استفاده از تشدیدکنندۀ ترجمۀ ویروسی و سرکوبگر خاموشی ژن 2b در ساخت ناقل دوتایی برای افزایش بیان پادگن حفاظتی و عامل کشندۀ باکتری مولد سیاه‌زخم

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشجوی دکتری اصلاح نباتات گرایش ژنتیک مولکولی و مهندسی ژنتیک، گروه زراعت و اصلاح نباتات، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه تهران، کرج

2 دانشیار، گروه زراعت و اصلاح نباتات، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه تهران، کرج

3 دانشیار، گروه زیست‌شناسی، دانشگاه امام حسین(ع)

4 استادیار، گروه زراعت و اصلاح نباتات، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه تهران، کرج

چکیده

باکتری اسپورزای Bacillus anthracis عامل بیماری سیاه­زخم (آنتراکس) است. سه جزء پروتئین شامل پادگن (آنتی­ژن) حفاظتی (PA)، عامل کشندۀ (LF) و عامل آماس (EF) عامل‌های بیماریزای این باکتری به شمار می‌آیند. به منظور تولید واکسن بر پایۀ گیاه، پروتئین امتزاجی دمین چهارPA  و دمین یک LF، با سایت برش فورینی به زیر واحد B سم Vibrio cholera (CTB) به‌عنوان محرک سامانۀ ایمنی متصل شد. همچنین در این تحقیق برای ساخت ناقل دوتایی از خاصیت ناحیۀ ′3 و ′5 غیرترجمه شوندۀ ویروس موزاییک لوبیا چشم­بلبلی به‌عنوان تشدیدکنندۀ ترجمه و از ژن بازدارندۀ خاموشی ویروس موزاییک خیار (2b) استفاده و ترکیب پادگن ساخته‌شده به گیاه منتقل شد. انتقال موقت سازه­ها با کمک اگروباکتریوم به توتون و کاهو انجام و بیان موقت در سطح ترانسکریپتوم از روش PCR RT- و در سطح پروتئوم از روش آزمون الایزا تأیید شد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

The use of viral translation enhancer and suppressor of gene silencing 2b to construct binary vector for high expression of protective antigen and lethal factor of the bacteria that cause anthrax

نویسندگان [English]

  • Fariba Abooie Mehrizi 1
  • Alireza Abbasi 2
  • Hossein Honari 3
  • Houshang Alizadeh 4
1 Ph.D. Student, Department of Agronomy and Plant Breeding, University College of Agriculture & Natural Resources, University of Tehran, Karaj, Iran
2 Associate Professor, University College of Agriculture & Natural Resources, University of Tehran, Karaj, Iran
3 Associate Professor, Department of Biology, Faculty of Basic Science, Imam Hossein University, Tehran, Iran
4 Assistant Professor, University College of Agriculture & Natural Resources, University of Tehran, Karaj, Iran
چکیده [English]

Bacillus anthracis as a spore-forming bacterium is the causative agent for anthrax. Three proteins from B. anthracis including protective antigen (PA), lethal factor (LF) and edema factor (EF) are causative factors of this bacteria. To produce plant-based vaccine, fusion protein of PA 4 domain and LF 1 domain via furin cleavage site joined to subunit B Vibrio cholera toxin (CTB) as an inducer of immune system. In this research we used 3’and modified 5’ untranslated regions of cowpea mosaic virus (CPMV) as translation enhancer and silencing inhibitor gene 2b of cucumber mosaic virus (CMV) to construct binary vector and transfer gene. Transient expression of tobacco and lettuce performed via agrobacterium and transient expression was confirmed at the level of transcriptome and proteome through RT-PCR and ELISA assay, respectively.

کلیدواژه‌ها [English]

  • CMV
  • CPMV
  • ELISA
  • transient expression
Arzola, L., Chen, J., Rattanaporn, K., Maclean, J.M & McDonald, K.A. (2011). Transient co-expression of post-transcriptional gene silencing suppressors for increased in planta expression of a recombinant anthrax receptor fusion protein. International Journal of Molecular Science, 12, 4975-4990.
Bhatnagar, R. & Batra, S. (2001). Anthrax toxin. Critical Reviews in Microbiology, 27, 167-200.
Bradford, M.M. (1976). Rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, 72, 248-254.
Brossier, F., Levy, M., Mock, M. & Sirard, J.C. (2000). Role of toxin functional domains in anthrax pathogenesis. Infection and Immunity, 68(4), 1781-1786.
Choi, M.S., Yoon, I.S., Rhee, Y., C, S.K., Lim, S.H., Won, S.Y., Lee, Y.H., Choi, H.S., Lee, S.C., Kim, K.H., Lomonossoff, G. & Sohn, S.H. (2008). The effect of cucumber mosaic virus 2b protein to transient expression and transgene silencing mediated by agro-infiltration. The Plant Pathology Journal, 24, 296-304.
Daniell, H., streatfield, S.J. & Wycoff, K. (2001). Medical molecular farming: production of antibodies, biopharmaceuticals and edible vaccines in plants. Trends in Plant Science, 6(5), 219-226.
Edwards, K.A., Clancy, H.A. & Baeumner, A.J. (2006). Bacillus anthracis: toxicology, epidemiology and current rapid-detection methods. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 384, 73-84.
Engvall, E. & Perlmann, P. (1971). Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) quantitative assay of immunoglobulin G. Immunochemistry, 8, 871-875.
Goto, K., Kobori, T., Kosaka, Y., Natsuaki, T. & Masuta, C. (2007). Characterization of silencing suppressor 2b of cucumber mosaic virus based on examination of its small RNA-binding abilities. The Plant Cell Physiology, 48, 1050-1060.
Guy, C., Haskell, D., Neven, L., Klein, P. & Smelser, C. (1992). Hydration-state-responsive protein link cold and drought stress in spinach. Planta, 188, 265-270.
Kapila, J., Rycke, R.D., Montagu, M.V. & Angenon, G. (1997). An agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves. Plant Science, 122, 101-108.
Koya, V., Moayeri, M., Leppla, S.H., Daniell, H. (2005). Plant-based vaccine: mice immunized with chloroplast-derived anthrax protective antigen survive anthrax lethal toxin challenge. Infection and Immunity, 8266-8274.
Marillonnet, S., Thoeringer, C., Kandzia, R., Klimyuk, V. & Gleba, Y. (2005). Systemic agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants. Nature Biotechnology, 23 (6), 718-723.
Mock, M. & Fouet, A. (2001). Anthrax. Annual Review of Microbiology, 55, 647-671.
Qu, F. & Morris, T. (2005). Suppressors of RNA silencing encoded by plant viruses and their role in viral infections. Virology Paper, 579(26), 5958-5964.
Brey, R.N. (2005). Molecular basis for improved anthrax vaccines. Advanced Drug Delivery Reviews, 57, 1266-1292.
Ruhlman, T., Ahangari, R., Devine, A., Samsam, M. & Daniell, H. (2007). Expression of cholera toxin B–proinsulin fusion protein in lettuce and tobacco chloroplasts–oral administration protects against development of insulitis in non-obese diabetic mice. Plant Biotechnology Journal, 5(4), 495-510.
Sainsbury, F., Thuenemann, E.C. & Lomonossoff, G.P. (2009). pEAQ: versatile expression vectors for easy and quick transient expression of heterologous proteins in plants. Plant biotechnology, 7, 689-693.
Sambrook, J. & Russell, D.W. (2001). Molecular cloning: A laboratory manual, 3rd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
Voinnet, O., Rivas, S., Mestre, P. & Baulcombe, D. (2003). An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus.  The Plant journal: for cell and molecular biology, 33(5), 949-56.
Wang, K. (2015). Agrobacterium protocol third edition, Methods in molecular biology 1223, Humana press.    
Watson J., Koya, V., Leppla, S.H. & Daniell, H. (2004). Expression of Bacillus anthracis protective antigen in transgenic chloroplasts of tobacco, a non-food/feed crop; Vaccine, 22, 4374-4384.
Weller, R.E. (2006). Risk of disease spread through bioterrorism. Veterinaria Italiana, 42(4), 351-367.
Wu, G. (2010). A chimeric protein that functions as both an anthrax dual-target antitoxin and a trivalent vaccine. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 54(11), 4750-4757.