بسیاری از گیاهان دارویی شده است. یون مس در مطالعات بسیاری به‌عنوان محرک بر روی گیاهان متفاوت اعمال شده‌ است. استفاده از یون مس در شکل سولفات و کلراید موجب القا تولید کومارین در خرفه و آفتابگردان گردید (Bhuiyan & Adachi., 2006; Gutierrez-Coronado et al., 1995). همچنین استفاده از سولفات­مس در کشت سوسپانسیون شوکران زهرآلود (Conium maculatum L.)  افزایش تولید فورانوکومارین (Furanocoumarins) را به‌دنبال داشت (Meier et al., 2015). به­علاوه استفاده از سولفات­مس در غلظت مناسب باعث افزایش سطح بتالاین (Betulain) در چغندر شد (Trejo-Tapia et al., 2001). همچنین با توجه به اثرات هم‌افزایی محرک‌ها، یون مس همراه با محرک‌های زیستی و غیر‌زیستی دیگر نیز به‌کار رفته است
 (Cho et al., 2008b). استفاده از یون مس در غلظت مناسب همراه با عصاره مخمر میزان دکورزینول (Decurinol angelete) را در کشت سلولی سنبل ختایی (Pueraria candollei) افزایش داد (Korsangruang et al., 2010). همچنین تیمار برگ‌های جدا شده از انگور با سولفات­مس همراه با محرک قارچی باعث القا تولید فیتوالکسین‌ها گردید (Aziz et al., 2003). همین محقق بعدها گزارش کرد که غلظت و زمان استفاده از یون مس، بر افزایش محتوای جینسنوئید (Ginsenoide) در گیاه جینسینگ موثر است (Aziz et al., 2006). این مطلب توسط محققین بسیاری تایید گردید. به‌عنوان نمونه غلظت  20میکرو مولار سولفات­مس منجر به القا تولید بتالین (Betalin) در کشت سلولی گل کاغذی (Bougainvillea) گردید و اولین نشانه‌های افزایش پس از ده روز مشاهده گردید در حالی­که در غلظت‌های بالاتر و پایین‌تر مدت بیشتری طول کشید تا نشانه‌های افزایش مشاهده گردد. در تنها تحقیق حاصل از تاثیر یون مس بر میزان تاکسول T. media نشان داده شد که مس تاثیری بر این تاکسان ندارد (Ciddi et al., 1995).

در مطالعه حاضر نیز نشان داده شد که یون مس نه­تنها تاثیری مثبتی بر میزان تاکسول ندارد حتی در غلظت ۶۲۵/۰ میلی‌گرم بر لیتر موجب کاهش این متابولیت نسبت به کنترل می گردد. گرچه تاکنون گزارشی در زمینه تاثیر مس بر سایر تاکسان‌های سرخدار وجود ندارد، مطالعه حاضر نشان داد که غلظت پایین­تر ۱۲۵/۰ میلی‌گرم بر لیتر در زمان طولانی‌تر (هفت روز) موجب افزایش در میزان 10-DAB می‌گردد. گرچه میزان این افزایش در مقایسه افزایش چندین برابری حاصل از برخی محرک‌ها مانند متیل­جاسمونات، کوروناتین، سیکلودکسترین ناچیز می­باشد (Onrubia et al., 2013b; Sabater-Jara & Pdreno, 2013). ولی همین میزان نیز با توجه به اهمیت سرخدار و اهمیت 10-DAB به‌عنوان یکی از پیش‌‌ساز‌های مهم در تولید تاکسول می‌تواند قابل­تامل باشد. اهمیت غلظت و مدت‌زمان تیمار و اثر متقابل این دو، در افزایش تاثیر محرک‌ها بر میزان تولید متابولیت‌های ثانویه توسط محققین بسیاری به اثبات رسیده است (Cho et al., 2008; Korsangruang et al., 2010). از این‌رو در مطالعات بعدی آزمون غلظت‌های دیگری از محرک سولفات­مس در زمان‌های متفاوتی از تیمار، خالی از فایده نخواهد بود. علاوه بر این با توجه به اثرات هم‌افزایی محرک‌ها بررسی تاثیر ترکیب سولفات­مس با سایر محرک‌های زیستی و غیرزیستی با اهمیت به‌نظر می‌رسد.

قابل ذکر است نتایج حاصل از مطالعه حاضر با نتایج (et al. (2012 Bhuvaneswari همسو می‌باشد. این محققین اعلام داشتند که در تاثیر کلرید مس بر گیمنا (Gymnema silvestre) بیشترین میزان جیمنمیک اسید (Gymnemic acide) در اثر غلظت‌های پایین محرک و زمان‌های طولانی حاصل می‌گردد و در صورت استفاده از غلظت‌های بالاتر، بهتر است برداشت زودتر صورت پذیرد. این محققین همچنین بیان داشتند که غلظت‌های بالا طی زمان باعث ایجاد سمیت و کاهش بیومس و به دنبال آن کاهش متابولیت می‌گردند. در تحقیق دیگری نتایجی کاملا مشابه با این مطالعه در تاثیر سولفات­مس بر انگشت دانه به­دست آمد (Bota & Deliu, 2011). گرچه به­صورت متضادی یون مس بر شبدر قرمز و کشت ریشه مویین کولئوس (Coleus forskohlii Briq) در غلظت‌های بالاتر و زمان طولانی‌تر نتایج بهتری را به‌دنبال داشتند (Kasporava et al., 2007; Reddy et al., 2012). در این موارد شاید بتوان تحمل بالای این گیاهان نسبت به سولفات­مس و یا واکنش‌های شیمیایی درونی در تجزیه ترکیبات سمی را در این زمینه موثر دانست. در توضیح این مطلب که با وجود افزایش پیش‌ساز 10-DAB تاثیر مثبتی در میزان تاکسول مشاهده نمی‌گردد، می‌توان اشاره نمود که چرخه تولید تولید تاکسول بسیار پیچیده بوده و فرایندهای شیمیایی بسیاری بر روی پیش‌ساز 10-DAB پیش از تبدیل به تاکسول اثرگذار است. قابل ذکر است که در گزارشات متعددی، با وجود افزایش قابل­توجه در پیش‌سازهای تاکسول، در میزان تاکسول تغییر چندانی صورت نپذیرفته است .(Exposito., 2009; Onrubia., 2010)

شکل ۵. مسیر بیوسنتز تاکسول به اختصار. آنزیم‌هایی که با ژن‌های مورد مطالعه کد می‌شوند با فلش مشخص شده‌اند. TXS (تاکسا‌‌ دی ان سنتتاز) ، DBAT (۱۰-دی‌استیل‌ باکاتین III۱۰-O-استیل ترانسفراز) ، BAPT (-C۱۳-فنیل پروپانویل CoA- ترانسفراز) و DBTNBT (دی‌بنزوئیل تاکسول N-بنزوئیل ترانسفراز). اقتباس از Onrubia et al. (2013a)

Figure 5. A concise depiction of taxol biosynthetic pathway. The enzymes encoded by the studied genes are marked with arrow. TXS, taxadiene synthase; DBAT, 10-deacetylbaccatin III-10-O-acetyltransferase; BAPT, C-13-phenylpropanoyl-CoA transferase; DBTNBT, debenzoyl taxol N-benzoyl transferase. Adapted from Onrubia et al. (2013a)

در این مطالعه همچنین بیان چهار ژن txs (کد کننده تاکسا‌‌ دی ان سنتتاز) که در مراحل اولیه بیوسنتز نقش دارد و تبدیل میانجی GGPP به  taxa-4,11-dieneرا عهده­دار است، dbat (کدکننده ۱۰-دی‌استیل‌ باکاتین III-۱۰-O-استیل ترانسفراز) که در اواسط مسیر بیوسنتز نقش دارد و تبدیل ۱۰- دی استیل باکاتین III به باکاتین III را عهده­دار است. Bapt (کد‌کننده -C۱۳-فنیل پروپانویل CoA- ترانسفراز) که اتصال حلقه جانبی فنیل آلانین به باکاتین III را انجام می­دهد و dbtnbt (کدکننده دی‌بنزوئیل تاکسول N-بنزوئیل ترانسفراز) که در آخرین مرحله تولید تاکسول نقش دارد، بررسی شد (شکل۵). قابل ذکر است که دو آنزیم آخر به­‌عنوان ترانسفرازهای پایانی شناسایی می­شوند. در مطالعه حاضر میزان کم بیان و در حد‌کنترل دو ژن پایانی دور از انتظار نبوده و در مطالعات بسیاری رونوشت ترانسفرازهای پایانی (dbtnbt و bapt) بسیار کمتر از رونوشت سایر ژن‌ها گزارش شده است (Nimes et al., 2006). به‌علاوه این محققین پیشنهاد نمودند که این ترانسفرازهای پایانی محدود کننده نرخ بیوسنتز تاکسول می‌باشند. همچنین در این مطالعه کاهش بیان txs نسبت به کنترل مشاهده گردید. Yousefi et al. (2015) نشان داد که با افزایش غلظت محرک مس بیان ژن DXR درگیر در تولید متابولیت کاهش می‌یابد. همچنین در مطالعه دیگری استفاده از یون مس موجب کاهش بیان ژن FNS₁  مسیر تولید متابولیت گردید (Shahbazi & Riahimadvar, 2014). در نهایت محققین کاهش بیان ژن‌ها را مرتبط با تجمع و تاثیر ترکیبات سمی تولید شده توسط یون‌های مس (مانند ROS ,H₂O₂ و...) بر ماکرو مولکول‌های زیستی دانستند (Adriano et al., 2001). قابل ذکر است که چرخه بیوسنتز تاکسول بسیار پیچیده بوده و بسیاری از ژن‌ها و آنزیم‌های در­گیر در این مسیر تاکنون شناخته نشده‌اند و افزایش و کاهش بیان یک ژن، به­طور قطع منجر به تغییر در میزان متابولیت نمی‌گردد و مسیرها و پروتئین‌های بسیاری در این زمینه نقش خواهند داشت (Ramirez-Estrada., 2014).

نتیجه­گیری کلی

مطالعه حاضر نشان داد در حالی­که غلظت پایین‌تر محرک در زمان طولانی‌تر موجب افزایش در میزان 10-DAB می‌گردد اما غلظت بالاتر در همین مدت­زمان، باعث کاهش میزان 10-DAB و تاکسول می‌گردد. با توجه به تحقیقات پیشین، ایجاد سمیت در غلظت‌های بالا و زمان طولانی می‌تواند دلیل کاهش متابولیت باشد. در بررسی بیان ژن، از آنجا که دو ژن پایانی، عوامل محدود­کننده تولید تاکسول شناخته می‌شوند میزان کم بیان، دور از انتظار نیست. همچنین با توجه به سایر مطالعات، کاهش بیان txs نسبت به کنترل می‌تواند مرتبط با تجمع و تاثیر ترکیبات سمی تولید­شده توسط یون‌های مس بر ماکرو مولکول‌های زیستی باشد. چرخه بیوسنتز تاکسول بسیار پیچیده بوده و افزایش و کاهش بیان یک ژن به‌طور قطع منجر به تغییر میزان متابولیت نمی‌گردد و تحقیقات بیشتری در این زمینه مورد نیاز است.

REFERENCES

1. Adriano, D. C. (2001). Trace elements in terrestrial environments; Biochemistry, Bioavailability and Risk of Metals. Springer-Verlag, 37: 15-20.
2. Angelova, Z., Georgiev, S. & Roos, W. (2006). Elicitation of plants. Biotechnology & Biotechnological Equipment, 20: 72-83.
3. Aziz, A., Trotel-Aziz, P., Dhuicq, L., Jeandet, P., Couderchet, M. & Vernet, G. (2006). Chitosan oligomers and copper sulfate induce grapevine defense reactions and resistance to gray mold and downy mildew. Phytopathology, 96: 1188–1194.
4. Baenas, N., Garcia-Viguera., C. & Moreno, D. (2014). Elicitation: A tool for enriching the bioactive composition of foods. Molecules, 19: 13541–13563.
5. Balažová, A., Blanáriková, V., Bilka, F. & Bilková, A. (2008). Effect of combined biotic and abiotic elicitor on the sanguinarine formation in cell suspension cultures of Eschscholtzia californica. ACTA Faccultatis Pharmaceutical, 55: 58-63.
6. Baldi, A., Singh, D. & Dixit, D. K. (2008). Dual elicitation for improved production of withaferin a by cell suspension cultures of Withania somnifera. Appl Biochem Biotechnol, 151: 556–564.
7. Bhuiyan, M. N. & Adachi, T. (2003). Stimulation of betacyanin synthesis through exogenous methyl jasmonate and other elicitors in suspension-cultured cells of Portulaca. Plant Physiol, 160: 1117–1124.
8. Bhuvaneswari, C. H., Rao, K., Gandi, S. & Giri, A. (2012).Abiotic elicitation of gymnemic acid in the suspension cultures of Gymnema sylvestre. World J. Microbiol Biotechnol. 28: 741–747.
9. Bonfill, M., Palazón, J., Cusidó, R. M., Joly, S., Morales, C. & Piñol, M. T. (2003). Influence of elicitors on taxane production and 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase activity in Taxus media Plant Physiol Biochem, 41:91–6.
10. Bota, & Deliu, C. (2011). The effect of copper sulphat on the production of flavnoids in digitalis lanata cell cultures. Farmacia, 59: 21-8.
11. Chang, C., Puryear, P. & Cairney, C. (1993). A Simple and Efficient Method for Isolating RNA from Pine Trees. Plant Molecular Biology Report, 11(2): 23-29
12. Ciddi, V., Srinivasan, V. & Shuler, L. (1995). Elicitation of taxus cell for taxol production. Biotechnological level, 17 (12): 1343-1346.
13. Cragg, G. M. & Newman, D. J. (2005). Plants as a source of anti-cancer agents. Ethnopharmacol, 100: 72–79.
14. Cho, H. Y., Son, S. Y., Rhee, H. S., Yoon, S. Y. H., Lee-Parsons, C. W. & Park, J. M. (2008b). Synergistic effects of sequential treatment with methyl jasmonate, salicylic acid and yeast extract on benzophenanthridine alkaloid accumulation and protein expression in Eschscholtzia californica suspension cultures. Biotechnol, 135: 117–122.
15. Exposito, O., Bonfill, M., Onrubia, M., Jane, A., Moyano, E., M. Cusido, R., Palazon, J. & Pinol, T. (2009). Effect of taxol feeding on taxol and related taxan production in Taxus baccata suspension culture. New Biotechnology, 25: 41-48
16. Davarpanah, S. J., Lahouti, M. & Karimian, R. (2014). Micropropagation of common yew using embryo culture. Journal of Applied Biotechnology Reports, 1(2): 77- 80.
17. Fang, Y., Smith, M. A. L. & Pépin, M. F. (1999). Effects of exogenous methyl jasmonate in elicited anthocyanin-producing cell cultures of ohelo (Vaccinum pahalae). In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant, 35: 106-130
18. Gorelick, J. & Bernstein, N. (2014). Elicitation: An underutilized tool in the development of medicinal plants as a source of therapeutic secondary metabolites. Agronomy, 124: 201–230.
19. Gutierrez-Coronado, M. A., Parry, A., Tena, M., Jorrin, J. & Edwards, R. (1995). Abiotic elicitation of coumarin phytoalexins in sunflower. Phytochemistry, 38: 1185–1191.
20. Jaakola, L., Pirttila, A. M., Halonan, M. & Hohtola, A. (2001). Isolation of high quality RNA from bilberry (Vaccinium myrtillus L.) fruit. Mol Biotechnol, 19: 201–203.
21. Kai, G., Miaoa, Z., Zhang, L., Zhao, D., Liao, Z., Sun, X. & Zhao, L. (2006). Molecular cloning and expression analyses of a new gene encoding 3-hydroxy-3methylglutaryl-CoA synthase from Taxus media. Biol Plant, 50(3): 359–366.
22. Kasparova, M., Siatka, T. & Dusek, J. (2007). Abiotic elicitation of Trifolium pratense L. suspension culture, Slov. Farm, 56: 225-229.
23. Kim, D. I., Pedersen, H. & Chinc, K. (1991). Stimulation of berberine production in Thalicrum rugosum suspension cultures in response to addition of cupric sulphate, Lett, 13: 213-216.
24. Korsangruang, S., Soonthornchareonnon, N., Chintapakorn, Y., Saralamp, P. &
Prathanturarug S. (2010). Effects of abiotic and biotic elicitors on growth and isoflavonoid accumulation in Pueraria candollei candollei and P. candollei var. mirifica cell suspension cultures. Plant Cell Tiss Organ Cult, 103: 333–342.
25. Lakhotia, P., Singh K. P., Singh, S. K., Singh, M. C., Prasad, K.V. & Swaroop K. (2014). In uence of biotic and abiotic elicitors on production of betalain pigments in bougainvillea callus cultures. Indian J. Hort, 71(3): 373-378
26. Liao, Z., Chen, M., Guo, L., Gong, Y., Tang, F., Sun, X. & Tang, K. (2004). Rapid isolation of high-quality total RNA from Taxus and Ginkgo. Prep Biochem Biotechnol, 34(3): 209–214.
27. Malik, S., Cusido, R. M., Mirjalili, M. H., Moyano, E., Palazon, J. & Bonfill, M. (2011). Production of the anticancer drug taxol in Taxus baccata suspension cultures: A review. Process Biochemistry, 46: 23–34
28. Meier, P., Hotti, H. &. Rischer, H. (2015). Elicitation of furanocoumarins in poison hemlock (Conium maculatum L.) cell culture. Plant Cell Tiss Organ Cult, 36: 34-38 

29. Nasiri, J., Naghavi, M. R., Alizadeh, H., Moghadam, M. R. F., Mashouf, A. & Nabizadeh, M. (2015a). Modified AHP-based decision-making model toward accurate selection of eligible maintenance media for production of taxanes in Taxus baccata callus culture. Acta Physiol Plant, 37: 1–15.
30. Nims, E., Dubois, C. P., Roberts, S. C. & Walker, R. (2006). Expression profiling of genes involved in paclitaxel biosynthesis for targeted metabolic engineering. Meta-engineering, 8: 385–394.
31. Patil, R. A., Lenka, S. K., Normanly, J., Walker, E. L. & Roberts, S. C. (2014). Methyl jasmonate represses growth and affects cell cycle progression in cultured Taxus Plant Cell Rep, 33: 1479–1492
32. Onrubia, M., Moyano, E., Bonfill, M., Expósito, O., Palazón, J. & Cusidó, R.M. (2010). An approach to the molecular mechanism of methyl jasmonate and vanadyl sulphate elicitation in Taxus baccata cell cultures: the role of txs and bapt gene expression. Biochemical Engineering Journal, 53: 104–11.
33. Onrubia, M., Cusidó, R. M., Ramirez, K., Hernández-Vázquez, L., Moyano, E. & Bonfill, M. (2013a). Bioprocessing of plant in vitro systems for the mass production of pharmaceutically important metabolites: paclitaxel and its derivatives. Current Medicinal Chemistry, 20(7): 880–91.
34. Onrubia, M., Moyano, E., Bonfill, M., Cusidó, R. M., Goossens, A. & Palazón, J. (2013b). Coronatine, a more powerful elicitor for inducing taxane biosynthesis in Taxus media cell cultures than methyl jasmonate. Journal of Plant Physiology, 170(2): 211–229.
35. Ramirez-Estrada, K., Vidal-Limon., H, Hidalgo, Moyano, E., Golenioswki, M., Cusidó, R. M. & Palazon, J. (2014). Elicitation, an Effective Strategy for the Biotechnological Production of Bioactive High-Added Value Compounds in Plant Cell Factories. Molecules, 21: 182-189
36. Reddy, C. S., Praveena, C. h. & Veeresham, C. (2010). Strategies to Improve the Production of Forskolin from Hairy Root Cultures of Coleus forskohlii Briq. International Journal of Pharmaceutical Sciences and Nanotechnology. 5(2): 11-28
37. Sabater-Jara, A. B. & Pedreño, M. A. (2013). Use of à-cyclodextrins to enhance phytosterol production in cell suspension cultures of carrot (Daucus carota L.). Plant Cell Tissue and Organ Culture, 114: 249–58.
38. Shahbazi, A. & Riahimadvar, A. (2014). Forskolin Production and Gene Expression of 1-Deoxy-D-xylulose-5-PHosphate Reductoisomerase in Treated Coleus forskohlii Plant with Cu. Plant Production Technology. 14, 2 (In Farsi).
39. Trejo-Tapia, G., Jimenez-Aparicio, A., Rodriguez- Monroy, M., De Jesus-Sanchez, A. & Gutierrez- Lopez, G. (2001). In uence of cobalt and other microelements on the production of betalains and the growth of suspension cultures of Beta vulgaris. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 67: 19-23.
40. Wang, Y. F., Shi, Q. W., Dong, M., Kiyota, H., Gu, Y. C. & Cong, B. (2011). Natural taxanes: Developments since 1828. Chem Rev, 111: 7652–7709.
41. Wu, J. A., Wang, C. B. & Mei, X. (2001). Stimulation of taxol production and excretion in Taxus spp. cell cultures by rare earth chemical lanthanum. Journal of Biotechnology, 85: 67–73.
42. Yari Khosroushahi, A., Valizadeh, M., Ghasempour, A., Khosrowshahli, M., Naghdibadi, H., Dadpour, M. R. & Omidi, Y. (2005). Improved Taxol production by combination of inducing factors in suspension cell culture of Taxus baccata, Cell Biology International, 30: 262-269.
43. Yousefi, K., Riahi-Madvar, A. & Baghizadeh, A. (2011). Investigation of the effects of Ag and Cu elicitors on flavone synthase 1 gene expression and some biochemical parameters on Cuminum cyminum L. endemic to Iran, Journal of Plant Research 28,1 (In Farsi).
44. Zhang, C. H., Mei, X. G., Liu. L. & Yu, L. J. (2000). Enhanced paclitaxel production induced by the combination of elicitors in cell suspension cultures of Taxus chinensis. Biotechnology Letters, 22: 1561–156
45. Zhang, J. F., Gong, S. & Guo, Z. G. (2011). Effects of different elicitors on 10-deacetylbaccatin III-10-O-acetyl transferase activity and cytochrome P450 monooxygenase content in suspension cultures of Taxus cuspidata Cell Biol. Int. Rep. 18(1): art: e00009.
46. Zhao, J. & Sakai, K. (2003). Multiple signaling pathways mediate fungal elicitor-induced beta- thujaplicin biosynthesis in Cupressus lusitanica. Cell Cultures, 4: 647-656.
47. Zhao, C., Song, G., Fu, C., Dong, Y., Xu, H., Zhang, H. & YuL, J. (2015). A systematic approach to expound the variations in taxane production under different dissolved oxygen conditions in Taxus chinensis Plant Cell Rep, 29: 1–19.