مطالعه ژنتیکی نشانگر(های) مولکولی پیوسته به ژن‌های مقاومت به پوسیدگی ریزوکتونیایی ریشه چغندرقند (Beta vulgaris L.)

. مقدمه

چغندرقند یکی از دو محصول مهم تأمین ­کننده قند در جهان و تنها محصول ذخیره‌کننده ساکارز در نواحی مدیترانه است که سطح کشت جهانی آن بالغ بر 4/5 میلیون هکتار با عملکرد 281 میلیون تن ریشه و سطح کشت آن در ایران حدود 90 هزار هکتار با عملکرد پنج میلیون تن ریشه در سال 2023 برآورد شده است.(FAOSTAT, 2023)  کشت چغندرقند که حدود 35 درصد از تولید شکر جهان را به خود اختصاص می‌دهد، تحت تأثیر عوامل بیماری‌زای مختلف قرار دارد. یکی از مهمترین بیمارگرهایی که منجر به پوسیدگی ریشه چغندرقند می‌شود قارچRhizoctonia solani  می­باشد (Haque & Parvin, 2021). در ایران اکثر مناطق چغندرکاری تحت تأثیر این بیمارگر است (Soltani Nezhad, 2008). با شیوع این بیماری عملکرد، درصد قند و قابلیت سیلوپذیری ریشه‌های چغندرقند آلوده به شدت کاهش می‌یابد (Soltani Nezhad, 2008 Misra et al., 2023;).ریزوکتونیا از نظر تاکسونومیکی، تنوع ژنتیکـی، بیماری­زایی و اکولوژیکی یـک مجموعـه بـسیار متنـوع می‌باشد
(Wounde 2015; Mordue et al., 1989). این گونه عامل مرگ گیـاهچـه، پوسـیدگی ریـشه و طوقـه و بلایـت برگـی چغندرقند بوده ((Abawi et al., 1986; Pethybridge et al., 2018 و تنوع ژنتیکی بسیار بـالایی از جمعیـت آن گزارش گردیده است؛ لذا به آن، گونه مرکب اطـلاق شده است  .(Vi1ga1ys & Cubeta, 1994)

بیماری ناشی از R. solani در مرحله بلوغ به صورت پوسیدگی ریشه و طوقه یا گاهی اوقات پوسیدگی حفره‌ای دیده می­شود .(Pethybridge et al., 2018; Windels et al., 2009) دامنه وسیع میزبانی این قارچ در کنار توانایی بالای آن در فعال­بودن در خاک و مواد آلی، کنترل قارچ را دشوار می‌کند. پیشرفت‌های تحقیقات از نظر مدیریت این بیماری، شامل کاوش رویکردهای زیست فناوری و روش‌های جدید کنترل زیست‌‌شناسی می‌باشد. این راهبرد‌های نوآورانه، پتانسیل مدیریت پایدار بیماری، کاهش اتکا به قارچ‌کش‌های معمولی و به­حداقل­رساندن اثرات زیست‌محیطی را به دنبال دارد (Misra et al., 2023). مدیریت بیماری شامل تناوب زراعی با محصولات غیرمیزبان (Abawi et al., 1986 Hecker & Ruppel, 1977; Pethybridge et al., 2018;)، مدیریت صحیح علفهای هرز (Harveson, 2003)، تیمار بذر، کاربرد قارچ­کش در طول فصل (Pethybridge et al., 2018) و مدیریت زراعی (Schneider, 1982) در ترکیب با استفاده از گونه‌های مقاوم سازگار با مناطق تولید است. غربال‌گری مداوم خزانه‌ژنی، شناسایی منابع مقاومت و انتقال ژن‌های مقاومت از طریق برنامه‌های دورگ‌گیری به ارقام مناسب و قوی از موفق‌ترین روش‌ها برای کاهش پیامدهای منفی بیماری پوسیدگی ریشه و طوقه در چغندرقند است (Panella, 1998; Gaskil, 1968). همچنین توالی کامل ژنوم B.vulgaris ابزار ارزشمندی برای تحقیقات ژنومیک چغندرقند ایجاد کرده است
 (Norouzi et al., 2024).

با­توجه­به اینکه روشهای اصلاحی معمول برای مقاومت به این بیماری مشکل و زمان‌بر است، توسعه و شناسایی نشانگرهای مرتبط با مقاومت و تعیین مکان کنترل­کننده مقاومت به این بیماری می‌تواند به­طور قابل توجهی برنامه‌های اصلاحی مقاومت در برابر پوسیدگی ریشه را تسریع و چشم‌انداز جدیدی را برای پیشرفت‌های اصلاح گیاهان فراهم کند
 MirMohammadi Maibody & Golkar, 2019, Mirsa 2023, Norouzi et al., 2024)).

گرچه ژن‌های غالب نسبی (partial dominance)، (Hecker & Ruppel, 1977) و حتی تعدادی مکان ژنی کمی ((QTL‌ (Lein et al., 2008) برای مقاومت به این بیماری شناسایی شده‌اند، ولی این صفت کمی است و مبتنی بر حداقل دو جایگاه ژنی به همراه سایر ژن‌های کم‌اثر و تغییردهنده می‌باشد و سهم QTLهای کوچک و ژنومی را نمی‌توان رد کرد
 (Norouzi et al., 2024).

نظری (Nazari, 2011) از یک جمعیتF₂  چغندرقند حاصل تلاقی بین لاین مقاومFC-709-2  و لاین حساس 231، برای مکان­یابی ژنتیکی با کمک نشانگرهای ISSR، AFLP و STS استفاده کردند. از بین 75 نشانگر حاصل تنها یک نشانگرAFLP  با کمترین فاصله به آلل مقاومت و در حدود 2/19 سانتی­مورگان شناسایی شد. حسنی و همکاران (Hassani et al., 2018) چهار توالی SNP مرتبط با مقاومت به ریزوکتونیای چغندرقند شناسایی کردند که در مجموع 43 درصد تنوع فنوتیپی مقاومت را پوشش می‌داد. راوی و همکاران (Ravi et al., 2022) با غربال هزاران توالی SNP موفق شدند یک نشانگر SNP برای ژن مقاومت به ریزوکتونیا در چغندرقند به­دست آورند که حدود 10 درصد تنوع فنوتیپی صفت را پوشش می‌داد. همچنین محققان در شرکت تولید بذر KWS آلمان در پژوهشی روی نشانگرهای پیوسته با مقاومت به این بیماری در گلخانه، تعداد پنج QTL (3-2 ژن اصلی و تعداد زیادی ژن تغییردهنده) شناسایی کردند.(Rajabi & Aghaeezadeh, 2013)

یکی از بهترین و سریع‌ترین نشانگرهای مولکولی در بررسی چندشکلی، نشانگر SSR یا ریزماهواره می­باشد. نشانگرهای SSR در ژنوم تمام یوکاریوت‌ها وجود دارد (Li et al., 2010). SSRها به دلیل فراوانی زیادشان برای مکان‌یابی ژنتیکی و مطالعه جمعیت، نشانگرهای ایده‌الی هستند و استفاده از آنها بسیار ساده و راحت می­باشد (Naghavi et al., 2005).

در بین تمام تکنیک‌های مولکولی، نشانگرهای ریزماهواره به دلیل داشتن خصوصیات همچون وراثت همبارز، فراوانی و تکرارپذیری بالا، چندشکلی زیاد، قابلیت انتقال به گونه‌های خویشاوند، توزیع در نواحی مختلف ژنوم (در هر دو نواحی رمز کننده coding و غیر رمزکننده non coding)، ماهیت چند‌اللی و پوشش وسیع ژنوم به­طور گسترده‌ای به منظور بررسی تنوع ژنتیکی استفاده می‌شوند (Hag et al., 2014). همچنین سهولت آشکار‌سازی و تشخیص آنها به­وسیله کاربرد واکنش زنجیره‌ای پلیمراز با دو آغازگر اختصاصی که از برخی نواحی مجاور ریزماهواره (Flanking region) طراحی می‌شود از دیگر مزایای آنهاست
 (Sharma et al., 2014).

در روش معمول از ارزیابی فنوتیپی مقاومت در گلخانه یا میکروپلات استفاده می‌شود. گزینش فنوتیپی اغلب در معرض اثر متقابل ژنوتیپ و محیط است؛ علاوه­بر­آن گزینش برخی صفات پرهزینه، زمان‌بر، غیرقابل اعتماد و گاهی مستلزم انتظار طولانی برای ظهور صفت است. افزایش کارایی گزینش و تسریع برنامه‌های اصلاحی همواره یکی از موضوعات مهم اصلاح‌نباتات بوده است. در همین راستا هدف از این تحقیق شناسایی نشانگرهای مولکولی مرتبط با ژن‌های مقاومت به ریزوکتونیا جهت تسریع در غربال‌گری مواد اصلاحی چغندرقند می­باشد.

2. روش‌شناسی پژوهش

2-1. مواد گیاهی

مواد گیاهی مورد مطالعه در این تحقیق شامل ژنوتیپ والدین چغندرقند حساس و مقاوم به ریزوکتونیا و دو جمعیت F₂ (F₂-A و F₂-B) حاصل از آنها بود که در سال­های قبل در گلخانه موسسه تحقیقات اصلاح و تهیه بذر چغندرقند تهیه و نمونه برگ از والدین دو جمعیت آنها در فریزر 80- درجه سانتی‌گراد جهت استفاده آتی نگه‌داری شده بود.

2-2. آماده‌سازی مایه تلقیح

جهت تهیه مایه قارچ، ابتدا بذور چغندرقند به مدت 24 ساعت داخل آب خیس­خورده و پس از ریختن داخل ظروف شیشه‌ای، دو بار به فاصله 24 ساعت ضدعفونی شدند. سپس قطعاتی از جدایه‌های مورد نظر (AG 2-2,133) رشدیافته روی محیط کشت PDA (Potato Dextros Agar) با کد 1.10130.0500 و به مدت 21 روز در دمای 25-27 درجه سانتی‌گراد رشد داده شدند. ارلن‌ها به­صورت مرتب و روزانه تکان داده شدند تا دانه‌های چغندرقند به قارچ آلوده شوند (et al., 2004 Mahmoudi).

2-3. ارزیابی گلخانه­ای

از بذور دو جمعیت F₂ (والدین دو جمعیت F2 به­کار­رفته در این تحقیق شامل اوتایپ حساس به ریزوکتونیا (FC-201-33076) و گرده­افشان مقاوم به ریزوکتونیا (8627-S1) بوده است) از هرکدام 250 گلدان (در مجموع 500 گلدان) در گلخانه همراه با بوته‌های شاهد حساس و مقاوم به ریزوکتونیا کشت شد. ابتدا در هر گلدان پنج عدد بذر چغندرقند کاشته شد و تا زمان مایه‌زنی تعداد بوته‌ باقی­مانده در هر گلدان به یک عدد رسید. بعد از رسیدن گیاهان به سن هشت هفتگی در هر گلدان شش عدد دانه چغندرقند آغشته به قارچ R. solani در عمق سه سانتیمتری در نزدیکی ریشه قرار داده شد. جدایه مورد استفاده در این تحقیق از گروه ‌آناستوموزی AG 2-2,133 بود (Mahmoudi et al., 2004). چهار هفته پس از تلقیح، ارزیابی ناشی از فعالیت قارچ به­صورت نمره‌دهی به بوته‌ هر یک از گلدان‌ها با روش مقیاس یک تا نه باتنر و همکاران (Buttner et al., 2004) انجام شد. در این روش نمره یک گیاهان دارای ریشه‌های سالم (فاقد زخم و لکه روی ریشه)، نمره دو حدود یک درصد، نمره سه بین یک تا پنج درصد، نمره چهار بین پنج تا 10 درصد، نمره پنج بین 10 تا 25 درصد، نمره شش بین 25 تا 50 درصد، نمره هفت بین 50 تا 75 درصد، نمره هشت بیش از 75 درصد سطح ریشه دارای زخم و شانکر ناشی از ریزوکتونیا می­باشند. در نمره نه گیاه از بین رفته و ریشه کاملاً پوسیده می­باشد. برای نمونه­برداری اولیه گیاهی، ابتدا 10 بوته حساس و 10 بوته مقاوم با توجه به نمره بیماری انتخاب و استخراج DNA از برگ‌های مربوط صورت گرفت (جدول 1).

2-4. استخراج DNA

استخراج DNA ژنومی، از100-50 گرم بافت برگ‌های فریزشده نمونه‌های حساس و مقاوم به بیماری ریزوکتونیا با استفاده از روش دلاپورتای تغییریافتهet al., 1983)  (Modified Dellaporta و یا روش نوروزی (Norouzi, 2003) صورت گرفت. برای ارزیابی کیفیت و کمیت DNA­های استخراج­شده از الکتروفورز ژل یک درصد و دستگاه نانودراپ اسپکتروفوتومتر استفاده شد. نمونه­هایDNA  پس از تعیین غلظت، به غلظت 100 نانوگرم در میکرولیتر رقیق شدند و نمونه‌هایی که کیفیت استخراج بالایی داشتند مورد استفاده قرار گرفتند.

2-5. واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز (PCR) با استفاده از نشانگرهای SSRچغندرقند

تکثیر DNA ژنومی و واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز با دستگاه ترموسایکلر BIO RAD انجام شد. برای ایجاد بهترین شرایط PCR، توسط آزمون گرادیان، غلظت‌های مناسب نمک، آغازگر و DNA تعیین شد. حجم کلی هر واکنش PCR، 14 میکرولیتر بود که شامل شش میکرولیتر مخلوط آماده (مسترمیکس) PCR (امپلیکون، دانمارک)، پنج میکرولیتر آب مقطر ضدعفونی‌شده، یک میکرولیتر از هر یک از نشانگرهای  SSRو یک میکرولیتر از DNA ژنومی بود (اسامی 25 جفت آغازگر و توالی آنها در جدول 2 آورده شده است).

برنامه PCR شامل واسرشت‌کردن ابتدایی در 95 درجه سانتی‌گراد برای پنج دقیقه، به دنبال آن40 چرخه تکثیری شامل مرحله واسرشت‌کردن 94 درجه سانتی‌گراد در 30 ثانیه، اتصال آغازگر در 50 تا 62 درجه سانتی‌گراد برای 30 ثانیه و تکثیر DNA در 72 درجه سانتی‌گراد برای 30 ثانیه و بعد از آن تکثیر نهایی در 72 درجه سانتی‌گراد برای 10 دقیقه انجام شد (لازم به ذکر است که دمای مرحله اتصال آغازگر برای هر نشانگر با توجه به توالی آن در نظر گرفته شد).

برای مشاهده‌ چندشکلی حاصل از نشانگرهای SSR در هر جایگاه ژنی و تفاوت نوارها در جدایه‌ها، هفت میکرولیتر از محصول PCR روی ژل آگارز دو تا 5/2 درصد (حاوی سه میکرولیتر رنگ Safe Stain در 100 میلی‌لیتر بافر TBE) به مدت سه ساعت در ولتاژ 100 برده شد. تصویر ژل با اشعه UV و توسط دستگاه ژل­داک
 (Gel Logic QUANTUM ST4, Germany) عکس­برداری شد. برای تعیین اندازه قطعات از نشانگر با نوارهای استاندارد
 bp 3000-100 (شرکت سیناکلون، cat.NO.SL7041) استفاده شد.

6-2. تجزیه آماری

محصولات تکثیر شده حاصل از نشانگرهای ریزماهواره، براساس وجود نوار (1) و عدم وجود نوار (0) برای هر جفت آغازگر اختصاصی به منظور تشکیل ماتریس دوتایی کدگذاری شد. برای گروه‌بندی ژنوتیپ‌ها بر اساس داده‌های مولکولی از ضریب تشابه جاکارد در مقایسه با دایس و تشابه مقابل ساده و روش  UPGMAدر مقایسه با UPGMC و روش دورترین همسایه استفاده شد. تجزیه خوشه­ای برای گروه­بندی ژنوتیپ‌ها و تجزیه به مولفه‌های اصلی (PCOA) بر اساس ماتریس فاصله با استفاده از
نرم­افزار  NTSYS:pc 2.1انجام شد Rohlf, 2000)).

در این مطالعه نسبت چندشکلی نشانگرها با استفاده از فرمول  و شاخص محتوای اطلاعات چندشکلیPIC  با استفاده از فرمول PIC= 1 -  محاسبه شد (et al., 2000 Prasad). در این فرمول  و  فراوانی آلل‌های i و j در یک مکان مشخص ریزماهواره می‌باشد. با­توجه­به ضریب همبستگی کوفنتیک در نهایت تجزیه خوشه‌ای به روش UPGMA  انتخاب و انجام شد. سپس پراکنش ژنوتیپ‌ها با استفاده از نمودار دو­بعدی و سه­بعدی حاصل از پنج مولفه اصلی اول برای تایید یا عدم تایید گروه‌بندی حاصل از تجزیه خوشه­ای بررسی شد. همچنین جهت تفکیک و گروه‌بندی جمعیت، مکان خط‌برش با استفاده از روش جذرگیری و میانگین ماتریس تشابه جاکارد روی محور فاصله مشخص شد.

جدول 1. مشخصات بوته‌های حساس و مقاوم چغندرقند مورد مطالعه.

Table 1. Characteristics of the susceptible and resistant sugar beet plants under study.

3. یافته‌های پژوهش و بحث

با استفاده از نرم­افزار primer3 و oligo analyzer و با استفاده از سایت NCBI تعداد 3200 نشانگر SSR طراحی و شناسایی شد. با استفاده از genome data viewer در سایت NCBI جهت تثبیت و اطمینان از حضور توالی‌های شناسایی­شده در نه کروموزوم چغندرقند، 62 جفت آغازگر SSR تایید و سفارش داده شدند. با بررسی­های اولیه این آغازگرها روی نمونه­های والد حساس و مقاوم به ریزوکتونیا، از قبل تعدادی آغازگر SSR معرفی شده بود (Norouzi et al., 2024) که از آنها برای آزمون در تک­بوته‌های جمعیت‌ها استفاده شد (جدول 2).

تنوع ژنتیکی بوته‌های مورد مطالعه (جدول 1) با استفاده از 25 آغازگر SSR (جدول 2) مورد بررسی قرار گرفت. پنج آغازگر نتوانستند نوار واضحی ایجاد کنند و حذف شدند. شش جفت آغازگر,SSR9, SSR10, SSR20, SSR23 ,SSR32 SSR45 و SSR50 نوارهای چندشکل را در بوته‌های مورد بررسی نشان دادند (شکل 1 و 2). درکل آغازگرهای SSR توانستند 31 نوار تولید کنند که از این تعداد پنج نوار تک‌شکل و بقیه نوارها چندشکل بودند. میانگین تعداد نوار برای هر آغازگر در 20 بوته برابر 3/1 بود. همچنین نشانگرهای SSR، 355 مکان را تکثیر کردند که میانگین مکان تکثیر شده برای 20 آغازگر 75/17 بود. آغازگرهای 9 و 45 با سه نوار و آغازگر 23 با چهار نوار بیشترین چندشکلی را نشان دادند. بیشترین مکان تکثیر شده مربوط به بوته‌های مقاوم به ریزوکتونیا بود. 

جدول 2. فهرست و مشخصات جفت 25 آغازگر SSR.

Table 2. List and characteristics of 25 SSR primer pairs.

شکل 1. الگوی نواری آغازگر SSR23 در20 نمونه چغندرقند (1-10 حساس و 11-20 مقاوم به پوسیدگی ریشه)

 روی ژل آگارز 5/2 درصد، M: نشانگر وزن مولکولی 3kbp.

Figure 1. Banding pattern of the SSR23 primer in 20 sugar beet samples (1–10 susceptible and 11–20 resistant to root rot) on a 2.5% agarose gel. M: 3 kbp molecular weight marker.

شکل 2. الگوی نواری آغازگر  SSR50در20 نمونه چغندرقند (1-10 حساس و 11-20 مقاوم به پوسیدگی ریشه )
روی ژل آگارز 5/2 درصد. M: نشانگر وزن مولکولی 3kbp.

Figure 2. Banding pattern of the SSR50 primer in 20 sugar beet samples (1–10 susceptible and 11–20 resistant to root rot) on a 2.5% agarose gel. M: 3 kbp molecular weight marker.

آماره ژنتیکی محتوای اطلاعات چندشکلی (PIC) معیاری معمول برای نشان­دادن کارایی یک مکان ژنی یا سیستم نشانگر است. میانگین این آماره در کل بوته‌های مورد بررسی 66/0 بود. بیشترین میزان محتوای اطلاعات چندشکلی (PIC) مربوط به مکان ژنی SSR2 وSSR9  به مقدار 75/0 و کمترین آن به غیر از مکان‌های ژنی که نوارهای تک‌شکل داشتند (مقدار 0) مربوط به SSR45 به مقدار 54/0 بود. دامنه تغییر محتوای اطلاعات چندشکلی 54/0 تا 75/0 با میانگین PIC برای کل جفت آغازگرها 66/ به­دست آمد (جدول 3). عسکری­نژاد و همکاران (Askarinejad et al., 2016) شناسایی هفت نشانگر SSR با 58 آلل و دامنه چهار تا 11 آلل با متوسط هفت نوار چندشکل به ازای هر جفت آغازگر و میانگین چندشکلی 76/0 برای کل آغازگرها را بیان داشتند. در هر مکان ژنی هرچند محتوای اطلاعات چندشکلی به عنوان یکی از ویژگی‌های مهم نشانگرهای مولکولی در نظر گرفته می‌شود و می‌تواند برای ارزیابی تمایز نشانگرها از هم به­کار رود (Junjian et al., 2002)، اما در مورد بررسی و ارتباط با بیماری ریزوکتونیا در چغندرقند بعضی از آغازگرها مانند SSR 4 که تک­نوار بود توانست با تشکیل نوار فقط در بوته‌های حساس (15 درصد) برای ادامه کارهای مولکولی مورد توجه باشد. آغازگرهای 23 و 50 با 25 درصد تشکیل نوار فقط در بوته‌های حساس و آغازگرهای 10 و 32 به­ترتیب با 40 درصد و 20 درصد تشکیل نوار فقط در بوته‌های مقاوم نسبت به بقیه آغازگرها، درصد تشخیص و جداسازی مناسبی داشتند (جدول 4).

دامنه ضریب تشابه به­دست­آمده از نشانگر  SSRدر این تحقیق از 35/0 تا 9/0 متغیر بود ( شکل 3). در کارهای اصلاحی ارقامی که کمترین تشابه را با هم دارند، بهترین بوته‌ها برای کارهای اصلاحی در دورگ‌گیری هستند و برعکس ارقامی که بیشترین تشابه ژنتیکی را با هم دارند برای برنامه­های اصلاحی چندان مناسب نیستند.

3-1. گروه‌بندی بوته‌های حساس و مقاوم براساس مشاهدات مولکولی

با­توجه­به اینکه در مقایسه ضرایب همبستگی، مقدار ضریب همبستگی مربوط به روش جاکارد از دیگر روش­ها بالاتر به­دست آمد و همچنین انطباق بالاتری بین تفکیک بوته‌ها و اطلاعات موجود وجود داشت، گروه‌بندی بوته‌ها براساس فواصل ژنتیکی و تجزیه خوشه‌ای با استفاده از ضریب تشابه جاکارد و الگوریتمUPGMA  انجام گرفت. ضریب همبستگی کوفنتیک براساس ضریب تشابه جاکارد 76/0، دایس 69/0 و ساده 73/0مشاهده شد و با توجه به آزمون مانتل در سطح یک درصد معنی­دار به­دست آمد.

بر ‌اساس خط‌برش، نمودار خوشه‌ای در فاصله 55/0 به 10 زیرگروه مجزا تقسیم شد. قابل ذکر است اگر این گروه‌بندی در فاصله 46/0 صورت گیرد شش زیرگروه ایجاد خواهد شد.

جدول 3. تعداد نوارها و میزان اطلاعات چندشکلی (PIC) جفت آغازگرهای SSR.

Table 3. Number of bands and polymorphism information content (PIC) of SSR primer pairs.

جدول 4. آغازگرهای موثر جهت ادامه کارهای اصلاحی براساس درصد تشکیل نوار در گروه حساس و مقاوم به پوسیدگی ریشه ریزوکتونیایی چغندرقند.

Table 4. Effective primers for further breeding programs based on the percentage of band formation in sugar beet groups susceptible and resistant to rhizoctonia root rot.

شکل 3. نمودار درختی حاصل از پلی­مورفیسم 20 بوته چغندرقند مقاوم (R) و حساس (S) به پوسیدگی ریشه ریزوکتونیایی با جفت اغازگرهای SSR.

Figure 3. Dendrogram of polymorphism of 20 sugar beet plants resistant (R) and susceptible (S) to rhizoctonia root rot with SSR primer pairs.

نتایج حاصل نشان داد که S1,S2,S3,S5 در یک گروه قرار گرفتند که در مجموع 20 درصد بوته‌ها می‌باشند. در گروه دوم S7 و S8، گروه سوم R4,R2,R3,R6 وگروه چهارم R7 وR8 قرار گرفتند. بقیه بوته‌ها در این فاصله از بقیه مجزا شده و به­صورت تکی قرار گرفتند. به­عبارت دیگر از نظر نشانگرهای به­کاررفته تنوع مشاهده­شده میان بوته‌های حساس و مقاوم به نسبت مساوی و حدود 60 درصد قابل مشاهده بود. ضریب تشابه نشان داد که بوته مقاوم R10 و بوته حساس  S4از نظر ژنتیکی فاصله زیادی با هم دارند.

به منظور تعیین نحوه پراکنش نشانگرهای SSR در چغندرقند، آزمون تجزیه به مؤلفه­های اصلی انجام شد. نتایج تجزیه به مولفه‌های اصلی نشان داد که پنج مولفه اول حدود 59 درصد از تنوع کل بین لاین‌ها را تبیین کردند (جدول 5). مؤلفه اول 46/18 درصد، مؤلفه دوم 22/13 درصد و مؤلفه سوم 55/10 درصد، مؤلفه چهارم 50/8 و مؤلفه پنجم 62/7 از تغییرات کل را تبیین کردند. با این درصدها توزیع نسبتاً مناسب نشانگر SSR مورد استفاده در سطح ژنوم مشاهده می‌شود، پراکنش ژنوتیپ‌ها در یک نمودار سه­بعدی براساس پنج مؤلفه اصلی اول، تقریبا همانند گروه‌بندی حاصل از تجزیه خوشه‌ای توانست بوته‌ها را تفکیک کند (شکل 5)، اما با گروه­بندی دو بعدی تعدادی از بوته‌های حساس و مقاوم در یک گروه قرار گرفتند (شکل 4).

جدول 5. مشخصات پنج مؤلفه اول بر اساس مشاهداتSSR .

Table 5. Characteristics of the first five components based on SSR observations.

شکل 4. گروه‌بندی دو بعدی بوته‌های مقاوم (R) و حساس(S) به پوسیدگی ریشه ریزوکتونیایی چغندرقند به­وسیله پنج مؤلفه اول حاصل از مشاهدات نشانگر SSR.

Figure 4. Two dimensional grouping of resistant (R) and susceptible (S) plants to rhizoctonia root rot of sugar beet by the first five components obtained from SSR marker observations.

شکل 5. گروه‌بندی سه­بعدی بوته‌های مقاوم (R) و حساس (S) به پوسیدگی ریشه ریزوکتونیایی چغندرقند به­وسیله پنج مؤلفه اولحاصل از مشاهدات نشانگر SSR.

Figure 5. Three dimensional grouping of resistant (R) and susceptible (S) plants to rhizoctonia root rot of sugar beet by the first five components obtained from SSR marker observations.

شایان ذکر است که کم­بودن درصد تبیین تغییرات مولکولی در تجزیه‌های چندمتغیره مانند تجزیه به مؤلفه‌های اصلی می‌تواند ناشی از توزیع مناسب نشانگرهای مولکولی در سراسر ژنوم و در نتیجه عدم کفایت سه مؤلفه اول برای توجیه حداکثر تغییرات مولکولی باشد. به همین خاطر از پنج مؤلفه اول برای رسم نمودار و گروه‌بندی بوته‌ها استفاده شد. از طرفی توزیع مناسب نشانگرها در سراسر ژنوم به مفهوم ارزیابی دقیق‌تر و بهتر مولکولی به دلیل نمونه‌برداری مناسب از کل ژنوم است
 .(Fazli & HaghMyrza, 2012)

در اکثر مطالعات بررسی تنوع ژنتیکی به­وسیله نشانگرهای مولکولی، گروه‌بندی ژنوتیپ‌ها نیز صورت می­گیرد. هدف اصلی در اینجا انتخاب آغازگرهای مناسب برای ادامه کارهای اصلاحی در تفکیک ارقام مقاوم و حساس به بیماری ریزوکتونیا می­باشد. در این راستا بوته‌هایی انتخاب شدند که حداکثر فاصله ژنتیکی از هم داشته باشند و آغازگری معرفی شود که بتواند در ادامه کارهای اصلاحی چغندرقند تفکیک مناسبی بین ارقام حساس و مقاوم ایجاد کند و همچنین در مطالعات بررسی تنوع ژنتیکی بتواند گروه‌بندی مناسبی بین ارقام و بوته‌ها نشان دهد. از تجزیه خوشه‌ای و تجزیه به مؤلفه‌های اصلی برای گروه‌بندی ژنوتیپ‌های چغندرقند بر اساس مشاهدات نشانگرهای مختلفی از جملهISSR ،RAPD  در چند مطالعه استفاده شده است (Qiaohong et al., 2012; Srivastara et al., 2007; Sen &Alikamanoglu, 2012). در مطالعه‌ای برای مکان­یابی ژن‌های مقاومت به پوسیدگی ریشه ریزوکتونیایی نشان داده شد که سه QTL روی کروموزوم‌های 4، 5 و 7 مجموعا 71 درصد تنوع فنوتیپی این صفت را پوشش می­دهند (Lein et al., 2008).

چغندرقند گیاهی زراعی است که مناطق کشت آن تا حد زیادی قابل انعطاف است با این وجود کشت آن در عرض‌های جغرافیایی جنوبی مناطق معتدله توسط عوامل بیماری‌زا تهدید می­شود (Norouzi et al., 2017). پوسیدگی ریزوکتونیایی ریشه چغندرقند که توسط قارچ R. solani ایجاد می­شود هم­چنان به­صورت یک مشکل در بسیاری از مناطق کشت چغندرقند در ایران و در سرتاسر جهان وجود دارد. ریشه چغندرقند دارای پوسیدگی ریزوکتونیایی فراوان، در صورت عدم حذف پیش از انبارکردن،
می­تواند به 50 درصد کاهش در عملکرد (Herr, 1996)، فساد در توده ریشه­های انباشته­شده و کاهش خلوص شربت منجر شود. پوسیدگی ریزوکتونیایی را می­توان تا حدی از طریق روش­های زراعی، تناوب زراعی و اقدامات شیمیایی کنترل نمود
 (Stump et al., 2004). با این حال، تنها با بکارگیری استراتژی­های فوق نمی­توان به کنترل کامل دست یافت؛ بنابراین،
دست­یابی به ارقام مقاوم یک امر مهم برای مدیریت مؤثر پوسیدگی ریزوکتونیایی می­باشد (Norouzi et al., 2017).

نشانگر ریزماهواره می­تواند به عنوان یک روش مؤثر و مقرون­به­صرفه پتانسیل برای کاوش تنوع ژنتیکی مولکولی در چغندرقند برای دست­یابی به ترکیبات جدید ژنتیکی استفاده شود (Srivastava et al., 2017). ریزماهواره‌ها یکی از کارآمدترین نشانگرهای مولکولی از نظر توزیع مناسب در ژنوم، سهولت استفاده، و هم‌بارز بودن و طبیعت چنداللی می‌باشند
 (Srivastava et al., 2017; Bogachiva et al., 2019). نشانگرهای DNA، مانند نشانگرهای ریزماهواره (SSR)، به­طور گسترده‌ای برای ارزیابی تنوع ژنوتیپی مواد اصلاحی استفاده می­شوند. تجزیه و تحلیل SSR به یک اصلاحگر اجازه می­دهد تا چندشکلی تکرارهای DNA پشت سرهم را آشکار کند (Khemleben et al., 2003; Bogachiva et al., 2019). نشانگرهای SSR و SNP توارث هم­بارز دارند و برای برآورد ساختار و روابط خویشاوندی افراد قابلیت بهتری دارند. علاوه­بر­آن نشانگرهای SSR عموماً از لحاظ گزینشی خنثی هستند Ataee et al., 2017)).

با­توجه­به آنکه روش­های ارزیابی کلاسیک و گزینش برای مقاومت به بیماری از نوع فنوتیپی بوده و به شرایط محیطی و یکنواختی عامل آلوده­کننده وابسته هستند و در فصل خاصی از سال انجام می­گیرند و نیز بعضی گیاهان از عامل آلوده­کننده به نحوی می‌گریزند و به ظاهر مقاوم تلقی می‌شوند، از­این­رو با استفاده از روش‌های مولکولی، به عنوان روش تکمیلی و یا جایگزین می‌توان گیاهان دربردارنده ژن مقاومت را در سطح ژنوتیپی شناسایی نمود، بنابراین نشانگرهای مولکولی DNA می­توانند ابزاری مفید برای انتخاب ژنوتیپ‌های مقاوم باشند و باعث صرفه‌جویی در زمان ارزیابی و افزایش دقت انتخاب گردند
 (Norouzi et al., 1390). 

در این مطالعه نشانگرهای SSR توانستند 31 آلل با دامنه 1 تا 4 آلل در هر مکان ژنی را شناسایی کنند که متوسط تعداد نوار چندشکل به ازای هر جفت آغازگر 3/0 نوار بود. در این تحقیق محتوای اطلاعات چندشکلی  (PIC)برای هر جفت آغازگر SSR نیز محاسبه شد. بیشترین PIC مربوط به جفت آغازگرهای  SSR2و SSR9 با 75/0 وکمترینPIC  مربوط به جفت آغازگر SSR45 با مقدار 54/0 بود. میانگین PIC برای کل جفت آغازگرها حدود 66/0 به­دست آمد. عباسی و همکاران (Abbasi et al., 2014) در مطالعه خود روی تنوع ژنتیکی 168 ژنوتیپ چغندرقند با استفاده از 18 نشانگرSSR  گزارش کردند که دامنه تعداد آلل به ازای هر جفت آغازگر 1040 و متوسط آن 5/7 آلل بود. همچنین دامنه PIC از 36/0 تا 83/0 متغیر و میانگین 64/0 بود. در بررسی دیگری از تنوع ژنتیکی 129 ژنوتیپ چغندرقند با 33 نشانگر SSR، متوسط تعداد آلل به ازای هر جفت آغازگر 05/3 آلل و دامنه PIC از130/0 تا 602/0 متغیر و میانگین 462/0 بود (Peng et al., 2024). هر چه عدد متوسط تعداد قطعه چندشکل و محتوای اطلاعات چندشکلی به ازای هر جفت آغازگر بیشتر باشد کارایی آن نشانگر در گیاه مورد مطالعه بالاتر است و نمایانگر قدرت تمایز بیشتر نشانگر می‌باشد. زیاد نبودن تعداد آلل­های مشاهده­شده در هر مکان ژنی در این مطالعه می­تواند بیانگر فاصله زیاد تنوع بیماری بین بوته‌های مورد استفاده شده باشد؛ چرا که از بوته‌هایی که درصد بالای پوسیدگی را نشان دادند و با نمرات 8 و 9 مشخص شدند و آنهایی که نمرات 1 و 2 و بدون علایم بودند استفاده شد. برای اعتبارسنجی نشانگرها باید از محدوده بوته‌هایی که حد‌وسط مقاومت هم هستند استفاده شود تا تنوع آللی بیشتر مشاهده گردد؛ اما میانگین PIC بالا (66/0) در این مطالعه، بیانگر قدرت تمایز مناسب نشانگرهای SSR استفاده­شده در این مطالعه است. با­توجه­به اینکه جفت آغازگرهای SSR2 و SSR9 دارای بیشترین محتوای اطلاعات چندشکلی (75/0) بودند، بنابراین می‌توان آنها را به عنوان جفت آغازگرهای مفید و کارآمد برای بررسی تنوع ژنتیکی ژنوتیپ‌های چغندرقند مقاوم و حساس به پوسیدگی ریشه معرفی و جهت اعتبارسنجی (Validation) نمونه‌های بیشتر انتخاب و برای شروع کارهای اصلاحی پیشنهاد شود. همچنین از نظر درصد تشخیص با توجه به نوارهای ایجادشده در بوته‌های حساس و مقاوم، SSRهای 4،10،23،32 و 50 جهت اعتبار سنجی در ژنوتیپ­های بیشتر برای ادامه این تحقیق معرفی می­شوند. از طرفی بر اساس آزمون تجزیه به مؤلفه‌های اصلی پنج مولفه اول 66/58 درصد از کل تغییرات را بین 20 بوته چغندرقند توجیه نمودند. هر چند گروه‌بندی مناسبی بین بوته‌ها صورت گرفت؛ ولی با­توجه­به نتایج به­دست­آمده از دندروگرام دو بعدی بوته‌ها، می‌توان استنباط کرد که تنوع ژنتیکی ایجادشده می‌تواند رابطه مستقیمی با مقاوم یا حساس­بودن بوته‌ها نداشته باشد. در واقع با­توجه­به بررسی‌های انجام­شده در خصوص وجود تنوع ژنتیکی بوته‌های مختلف چغندرقند با نشانگر SSR  مشخص شد بعضی از بوته‌ها با وجود داشتن مقاومت یا حساسیت به بیماری پوسیدگی ریشه با فاصله از هم‌گروه خود در یک گروه تک قرار گرفته و همبستگی قابل توجهی را نشان ندادند و در چند حالت بوته حساس و مقاوم در یک گروه قرار گرفتند. می­توان استنباط کرد که مقاوم یا حساس­بودن گیاه چغندرقند می‌تواند تحت تأثیر یک و یا چند ژن خاص باشد که لزوماً وجود یا عدم وجود این ژن‌ها باعث تشابه ژنتیکی و یا عدم تشابه ژنوتیپ‌ها با یکدیگر نمی‌شود.

4. نتیجه­ گیری

نتایج به ­دست ­آمده از این تحقیق نشان داد که نشانگرهای  SSRبه­خوبی در سطح ژنوم پراکنده شده‌اند و کارایی مناسبی در ارزیابی تنوع ژنتیکی ژنوتیپ‌های چغندرقند مقاوم و حساس به پوسیدگی ریشه ریزوکتونیایی دارند. برای تایید و اعتبارسنجی نشانگرها، تعداد بیشتری از نمونه‌های حساس و مقاوم با SSRهای انتخاب­شده آزمایش و در نهایت برترین نشانگر(ها) معرفی خواهند شد.

5. سپاسگزاری

بدین‌وسیله از حمایت‌های مالی معاونت پژوهشی موسسه تحقیقات اصلاح و تهیه بذر چغندرقند در تامین امکانات جهت انجام این پژوهش کمال تشکر را دارد.

5. منابع

Abawi, G.S., Crosier, D.C., Cobb, A.C., & Becker, R.F. (1986). Root rot of table beets in New York State. New York’s Food and Life Sciences Bulletin, 115.

Abbasi, Z., Arzani, A., Majidi, M.M., Sadeghian, S.Y., Rajabi, A., Hooshmand, S., Talebi, M., & Mirmohammadi Meibodi, S.M. (2014). Genetic study of salt tolerance and assessment of genetic variation using molecular markers in sugar beet (Beta vulgaris L.). PhD Thesis. Isfahan University of Technology, 165pp. (In Persian).

Askarinejad, P., Vatandoost, J., & Nasr, M .(2016). Assessment of genetic diversity among resistant and susceptible sugar beet genotypes to cyst nematod using SSR molecular markers. Cellular and Molecular Research (Iranian Journal of Biology), 3(29), 302-311. (In Persian).

Ataei, R., Mohammadi, V., Talei, A.R., & Naghavi, M.R. (2016). Association mapping of yield and some important agronomic traits in barley (Hordeum vulgare L.). Modern Genetics Journal, 11(3), 411-423. (In Persian).

Bogachiva, N.N., Fedulova, T.P., & Nalbandyana, A.A. (2019). Innovation methods in molecular breeding of sugar beet (Beta vulgaris L.). Russian Agricultural Sciences, 45(3), 247-250.

Buttner, G., Pfahler, B., & Marlander, B. (2004). Greenhouse and field techniques for testing sugar beet for resistance to rhizoctonia root and crown rot. Plant Breed. Z. Für Pflanzenzucht, 123, 158–166.

Fazli, P., & HaghMyrza, K.(20 11). Study of genetic diversity in native chickpea mass with markers ISSR. Modern Genetics, 6, 104-97.

Gaskill, J.O. (1968). Breeding for rhizoctonia resistance in sugarbeet. Journal of the American Society of Sugar Beet Technologists, 15, 107-119.

Haq, S., Jain, R., Sharma, M., Kachhwaha, S., & Kothari, S.L. (2014) .Identification and characterization of microsatellites in expressed sequence tags and their cross transferability in different plants. International Journal of Genomics, 1–12.

Haque, M., & Parvin, M. (2021). Sugar beet, it disease Rhizoctonia root rot, and potential biological agents. Agricultural and Biological Research; 37(1), 96–101.

Harveson, R.M., Stack, J.P., Watkins, J.E., Giesler, L.J., & Chacky, J.L. (2003). Sugar beet disease profiles I. Univ. of Nebr. Coop. Ext. Circ; EC03-1885-S.

Hassani, M., Heidari, B., Stevanato, P., Campagna, G., Broccanello, C., Norouzi, P., Concheri, G., & Panella, L. (2018). A candidate single nucleotide polymorphism (SNP) marker linked to resistance to infection with rhizoctonia in sugar beet.76th IIRB Congress, 5-7 June. Normandy, France.

Hecker, R.J., & Ruppel, E.G.(1977). Rhizoctonia root-rot resistance in sugar beet: Breeding and related research. Journal of the American Society of Sugar Beet Technologists, 19, 246–256.

Herr, L.J. (1996). Sugar beet diseases incited by Rhizoctonia spp. In rhizoctonia species: Taxonomy, molecular biology, ecology, pathology and disease control, eds. Sneh, B., Jabaji-Hare, S., Neate, S., and Dijst, G. 341-349. (Netherlands: Kluwer Academic Publishers).

Holmquist, L., Dِlfors, F., Fogelqvist, J., Cohn, J., Kraft, T., & Dixelius, C. (2021). Major latex protein-like encoding genes contribute to Rhizoctonia solani defense responses in sugar beet. Molecular Genetics Genomics, 296, 155–164.

Junjian, Ni., Colowit, P.M., & Mackill, D.J. (2002). Evaluation of genetic diversity in rice subspecies using microsatellite markers. Plant Genetic Resource, 42(2), 601-607.

Khemleben, V., Beridze, T.G., Bakhman, L., Kovarik, Y., & Torres, R. (2003). Satellite DNAs, Usp. Biol. Khim, 43, 267–306.

Lein, J., Sagstetter, C., Scheuermann, D., Thurau, T., Varrelmann, M., Saal, B., Koch, G., Borchardt, D., & Jung, C. (2008). Mapping of rhizoctonia root rot resistance genes in sugar beet using pathogen response-related sequences as molecular markers. Plant Breeding, 127, 602–611.

Li, Y., Chen, L., Lin, F., & Hassain, K. (2010). Identification of SSR markers linked to resistance against the spotted stem borer in sorghum. Middle-East Journal of Scientific Search, 6(5), 505-521.

Mahmoudi, S.B., Mesbah, M., & Alizadeh, A. (2004). Pathogenic variability of sugar beet isolates of Rhizoctonia solani. Iranian Journal of Plant Pathology, 40(3-4), 253-280. (In Persian).

Mir Mohammadi Maibody, S.A.M., & Golkar, P. (2019). Application of DNA molecular markers in plant breeding. Plant Genetic Researches, 6, 1. (In Persian).

Misra, V., Mall, A.K., & Singh, D. (2023). Rhizoctonia root-rot diseases in sugar beet: Pathogen diversity, pathogenesis and cutting-edge advancements in management research. Journal of the Microbe, 1, 100011.

Mordue, J.E., Curran, R.S., & Bridge, P.D. (1989). An integrated approach to Rhizoctonia taxonomy: Cultural, biochemical and numerical techniques. Mycological Research, 92, 78-910.

Naghavi, M.R., Ghareyazi, B., & Hosseyni Salekdeh, G. (2005). Molecular markers. Publication of Tehran University, 23(2), 21-40. (In Persian(.

Nazari, A. (2018). Identification of molecular markers connected with genes controlling resistance to Rhizoctonia in sugar beet. Master's thesis. Department of Agricultural Sciences and Plant Breeding. Aburihan Campus. University of Tehran. (In Persian .(

Norouzi, P. (2003). The simple and effective method for genomic DNA extraction from plant and fungus for PCR-based analyses. Journal of Sugar Beet, 19(2), 175-177. (In Persian.(

Norouzi, P., Mahmoudi, S.B., Aghaizadeh, M., Kakoinejad, M., Orazhizadeh, M.R., Vahedi, S., & Fathi, M.R. (2018). Reproducibility of some molecular markers linked to rhizomania resistance gene (Rz1) in sugar beet genotypes. Journal of Crop Breeding, 8, 30-42. (In Persian(.

Norouzi, P., Rajabi, A., Azizi, H., & Stevanato, P. (2024). Molecular breeding as the foundation for inducing resistance to biotic stresses in sugar beet. Euphytica, 220(125), 1-12.

Norouzi, P., Stevanato, P., Mahmoudi, S.B., Fasahat, P., & Biancardi, E. (2017). Molecular progress in sugar beet breeding for resistance to biotic stresses in sub-arid conditions-current status and perspectives. Journal of Crop Science and Biotechnology, 2, 99-105.

Panella, L. (1998). Screening and utilizing Beta genetic resources with resistance to Rhizoctonia root rot and Cercospora leaf spot in a sugar beet breeding program. International Crop Network Series, 12. International Plant Genetic Resources Institute, Rome, 62–72.

Peng, F., Zhi, Pi., Shengnan, Li., & Zedong, Wu. (2024). Genetic diversity and population structure analysis of excellent sugar beet (Beta vulgaris L.) germplasm resources. Horticulturae, 10(2), 120.

Pethybridge, S.J., Kikkert, J.R., Hanson, L.E., & Nelson, S.C. (2018). Challenges and prospects for building resilient disease management strategies and tactics for the New York table beet industry. Agronomy, 8(7), 112.

Prasad, M., Varshney, R.K., Roy, J.K., Balyan, H.S., & Gupta, P.K. (2000). The use of microsatellites for detecting DNA polymorphism, genotype identification and genetic diversity in wheat. Theoretical and Applied Genetics, 100(3-4), 584-592.

Qiaohong, L., Dayou, C., Lin, Y., Chengfei, L., Fanjiang, K., & Yumei, W. (2012). Construction of digital fingerprinting and cluster analysis using ISSR markers for sugar beet cultivars. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering; 28, 280-284.

Rajabi, A., & Aghaeizadeh, M. (2013). Report of participating in the training course of beet sugar beet in KWS Germany, June and July. (In Persian.(

Ravi, S., Hassani, M., Heidari, B., Deb, S., Orsini, E., Li, J., Richards, C., Panella, L., Srinivasan, S., Campagna, G., Concheri, G., Squartini, A., & Stevanato, P. (2022). Development of an SNP assay for marker-assisted selection of soil-borne Rhizoctonia solani AG-2-2-IIIB resistance in sugar beet. Biology, 11(49), 1-17.

Rohlf, F.J. (2000). NTSYS-pc: Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System, Version 2.1. Exeter Software, Setauket, New York. 2000.

Schneider, C.L., Ruppel, E.G., Hecker, R.J., & Hogaboam, G.J. (1982). Effect of soil deposition in crowns on development of Rhizoctonia root rot in sugar beet. Plant Disease, 66, 408-410.

Sen, A., & Alikamanoglu, S. (2012). Analysis of drought-tolerant sugar beet (Beta vulgaris L) mutants induced with gamma radiation using SDS-PAGE and ISSR markers. Mutation Research, 738, 38–44.

Sharma, M.D., Dobhal, U., Singh, P., Kumar, S., Gaur, A.K., Singh, S.P., Jeena, A.S., Koshy, E.P., & Kumar, S. (2014). Assessment of genetic diversity among sugarcane cultivars using novel microsatellite markers. African Journal of Biotechnoly, 13, 1444–1451.

Soltani Nezhad, S., Mahmoodi, S.B., & Farrokhi Nezhad, R. (2008). Characterization of sugar beet Rhizoctonia isolates in Iran. Journal of Sugar Beet, 23(2), 135-150. (In Persian(.

Srivastava, S., Gupta, P.S., Saxena, V.K., & Srivastava, H.M. (2007). Genetic diversity analysis in sugarbeet (Beta vulgaris L.) using isozymes, RAPD and ISSR markers. Cytologia, 72, 265–274.

Srivastava, S., Pathak, A.D., Kumar, R., & Joshi, B.B. (2017). Genetic diversity of sugar beet genotypes evaluated by microsatellite DNA markers. Journal of Environmental Biology, 38(5), 777-783.

Stump, W.L., Franc, G.D., Harveson, R.M., & Wilson, R.G. (2004). Strobilurin fungicide timing for Rhizoctonia root and crown rot suppression in sugar beet. Journal of Sugar Beet Research, 41, 17-37.

Vilgalys, R., & Cubeta, M.A. (1994). Molecular systematics and population biology of Rhizoctonia. Annual Review of Phytopathology, 32, 135-155.

Windels, C.E., Jacobsen, B.J., & Harveson, R.M. (2009). Rhizoctonia root and crown rot. In RM Harveson, LE Hanson, GL Hein (Eds.), ompendium of beet diseases and pests. American Phytopathological Society, 33–36.

Wounde, K.V.D. (2015). Rhizoctonia root rot. Technical Leaflet. SESVanderhave. 24.