بررسی پاسخ‌های فیزیولوژیکی و مولکولی القایی در لاین‌های حاصل از تلاقی گندم زمستانه و بهاره تحت دوره‌های سرمادهی

. مقدمه

گندم (Triticum aestivum L.) مهمترین محصول زراعی دنیا است که حدود 22 درصد از اراضی قابل کشت دنیا را به خود اختصاص داده و نقش اساسی در امنیت غذایی جمعیت بشری دارد. بررسی مصرف سرانه در ایران نشان می­دهد که حدود 25 درصد مواد غذایی مردم ایران حاوی محصولات مشتق­شده از گندم است (Alipour et al., 2017). پژوهش­ها نشان داده که جمعیت دنیا تا سال 2050 به بیش از هشت میلیارد نفر خواهد رسید؛ به­طوری­که تقاضا برای محصولات کشاورزی از جمله گندم افزایش یافته، لذا همگام با افزایش جمعیت، تولید این محصول هم از طریق توسعه سطح کشت و هم از طریق بهبود عملکرد در واحد سطح، باید افزایش یابد (Ghasemi et al., 2013; Alipour et al., 2017; Cheli et al., 2017; Hosseini et al., 2021). چالش افزایش جمعیت همچنین با تغییرات آب و هوایی کره زمین نیز همراه شده که پتانسیل وقوع نوسانات دمایی شامل سرمای زودرس پاییزه، سرمای شدید زمستان و یا سرمای دیررس بهاره ایجاد می­کند. به­طور تقریبی 66 درصد از اراضی تحت کشت گندم ایران در مناطق معتدل سرد واقع شده؛ به­طوری­که سالانه خسارت­های زیادی بر میزان عملکرد گندم در ایران وارد می­کند (Mahfoozi et al., 2019).

تحت تنش سرما، معمولا گیاهچه­های جوان گندم در معرض خسارت سرما، بادهای شدید، یخ­زدگی اندام هوایی و یخ­زدگی خاک قرار می­گیرند. در سال­های اخیر اگرچه تغییرات آب و هوایی سبب گرم­شدن زمین شده، اما نوسانات دمایی شدیدی در پاییز و زمستان و یا در اوایل بهار ایجاد می­کند که خسارت­های بیشتری را بر سلول­های گیاهی حتی گیاهان زمستان­گذران در پی داشته است (Samsami & Maali-Amiri, 2024)، وضعیتی که چالش مهم در توسعه کشت گیاهان نیز محسوب می­شود. تنش سرما سبب اختلال در مجموعه وسیعی از تغییرات مورفولوژیکی، فیزیولوژیکی، بیوشیمیایی و مولکولی می­شود. در مقابله با تنش سرما، غلات زمستانه از دو راهبرد ویژه پاسخ بهاره­سازی[1] و سازگاری[2] به سرما بهره گرفته؛ به­طوری­که با فعالیت این دو راهبرد، توسعه تحمل به سرما[3] و یخ­زدگی[4] (زیر صفر درجه) انجام می­شود (Hosseini et al., 2016; Hosseini et al., 2021). نیاز بهاره­سازی گندم با تنظیم زمان انتقال از فاز رویشی به فاز زایشی از آسیب غلات بر اثر سرمای زمستان جلوگیری می­کند (Mahfoozi et al., 2001; Waalen et al., 2014). نکته جالب آن است که تحت تنش سرما، اگر گندم انتقال از مرحله رویشی به زایشی را مدیریت کند، ظرفیت سازگاری به سرما نیز در آن افزایش یافته و بدین­ترتیب میزان مطلوب عملکرد نیز قابل انتظار خواهد بود
 (Feng et al., 2016; Shourbalal et al., 2019).

از لحاظ بیولوژیکی، سازگاری به سرما شامل تغییرات متعدد در بیان ژن، متابولیسم، فیزیولوژی و مورفولوژی بوده که این تغییرات شامل افزایش یا کاهش بیان ژن­ها، کاهش یا توقف رشد، تجمع اسید آبسیزیک، تغییر در ترکیب لیپیدهای غشاء، تغییر در ترکیب محلول­های سازگار و افزایش آنتی­اکسیدانت­های سلولی از جمله آنزیمی و غیر آنزیمی است. این تغییرات، به­طور مستقیم در تحمل به تنش درگیر بوده و بنابراین به عنوان عناصر فعال در تحمل به تنش­های محیطی به خصوص تنش سرما محسوب می­شوند (Kazemi Shahandashti & Maali-Amiri, 2018). بنابراین در بسیاری از موارد ارتباط منطقی بین تغییرات در سطح مولکولی با تغییرات فیزیولوژیکی و مورفولوژیکی وجود دارد. تنش سرما اغلب دو اثر مستقیم و غیر مستقیم بر سلول­های گیاهی ایجاد می­کند: تاثیر مستقیم آن اغلب بر ساختارهای غشایی از آن جمله غشای پلاسمایی است که به عنوان اولین سد دفاعی سلول در مقابله با تغییرات محیطی عمل می­کند (Los & Murata, 2004; Heidarvand et al., 2011). تنش سرما سبب تجمع گونه­های اکسیژن فعال (ROS[5]) از جمله پراکسید هیدروژن (H₂O₂) در سلول­ها شده که منجر به القای تنش اکسیداتیو می­شود. ROS باعث اختلال در واکنش­های انتقال الکترون، خسارت به لیپیدهای غشایی، پروتئین­ها، اسیدهای نوکلئیک و دیگر واکنش­های بیوشیمیایی اساسی سلول می­شوند. بنابراین شکل­گیری ROS منجر به آسیب سلولی شده و نهایتا مرگ گیاه را به دنبال خواهد داشت. فرایند عادت­دهی به سرما منجر به القای پاسخ­های دفاعی سلول و پاکسازی ROS از طریق آنزیم­های آنتی­اکسیدانتی از جمله سوپراکسید دیسموتاز (SOD^[6])، کاتالاز (CAT^[7])، گایاکول­پراکسیداز (GPX^[8]) و پلی­فنول­اکسیداز (PPO^[9]) می­شود و متعاقبا آسیب اکسیداتیو القا شده توسط تنش سرما در گیاهان را کاهش می­دهد (Kazemi-Shahandashti et al., 2014; Caverzan et al., 2016). بنابراین بررسی عوامل ایجاد اکسیداسیون سلولی و همچنین پاکسازی آن­ها می­تواند به عنوان نشانگر بیوشیمیایی به­ترتیب در برآورد خسارت و دفاع سلول در اثر تنش سرما مفید باشد. همچنین گیاهان با قرار گرفتن در شرایط تنش سرما مستعد خسارت از دیگر عوامل محیطی زیستی و غیر زیستی نیز هستند (Janská et al., 2010; Shen et al., 2018; Hosseini & Saidi, 2019).

مطالعات نشان داده که تجمع نسبی ROS همچنین در مسیر پیام­رسانی سلولی نیز مشارکت دارد و نکته جالب آن است که این وضعیت هم در اثر مستقیم و هم در اثر غیر مستقیم سرما مشاهده شده است (Gill & Tuteja, 2010; Amini et al., 2021). تحت تنش سرما ویژگی­های فیزیکی و شیمیایی چربی­های غشای پلاسمایی تغییر می­کند و این تغییرات اثر مشابهی در بیان ژنهای موثر در سازگاری به سرما دارد. وضعیت فیزیکی چربی های غشایی به طور مستقیم در تنظیم فعالیت پروتئین­های متصل به غشا از جمله ناقلین مولکولهای کوچک، کانالهای یونی، پروتئین کینازهای گیرنده و پروتئین­های حسگر نقش دارد. به نظر می­رسد سلول، تنش سرما را از طریق پروتئین­های موجود در غشا درک کرده و از طریق آنها پیام­ها را از محیط به شبکه­های انتقال پیام و هسته می­رساند. عادت­دهی به سرما تحت کنترل دقیق ژنتیکی بوده و با به راه­انداختن برنامه­های تنظیمی بسیار پیچیده منجر به تنظیم فاکتورهای رونویسی، تنظیم مجدد بیان ژن­های مرتبط با تنش و سازماندهی­ مجدد گسترده ترانسکریپتوم می­شود
 (Wu et al., 2016; Gao et al., 2020). سهم لیپیدهای غشایی به­خصوص اسیدهای چرب غیر اشباع جهت تحمل به سرما در گیاهان در تحقیقات مورد بحث قرار گرفته است. تحت تنش سرما چربی­هایی که حاوی پیوند دوگانه در اسیدهای چرب هستند، سیالیت غشایی خود را حفظ می­کنند؛ به­طوری­که در شرایط طبیعی با کاهش پی در پی دمای محیط، سیالیت غشا به تدریج کاهش یافته و بدین­ترتیب در هموستازی سلولی و بقا سلول گیاه ایفای نقش می­کنند. نقش اصلی را در این مسیر ژن­های د­ساتوراز[10] ایفا می­کند که پیوندهای دوگانه را به زنجیره لیپیدی اسیدهای چرب اضافه می­کنند (Nishida & Murata, 1996;
Kazemi Shahandashti et al., 2014). این ژن­ها با افزایش میزان غیر اشباعی چربی­ها در ساختار غشا، از غیر فعال­شدن آن جلوگیری می­کند (Maali-Amiri et al., 2010).

برخی برنامه­های به­نژادی گندم برای تحمل به تنش­های محیطی شامل بهبود تحمل به سرما از طریق معرفی صفات دخیل در سازگاری ارقام تجاری می­باشد که ممکن است این صفات از طریق لاین­های نوترکیب[11]  (RILs)شناسایی شوند
 (Sun et al., 2018). در این برنامه به­نژادی به دلیل استفاده از لاین­های مختلف،RIL ها در هر دو جهت ویژگی­های والدی (والد متحمل و حساس به تنش سرما) توسعه یافته، به­طوری­که پاسخ­های فنوتیپی و ژنتیکی به سرما به تدریج از حساس به متحمل تغییر می­کند. بنابراین گندم زمستانه را می­توان با گندم­های بهاره و بینابین[12] در یک شرایط محیطی به­ویژه در مزرعه مقایسه کرد (Hosseini et al., 2023). بررسی شبکه­های تنظیم متابولیک درگیر در بهاره­سازی فرآیند و فرصتی ارزشمند برای شناسایی برخی از مکانیسم­های درگیر در فرآیند تحمل به تنش سرما می­باشد. در مطالعه حاضر رقم گندم بهاره پیشتاز، رقم زمستانه نورستار، لاین­های نوترکیب خالص حاصل از تلاقی آن­ها که دارای نیاز بهاره­سازی و میزان تحمل به سرمای متفاوت بودند، جهت مطالعه ارتباط بین میزان تحمل به سرما، تجمع H₂O₂ و میزان بیان ژن­های کد­کننده آنزیم­های دساتوراز بررسی شد. درک ارتباط بین فرایندهای دخیل در تحمل به سرما، تضمین­کننده پایداری عملکرد گندم و افزایش سطح زیر کشت گندم در مناطق سرد کشور است.

2. روش­شناسی پژوهش

1-2. شرایط کشت و نمونه­برداری

در این پژوهش مواد گیاهی مورد مطالعه شامل هفت ژنوتیپ گندم نان به­ترتیب شامل رقم والد پیشتاز (رقم گندم ایرانی با عادت رشد بدون نیاز بهاره­سازی و حساس به سرما)، رقم والد نورستار (رقم زمستانه کانادایی با نیاز بهاره­سازی طولانی و بسیار متحمل به سرما) و پنج لاین نوترکیب خالص (RIL) (شامل L1 تا L5) نسل هفت حاصل از کراس ساده بین والدین با نیاز بهاره­سازی بسیار متفاوت و متنوع از نظر زمان انتقال از مرحله رویشی به زایشی بود. برنامه اصلاح گندم شامل بهبود تحمل به تنش سرما از طریق معرفی­کردن صفات دخیل در سازگاری به ژرم­پلاسم­های تجاری است. چنین صفاتی ممکن است از طریق RILها شناسایی شوند. همه این ژنوتیپ­ها در شرایط مزرعه در اقلیم معتدل سرد (کرج) به مدت یک سال زراعی در سال 1396-1397به صورت فاکتوریل در قالب بلوک­های کامل تصادفی در سه تکرار ارزیابی شدند. مطابق با داده­های هواشناسی حداقل دما در زمستان در بهمن ماه 12- درجه سانتی­گراد گزارش شد (Hosseini et al., 2021). ژنوتیپ­ها در مزرعه دانشکدگان کشاورزی و منابع طبیعی کرج با مشخصات جغرافیایی 51 درجه طول شرقی و 35 درجه عرض جغرافیایی و با ارتفاع 1321 متر از سطح دریا کشت شدند. هر لاین در هر تکرار به طول سه متر در یک پشته و در سه ردیف به فاصله 20 سانتی­متر از یکدیگر کاشته شدند. میزان بذر مصرفی بر اساس 450 بذر در متر مربع در نظر گرفته شد. در سه مرحله عادت­دهی به سرما ­رتیب آذرماه (60 روز پس از کشت یا ماه دسامبر)، دی­ماه (90 روز پس از کشت یا ماه ژانویه) و بهمن­ماه (120 روز پس از کشت یا ماه فوریه) نمونه­برداری انجام شد. همه این ژنوتیپ­ها همچنین در دمای 20 درجه سانتی­گراد با نور 200 میکرو مول بر متر مربع  بر ثانیه و 16 ساعت روشنایی به عنوان شاهد در شرایط اتاقک رشد کشت شدند و در مرحله چهار برگی از آن­ها نمونه­برداری انجام شد. تمام نمونه­ها در نیتروژن مایع فریز و سپس در یخچال 80- درجه سانتی­گراد نگه­داری شدند.

2-2. ارزیابی درجه تحمل به انجماد (آزمون انجماد)

جهت تعیین قابلیت تحمل به انجماد از روش تعیین دمای 50 درصد کشندگی (LT₅₀[13]) استفاده شد. از هر تکرار و هر رقم، تعداد پنج بوته از مزرعه جمع‌‌آوری، سپس طوقه گیاه (یک سانتی‌متری بالا و زیر محل طوقه) برای آزمون انجماد آماده شد. در روش LT₅₀، طوقه گیاهان در داخل ظروف آلومینیومی حاوی ماسه نرم مرطوب در دمای 3- درجه سانتی­گراد به مدت 12 ساعت در فریزر نگهداری شد. سپس دمای فریزر یک درجه سانتی­گراد هر 30 دقیقه کاهش یافت و این کاهش تا دمای 25- درجه سانتی­گراد ادامه داشت. در موعد هر دمای مشخص، نمونه­های مزبور از فریزر خارج شده و پس از استقرار 12 ساعته در دمای چهار درجه سانتی­گراد جهت ذوب تدریجی بافت یخ­زده، نمونه­ها به شرایط کنترل منتقل شدند و در بستری با بافت سبک کشت شد. پس از سه هفته، بر اساس ارزیابی سیستم ریشه­ای و هوایی زنده و فعال، تعداد بوته­های مرده و زنده ثبت شده و بر این اساس میزان LT₅₀ و تحمل سرما تعیین شد (Mahfoozi et al., 2001).

3-2. سنجش میزان پراکسید هیدروژن (H₂O₂)  

مقدار 350 میلی‏گرم نمونه برگی پس از اضافه­کردن نیتروژن مایع در هاون چینی به­خوبی سائیده شد و به فالکون 15 میلی‌لیتری انتقال یافت. پنج میلی‌لیتر محلول تری‌کلرواستیک­اسید یک درصد (محلول در حمام یخ) به فالکون اضافه شد و تا یکنواخت‌سازی نمونه‌ها در حمام یخ قرار داده ‌شد. فالکون حاوی نمونه یکنواخت­شده به مدت 15دقیقه و در دمای ˚C 4 با سرعت
 × g 12000سانتریفوژ شد. سپس500 میکرو‌لیتر از مایع رویی به یک فالکون جدید حاوی یک میلی‌لیتر محلول یک مولار یدید پتاسیم و 5/0 میلی‌لیتر بافر فسفات 10 میلی‌مولار افزوده شد و پس از چند بار وارونه­کردن فالکون در محیط تاریک برای یکنواخت­نمودن محتوی آن، مقدار جذب هر نمونه در طول موجnm 390 توسط دستگاه پلیت­ریدر (model EON, Biotek company, USA) اندازه‌گیری شد .(Loreto & Velikova, 2001) نتایج به­صورت میکرومول در گرم وزن تر گیاه بیان شد.

2-4. سنجش میزان پراکسیداسیون چربی‌های غشاء (MDA[14])

میزان اکسیداسیون ژنوتیپ­ها گندم در انتهای دوره­های عادت­دهی به LT بر اساس تجمع MDA از واکنش رنگ با تیوباربیتوریک­اسید (TBA) و اندازه­گیری چگالی نوری با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر مدل Shimadzu UV160 ساخت کشور ژاپن تعیین شد. چگالی نمونه­ها در طول موج 532 نانومتر تعیین شد. محتوی MDA بر اساس فرمول   محاسبه شد که در آن D چگالی و E ضریب تمایز مولار (مول/سانتی­متر 10⁵×56/1) است (Maali-Amiri et al., 2007).

5-2. استخراج RNA، سنتز cDNA^[15] و واکنشQRT-PCR^[16]

استخراجRNA  به کمک کیت تهیه­شده از شرکت دنازیست با 80 میلی‌گرم نمونه‌ برگ فریز شده به کمک ازت مایع در هاون چینی استریل انجام گرفت. تشکیل دو نوار RNA ریبوزومی S18 وS 25 روی ژل کیفیت بالای RNA تخلیص­شده را تایید کرد. برای بررسی کمی میزان غلظتRNA از دستگاه نانودراپ اسپکتروفوتومتر ^[17](Thermo Scientific model, 1000)در طول موج nm 260 استفاده شد.  RNAاستخراج­شده با آنزیم DNaseІ تیمار شد. دو میکروگرم RNA، یک میکرولیتر بافر، یک واحد (u) آنزیمDNaseІ  و 10 واحد (u) آنزیمRNase inhibitor ، مخلوط و با افزودن آبDEPC ^[18] حجم محلول به 10 میکرولیتر رسانده شد و به مدت 30 دقیقه در دمای˚C 37 قرار گرفتند. سپس یک میکرولیتر EDTA به تیوب‌ها اضافه ‌شد و به مدت 10 دقیقه در دمای˚C 65 قرار داده ‌شدند. تیوب‌ها در˚C 80- نگه‌داری شدند.

جهت ساخت cDNA، پنج میکرولیتر RNA تیمار شده با DNase با کمک آغازگر الیگو دی­تی (یک پیکومول) (20-18 نوکلئوتید) مخلوط شد و حجم محلول با استفاده از آب DEPC  به 11 میکرولیتر رسانده شد. این مخلوط به مدت پنج دقیقه در دمای˚C 70 قرار گرفت و پس از آن روی یخ سرد شد. سپس چهار میکرولیتر بافر واکنش و دو میکرولیتر دی‌اکسی­نوکلئوتری­فسفات (dNTPs^[19]) با غلظت 10 میکرومول و 20 واحد آنزیم RNase inhibitor به هر تیوب اضافه شد و حجم محلول با آب DEPC به 19 میکرولیتر رسانده شد و به مدت پنج دقیقه در دمای  ˚C37 قرار داده شد. پس از آن 200 واحد (u) آنزیم Revert Aid M- Mulv به این محلول افزوده شده و پس از مخلوط­کردن به مدت یک ساعت در دمای˚C 42 قرار داده‌ شد. سپس برای غیر فعال­کردن واکنش، تیوب‌ها به مدت 10 دقیقه در دمای˚C 70 قرار گرفتند. 1145 نانوگرم در میکرو لیتر RNA برای سنتز cDNA  استفاده شد.

20 میکرولیتر مخلوط واکنش شامل 10 میکرولیتر کیت حاوی رنگ فلورسنت شرکت پارس­توس، سه میکرولیتر آب مقطر استریل، یک میکرولیتر از هر یک از آغازگرهای اختصاصی مستقیم و معکوس با غلظت 10 میکرومول و پنج میکرولیتر نمونه cDNA  سنتز شده با غلظت 250 نانوگرم در میکرولیتر (رقیق­شده با نسبت 1:20) بررسی شد. برای هر واکنش دو تکرار زیستی و دو تکرار تکنیکی استفاده شد. پس از آماده­کردن مخلوط واکنش، پلیت مورد نظر به دستگاه iQ5  منتقل و واکنش زنجیره‌ای پلیمراز به صورت: دو دقیقه در دمای ˚C94 و 35 تکرار با چرخه‌های 10 ثانیه در دمای˚C 95، 10 ثانیه در دمای ^[20]T_A، ˚C 57 آغازگر و 10 ثانیه در دمای ˚C72 انجام شد. نسبت بیان نسبی هر توالی با توجه به شاخص Cq محاسبه شده که میانگین کارآیی PCR ژن­های خانه­دار مورد نظر در پلیت را در بر می­گیرد. با توجه به نتایج منحنی­های استاندارد، از نرم­افزار REST^[21] می­توان برای محاسبه نسبت بین میزان ژن هدف و ژن خانه‌دار(Actin1)  در هر نمونه مشخص با روش^-ΔΔCT 2 به عنوان بیان نسبی آن ژن استفاده کرد
 .(Livak & Schmittgen, 2001)  در این روش بیان ژن مورد نظر با بیان ژن  Actin1که یک ژن خانه‌دار تنظیم شده است نرمال شده و سپس از مقادیر نرمال­شده برای مقایسه بیان متفاوت ژن­ها در نمونه­های مختلف استفاده شد. طراحی آغازگر برای ژن خانه‌دار  Actin1 با استفاده از تارنمایIntegrated DNA Technologies, Inc. (IDT)  به آدرس (https://www.idtdna.com) برای دست­یابی به آغازگرهای دارای خصوصیات مناسب انجام گرفت. در جدول 1 نام آغازگرهای ژن‌های اختصاصی و خانه­دار، توالی و شماره دسترسی آنها ارائه شده است.

جدول 1. توالی آغازگرهای مورد استفاده در تکثیر qRT-PCR ژن­های استیل­کوآنزیم­آ­کربوکسیلاز، دلتا­دساتوراز و اکتین تحت دوره­های عادت­دهی به سرما در والد نورستار و پیشتاز و لاین‌های حاصل از تلاقی آن­ها.

6-2. تجزیه داده­ها

این مطالعه بر اساس آزمایش فاکتوریل در قالب طرح بلوک کامل تصادفی با سه تکرار زیستی برای آزمایش­های بخش فیزیولوژی و دو تکرار زیستی و سه تکرار تکنیکی برای آزمایش­های بخش بیان نسبی ژن انجام شد. آزمون مقایسه میانگین­ها به روش دانکن (0.05 P<) با نرم­افزار SAS 9.4 صورت گرفت.

3. نتایج پژوهش و بحث

نتایج تجزیه واریانس نشان داد که بین ارقام، سطوح تیماری و اثر متقابل آن­ها از لحاظ میزان MDA، اختلاف معنی‌داری در سطح احتمال یک درصد وجود داشت. تحت شرایط مزرعه در آذر ماه ژنوتیپ­های گندم با تیپ رشد زمستانه و بینابینی، LT₅₀ بالاتری نسبت به دیگر ژنوتیپ­ها داشتند (66/10- سانتی­گراد برای نورستار، 10- سانتی­گراد برای لاین L2 و 8- سانتی­گراد برای لاین L1) (جدول 2).

جدول 2. میزان LT₅₀ تحت دوره­های عادت­دهی به سرما در آذر ماه (December)، دی­ماه (January) و بهمن­ماه (February) در والد نورستار و پیشتاز و لاین‌های حاصل از تلاقی آن­ها.

بالا بودن تحمل به سرما در ژنوتیپ­های نیازمند بهاره­سازی[22] نشان داد که این ژنوتیپ­ها در شرایط مزرعه و قبل از آغاز تنش یخ­زدگی، شروع به عادت­دهی به سرما کرده و با طولانی­کردن دوره فاز رویشی، امکان بقای زمستانه خود را فراهم کردند. والد زمستانه نورستار و لاین­های L2  و L1 بیشترین درجه LT₅₀ (به­ترتیب 22-، 20- و 18- سانتی­گراد) را در دی­ماه نشان داد که به نظر می­رسد براساس زمان و دمای هوا مصادف با محدوده اشباع بهاره­سازی و در امتداد با ورود به فاز زایشی در این ژنوتیپ­ها می­باشد؛ لذا میزان تحمل به سرما در بهمن­ماه کاهش یافت.

گزارش­ها نشان می­دهد که با تکمیل نیاز بهاره­سازی در غلات زمستانه و همزمان با شروع فاز زایشی، میزان تحمل به سرما به­طور قابل توجهی کاهش می­یابد (Hosseini et al., 2016; Janmohammadi et al., 2018). بنابراین نتایج حاصل از ارزیابی LT₅₀ نشان­دهنده کاهش تحمل به سرما همزمان با شروع فاز زایشی در بهمن­ماه در همه ژنوتیپ­های نیازمند بهاره­سازی بود. ژنوتیپ­های با عادت رشد بهاره از جمله والد پیشتاز و لاین­هایL3 و L5 نسبت به دیگر ژنوتیپ­ها ظرفیت پایینی در تحمل به سرما داشتند. بیشترین تحمل این ژنوتیپ­ها در آذرماه (4- درجه سانتی­گراد برای پیشتاز، 33/5- و 4- درجه سانتی­گراد به­ترتیب برای لاین­های L3  و L5) اندازه­گیری شد. به­نظر می­رسد که تحمل به سرمای پایین در این ژنوتیپ­ها به هیچ وجه نیاز بهاره­سازی ندارند. میزان تحمل به سرما در لاینL4  که دارای نیاز بهاره­سازی کوتاه بود، در دی­ماه (محدوده اشباع نیاز بهاره­سازی) به بیشترین مقدار خود (10- درجه سانتی­گراد برایL4 ) رسید و پس از آن در بهمن­ماه کاهش یافت. مطابق با نتایج، در بهمن­ماه، تحمل به سرما در همه ژنوتیپ کاهش یافت؛ با این وجود تفاوت قابل توجهی بین ژنوتیپ­ها از نظر تحمل به سرما وجود داشت. در بهمن­ماه به­ترتیب ژنوتیپ­های با تیپ رشد زمستانه و بینابینی از میزان تحمل بالاتری نسبت به ژنوتیپ­ها با تیپ رشد بهاره برخوردار بودند. از این رو از این ژنوتیپ­ها می­توان جهت جلوگیری از خسارت ناشی از نوسانات دمایی استفاده کرد.

در مطالعه حاضر در تمامی ژنوتیپ­ها به استثنای والد نورستار، با شروع دوره­های عادت­دهی به سرما، میزان تجمع H₂O₂ تا دی­ماه نسبت به شرایط شاهد افزایش یافت، اما این افزایش در ژنوتیپ­های با عادت رشد بهاره (والد پیشتاز و لاین­های  L3و L5) بیشتر بود (شکل 1).

به دنبال آن و با ورود ژنوتیپ­ها به بهمن­ماه محتوی H₂O₂ به­ویژه در ژنوتیپ­های بهاره به­طور چشم­گیری افزایش یافت. بیشترین میزان تجمع H₂O₂ به­ترتیب مربوط به لاین L5، والد پیشتاز و لاینL3 در بهمن­ماه بود که به­ترتیب 71، 83 و 85 برابر شرایط شاهد افزایش یافت. همانطور که انتظار می­رفت محتوی H₂O₂ در والد زمستانه نورستار در شرایط شاهد و در طول دوره­های عادت­دهی به سرما پایین بود. در لاین­های L1 و L2که داری نیاز بهاره­سازی بسیار قوی بودند میزان تجمع H₂O₂ تا دی­ماه پایین بود، اما با انتقال از مرحله رویشی به مرحله زایشی که مصادف با از دست­رفتن تحمل به سرما در این ژنوتیپ­ها بود، افزایش یافت. پاسخ گیاهان به تنش­های محیطی اغلب با تجمع ROS در ارتباط است.

مابین ROSها، H₂O₂ به عنوان پایدارترین مولکول با بسیاری از مکانیسم­های مربوط به دفاع در ارتباط است
 (Arfan et al., 2019). H₂O₂ در پاسخ به شرایط تنش ممکن است نقش دوگانه داشته باشد. به­عنوان مثال، می­تواند به عنوان مولکول­های پیام­رسان، پاسخ به تنش را میانجی­گری کرده و یا به عنوان یک مولکول فعال اکسیژن، منجر به تنش اکسیداتیو در سلول شود (Shi et al., 2010; Hosseini et al., 2021). بنابراین، در مطالعه حاضر در زمان شروع فرایند عادت­دهی به سرما، یک نقش دوگانه­ای را برای H₂O₂ می­توان پیشنهاد کرد. تولید H₂O₂ در سطح پایین در ژنوتیپ­های متحمل از جمله والد متحمل، لاین­های L1 و L3 ممکن است به عنوان یک مولکول پیام­رسانی عمل کرده و نمو گیاه و سازگاری به تنش سرما را تنظیم کند. اما افزایش تجمع آن در بهمن­ماه احتمالا منجر به خسارت سلولی در ژنوتیپ­های با عادت رشد بهاره شده است. اختلاف محتوی H₂O₂ در ژنوتیپ­های با عادت رشد زمستانه و بهاره در بهمن­ماه تاییدکننده این موضوع بود. ویژگی منحصر به فرد برخی از ژنوتیپ­ها از جمله والد زمستانه نورستار، در تجمع H₂O₂ حتی در بهمن­ماه در مقایسه با بقیه ژنوتیپ­ها می­تواند به عنوان شاخص انتخاب مورد استفاده قرار گیرد.

شکل 1. میزان H₂O₂ و MDA تحت دوره­های عادت­دهی به سرما (آذرماه (December)، دی­ماه (January) و بهمن­ماه (February) در والد نورستار و پیشتاز و لاین‌های حاصل از تلاقی آن­ها.

تحت شرایط آزمایشی روند تغییرات MDA مشابه روند تغییرات H₂O₂ بود. بنابراین به نظر می‌رسد در گیاهان تجمع ROSها ازجملهH₂O₂ ، سرآغاز تنش اکسیداتیو بوده و منجر به پراکسیداسیون لیپید غشای سلولی می­شود؛ از این رو، غلظت MDA، محصول متداول پراکسیداسون لیپید، به عنوان یک شاخص تحلیلی حساس برای خسارت اکسیداتیو در نظر گرفته شده است
 (Heidarvand et al., 2011; Kazemi Shahandashti et al., 2018). بالا رفتن غلظت MDA و H₂O₂ در بهمن­ماه به­ویژه در ژنوتیپ­های با عادت رشد بهاره، نشان­دهنده حضور تنش اکسیداتیو و پراکسیداسیون لیپیدهای غشای ناشی از صدمات غشایی است (Golizadeh & Kumleh, 2019). ارتباط محتوی H₂O₂ و MDA با LT₅₀، نشان می‌دهد که تنش اکسیداتیو القا شده توسط سرما بسیار مرتبط با تحمل سرما است. از این رو به‌نظر می­رسد که ژنوتیپ­های زمستانه با فاز رویشی بلند به دلیل نیاز بهاره­سازی افزایش­یافته دارای محتوی پایین H₂O₂ و MDA بوده و از تحمل به سرمای بالاتری برخوردار بودند.

از­آنجایی­که افزایش H₂O₂ و MDA در ژنوتیپ­های با تیپ رشد زمستانه خیلی کمتر از ژنوتیپ­های با تیپ رشد بهاره بود، از این رو به‌نظر می­رسد افزایش محتوی این متابولیت­ها در این ژنوتیپ­ها به معنی خسارت نیست. بر اساس نتایج، منطبق­بودن MDA و میزان ROSهای سلولی نشان­دهنده ارتباط فیزیولوژیک این شاخص‌ها بوده؛ به­نحوی­که با کاهش میزان ROSها در اثر فرایندهای عادت­دهی به سرما به­ویژه در لاین‌های زمستانه، میزان پراکسیداسیون لیپیدها کاهش یافت. بنابراین اجرای آزمایش تحت شرایط مزرعه و دماهای محیط در دوره‌های عادت‌دهی به سرما قادر به تفکیک لاین‌ها و ژنوتیپ‌های مطالعه­شده از نظر تحمل به تنش سرما شده است، نتایجی که می­تواند با مقایسه داده­های MDA و H₂O₂ تایید شود.

مطابق با نتایج ظرفیت تحمل به تنش سرما در ژنوتیپ­ها یکسان نبوده و وابسته به ژنوتیپ، مرحله رشد و نمو و شدت تنش سرما تغییر می­کند. مابین ماکرومولکول­های سلولی، لیپیدهای غشایی به­خصوص غشای پلاسمایی و کلروپلاستی، بیشترین تاثیر را در بروز تحمل به تنش نشان می­دهند (Hameed et al., 2012; Kazemi Shahandashti & Maali-Amiri, 2018). ظرفیت تحمل به سرما احتمالا مرتبط با فعالیت ژنهای بیوسنتزی اسیدهای چرب دخیل در ساختارهای غشایی خواهد بود. مابین این ژنها استیل­کوانزیم­آ­کربوکسیلاز[23] (TaACO)، دخیل در سنتز مالونیل­کوانزیم­آ[24]، پیش­ماده اصلی بیوسنتز اسیدهای چرب می‌باشد.

در مطالعه حاضر میزان بیان نسبی ژن TaACO در والد زمستانه نورستار در شرایط کنترل  پایین بوده، لیکن با شروع تنش سرما میزان بیان ژن افزایش یافت و در دی­ماه با بالاترین میزان خود (حدود 6/13 برابر) رسید (شکل 2). پس از تکمیل نیاز بهاره­سازی در دی­ماه با ورود این ژنوتیپ به فاز زایشی در بهمن­ماه، میزان بیان این ژن کاهش نسبی نشان داد اگرچه هنوز میزان بیان آن هشت برابر بیان این ژن در شرایط شاهد بود. تغییرات بیان این ژن در لاین‌های L1، L2 و L4نیز مشابه والد متحمل به سرما بود. در این لاین‌ها با شروع دوره­های عادت­دهی به سرما میزان بیان این ژن به­تدریج افزایش یافت و با ورود آن­ها به فاز زایشی در بهمن­ماه کاهش نسبی نشان داد.

بالا بودن بیان ژن TaACO نشان­دهنده روبه­رو شدن گیاهان با تنش سرما و حفظ ساختار غشایی به دنبال افزایش میزان ROSها در سلول دارد. افزایش میزان ROSهای سلولی باعث القاء تنش اکسیداتیو ثانویه در سلول‌ها شده که پراکسید­شدن اسیدهای چرب غیر اشباع غشاها را به دنبال داشته و سبب اختلال در فعالیت غشاء و مرگ سلولی می‌شود (Javidi et al., 2023). بنابراین بیشترین میزان سنتز اسیدهای چرب می­تواند با تعدیل میزانH₂O₂  در سلول همراه باشد. کاهش نسبی میزان بیان ژن در بهمن­ماه در اثر افزایش نسبی دما و شروع فاز زایشی در این دوره بوده که فعالیت تعدیل­شده سیستم دفاعی گیاه را نشان می‌دهد. افزایش نسبی میزانH₂O₂  می‌تواند تاییدکننده این فرضیه باشد.

بر اساس نتایج، بالا بودن میزان بیان نسبی ژن TaACO در ژنوتیپ­های زمستانه و در فاز رویشی، از ویژگی‌های تحمل به تنش سرما در این لاین‌ها می‌باشد. افزایش بیان کمتر این ژن در ژنوتیپ­های بهاره در مقایسه با لاین‌های متحمل به سرما تاییدکننده این موضوع می‌باشد. با قرار گرفتن ژنوتیپ­های بهاره تحت شرایط عادت­دهی به سرما بیان ژن TaACO در دی­ماه نسبت به شرایط شاهد تنها افزایش نسبی نشان داد. بنابراین به نظر می‌رسد افزایش زودهنگام، مداوم و قابل توجه بیان ژن TaACO در ژنوتیپ­های پاییزه (والد نورستار و لاین‌های L1، L2 وL4) تاییدکننده عادت رشدی این ژنوتیپ­ها و همچنین تاثیر قابل توجه این ژن به نقش غشاهای سلولی در تحمل به تنش سرما اشاره دارد. بیشترین میزان LT₅₀ در دی­ماه و به­خصوص در ژنوتیپ‌های نوع پاییزه در امتداد با بیشترین میزان بیان این ژن به نقش اساسی آن در دوره عادت­دهی به سرما و القای تحمل به سرما اشاره دارد. قرارگیری حد واسط میزان بیان نسبی ژن TaACO در ژنوتیپ L1 احتمالا می­تواند توجیه­کننده عادت رشدی بینابینی[25] آن نسبت به دو والد پاییزه و بهاره نشان دهد. بنابراین مطابق با نتایج ژنTaACO به­طور پیوسته در ژنوتیپ­های پاییزه بیان بیشتری در مقایسه با ژنوتیپ‌های بهاره داشته و مربوط به دوره عادت­دهی به تنش سرما می­باشد.

شکل 2. میزان بیان نسبی ژن‌های استیل­کوآنزیم­آ­کربوکسیلاز و دلتا دساتوراز تحت دوره­های عادت­دهی به سرما (آذرماه (December)، دی­ماه (January) و بهمن­ماه (February) در والد نورستار و پیشتاز و لاین‌های حاصل از تلاقی آن­ها.

آنزیم­های دساتوراز نقش مهمی در پایداری و حفظ سیالیت غشا در اثر افزودن پیوندهای دوگانه در زنجیره اسیدهای چرب غشاء تحت تنش سرما دارند. در فرآیند غیر اشباع اسیدهای چرب، تنش سرما بیان ژن 12Δ دساتوراز را تحت تاثیر قرار داد. در این ژنوتیپ­ها، بیان نسبی ژن 12Δ تحت شرایط مزرعه به تدریج افزایش یافت و در دی­ماه به بیشترین مقدار خود رسید و پس از آن با ورود ژنوتیپ­ها به فاز زایشی در بهمن­ماه کاهش نشان داد.

مطابق با نتایج، بیشترین بیان این ژن در دی­ماه در امتداد با بیشترین میزان پاسخ به سرما در این ژنوتیپ‌ها رخ داد. در والد زمستانه نورستار بیان نسبی ژن 12Δ طی دوره­های عادت­دهی به سرما تا بهمن­ماه افزایش نشان داد. در مقابل در والد بهاره پیشتاز میزان افزایش‌ها کمتر از لاین‌های زمستانه مشاهده شد. بیشترین افزایش بیان این ژن مربوط به رقم نورستار (به تقریب ده برابر) و کمترین افزایش (به تقریب دو برابر) به ژنوتیپ‌های با تیپ بهاره اختصاص یافت.

مطابق با نتایج، به نظر می‌رسد تحت تنش سرما میزان LT₅₀ احتمالا با فعالیت این ژن در ارتباط بوده؛ به­طوری­که با افزایش فعالیت این ژن، درجه تحمل به سرما در ژنوتیپ‌ها تحت تاثیر بوده است. تغییر میزان شاخص خسارت از نوع H₂O₂ و نیز MDA با میزان پاسخ‌های سلولی در ارتباط بوده و در لاین‌های متحمل تعدیل­شدن بیشتر H₂O₂ با افزایش میزان بیان این ژن و میزان LT50 در ارتباط بود. نتایج حاصل از ارزیابی بیان ژن 12Δ در شرایط تنش، نشان­دهنده افزایش معنی­دار بیان نسبی آن در لاین‌های متحمل به تنش سرما نسبت به لاین‌های حساس بود. میزان بیان این ژن در گیاهان زراعی از جمله گندم، سیب‌زمینی و نخود زراعی تحت شرایط تنش سرما در ارقام متحمل نسبت به ارقام حساس به­طور قابل توجهی افزایش یافته است
 (Baek & Skinner 2003; Maali-Amiri et al., 2010; Nejadsadeghi et al., 2015). بنابراین با افزایش میزان فعالیت این ژن میزان غیر اشباعی اسیدهای چرب غشا افزایش یافته و تحت تنش سرما سیالیت غشا حفظ خواهد شد، شرایطی که به تحمل بالاتر لاین‌های زمستانه در مقایسه با لاین‌های بهاره کمک می‌کند. این شرایط می‌تواند به کاهش میزان MDA در لاین‌های زمستانه منجر شود. در همین راستا، نتایج مطالعه حاضر نیز نشان داد که در دی­ماه که ژنوتیپ­ها زمستانه از تحمل به سرمای بالایی برخوردار بودند، میزان بیان نسبی این ژن نیز نسبت به ارقام حساس در سطح بالایی قرار داشت. بر همین اساس و به دلیل افزایش بیان ژن 12Δ در ژنوتیپ­های متحمل، مطالعه الگوی تغییرات این ژن به عنوان یک شاخص جهت انتخاب ارقام متحمل به سرما در برنامه اصلاح گندم می­تواند استفاده شود.

4. نتیجه­گیری

میزان پاسخ­ها در دو تیپ گندم بهاره و زمستانه اشاره به ظرفیت ژنتیکی بالقوه والد و لاین‌های زمستانه در مقایسه با انواع بهاره داشت. این موضوع بیانگر نقش مهم فرایند فیزیولوژیکی مولکولی سازگاری در تحمل به تنش سرما می­باشد. این نتایج اثرات معنی­دار توسعه فنولوژیک و تغییرات متابولیکی گندم را در تحمل به سرما نشان داد. در ژنوتیپ­های نیازمند بهاره­سازی، ژن‌های دخیل در مسیرهای بیوسنتز اسیدهای چرب غیر اشباع فعال‌تر از ژنوتیپ­های با عادت رشد بهاره بوده و به­واسطه میزان طول فاز رویشی، میزان تحمل به سرما را تحت تاثیر قرار داد. ظرفیت ژنتیکی تحمل به سرما که در تحقیق حاضر از طریق میزان تجمع H₂O₂ و MDA اندازه­گیری شد، در ژنوتیپ­های نیازمند بهاره­سازی منجر به افزایش تحمل به سرما شد. بنابراین کمترین افزایش‌ها در شاخص‌های خسارت لاین‌های زمستانه در مقایسه با لاین‌های بهاره در بهمن­ماه در فاز رویشی اتفاق افتاده و انتقال از مرحله رویشی به زایشی نقطه عطفی در بیان تحمل به سرما بوده؛ به­طوری­که پس از ورود به فاز زایشی و تکمیل نیاز بهاره­سازی، باعث کاهش قابل ملاحظه­ای در میزان تحمل به سرما و بیان ژن­های مرتبط با تحمل به سرما می­شود. بررسی شبکه­های تنظیم متابولیک درگیر در بهاره­سازی فرآیند و فرصتی ارزشمند برای شناسایی برخی از مکانیسم­های درگیر در فرآیند تحمل به تنش سرما بود. نتایج این آزمایش وضعیت بیوشیمیایی غشا سلول را به موازات میزان خسارت MDA (به عنوان شاخص اکسیداسیون غشا) نشان داد؛ به­طوری­که والد زمستانه نورستار، لاین زمستانه L2 و لاین بینابینی  L1می­توانند در برنامه­های به­نژادی به عنوان والد در تحقیقات مربوط به سرما استفاده شده و یا به عنوان ارقام متحمل به سرما وارد چرخه تولید شوند.

5. منابع

Alipour, H., Bihamta, M.R., Mohammadi, V., Peyghambari, S.A., Bai, G., & Zhang, G. (2017). Genotyping-by-sequencing (GBS) revealed molecular genetic diversity of Iranian wheat landraces and cultivars. Frontiers in Plant Science, 8, 1293.

Amini, S., Maali-Amiri, R., Kazemi-Shahandashti, S.S., Lopez-Gomez, M., Sadeghzadeh, B., Sobhani-Najafabadi, A., & Kariman, K. (2021). Effect of cold stress on polyamine metabolism and antioxidant responses in chickpea. Journal of Plant Physiology, 258, 153387.

Amiri, R.M., Yur’eva, N.O., Shimshilashvili, K.R., Goldenkova‐Pavlova, I.V., Pchelkin, V.P., Kuznitsova, E.I., Tsydendambaev, V.D., Trunova, T.I., Los, D.A., Jouzani, G.S., & Nosov, A.M. (2010). Expression of acyl‐lipid Δ12‐desaturase gene in prokaryotic and eukaryotic cells and its effect on cold stress tolerance of potato. Journal of Integrative Plant Biology, 52, 289-297.

Arfan, M., Zhang, D.W., Zou, L.J., Luo, S.S., Tan, W.R., Zhu, T., & Lin, H.H. (2019). Hydrogen peroxide and nitric oxide crosstalk mediates brassinosteroids induced cold stress tolerance in Medicago truncatula. International Journal of Molecular Sciences, 20, 144.

Baek, K.H., & Skinner, D.Z. (2003). Alteration of antioxidant enzyme gene expression during cold acclimation of near-isogenic wheat lines. Plant Science, 165, 1221-1227.

Cheli, F., Pinotti, L., Novacco, M., Ottoboni, M., Tretola, M., & Dell’Orto, V. (2017). Mycotoxins in wheat and mitigation measures. Wheat Improvement, Management and Utilization, 25, 227.

Feng, Y., Zhao, Y., Wang, K., Li, Y.C., Wang, X., & Yin, J. (2016). Identification of vernalization responsive genes in the winter wheat cultivar Jing841 by transcriptome sequencing. Journal of Genetics, 95, 957-964.

Gao, C., Sheteiwy, M.S., Han, J., Dong, Z., Pan, R., Guan, Y., Alhaj Hamoud, Y., & Hu, J. (2020). Polyamine biosynthetic pathways and their relation with the cold tolerance of maize (Zea mays L.) seedlings. Plant Signaling and Behavior, 15, 1807722.

Ghasemi-Mobtaker, H., Kaab, A., & Rafiee, S. (2020). Application of life cycle analysis to assess environmental sustainability of wheat cultivation in the west of Iran. Energy, 193, 116-768.

Gill, S.S., & Tuteja, N. (2010). Reactive oxygen species and antioxidant machinery in abiotic stress tolerance in crop plants. Plant Physiology and Biochemistry, 48, 909-930.

Golizadeh, F., & Kumleh, H.H. (2019). Physiological responses and expression changes of fatty acid metabolism–related genes in wheat (Triticum aestivum) under cold stress. Plant Molecular Biology Reporter, 37, 224-236.

Heidarvand, L., Maali-Amiri, R., Naghavi, M.R., Farayedi, Y., Sadeghzadeh, B., & Alizadeh, K. (2011). Physiological and morphological characteristics of chickpea accessions under low temperature stress. Russian Journal of Plant Physiology, 58, 157-163.

Hosseini, M., Maali-Amiri, R., Mahfoozi, S., Fowler, D.B., & Mohammadi, R. (2016). Developmental regulation of metabolites and low temperature tolerance in lines of crosses between spring and winter wheat. Acta Physiologiae Plantarum, 38, 87.

Hosseini, M., & Saidi, A. (2019). Phylogenetic and structural study of plant polyamine oxidases. Journal of Crop Biotechnology, 23, 19-36.

Hosseini, M., Saidi, A., Maali-Amiri, R., Abbasi, A., & Khosravi-Nejad, F. (2021). Developmental regulation and metabolic changes of RILs of crosses between spring and winter wheat during low temperature acclimation. Environmental and Experimental Botany, 182, 104299.

Hosseini, M., Saidi, A., Maali-Amiri, R., Khosravi-Nejad, F., & Abbasi, A. (2023). Low-temperature acclimation related with developmental regulations of polyamines and ethylene metabolism in wheat recombinant inbred lines. Plant Physiology and Biochemistry, 205, 108198.

Janmohammadi, M., Sabaghnia, N., & Mahfoozi, S. (2018). Frost tolerance and metabolite changes of rye (Secale cereale) during the cold hardening and overwintering. Acta Physiologiae Plantarum, 40, 42.

Javidi, M.R., Maali-Amiri, R., Poormazaheri, H., Niaraki, M.S., & Kariman, K. (2022). Cold stress-induced changes in metabolism of carbonyl compounds and membrane fatty acid composition in chickpea. Plant Physiology and Biochemistry, 192, 10-19.

Karami-Moalem, S., Maali-Amiri, R., & Kazemi-Shahandashti, S.S. (2018). Effect of cold stress on oxidative damage and mitochondrial respiratory properties in chickpea. Plant Physiology and Biochemistry, 122, 31-39.

Kazemi-Shahandashti, S.S., Maali-Amiri, R., Zeinali, H., Khazaei, M., Talei, A., & Ramezanpour, S.S. (2014). Effect of short-term cold stress on oxidative damage and transcript accumulation of defense-related genes in chickpea seedlings. Journal of Plant Physiology, 171, 1106-1116.

Loreto, F., & Velikova, V. (2001). Isoprene produced by leaves protects the photosynthetic apparatus against ozone damage, quenches ozone products, and reduces lipid peroxidation of cellular membranes. Plant Physiology, 127, 1781-1787.

Los, D.A., & Murata, N. (2004). Membrane fluidity and its roles in the perception of environmental signals. Biochemistry and Biophysics Acta, 1666, 142-157.

Mahfoozi, S., Limin, A.E., & Fowler, D.B. (2001). Developmental regulation of low-temperature tolerance in winter wheat. Annals of Botany, 87, 751-757.

Mahfoozi, S., Majdi, M., Janmohammadi, M., Sasani, S., Tavakol-Afshari, R., & Hosseini-Salekdeh, G. (2019). Developmental control of cold tolerance in wheat (Triticum aestivum). Wheat Research, 18, 53-68.

Mahfoozi, S., Limin, A.E., Ahakpaz, F., & Fowler, D.B. (2006). Phenological development and expression of freezing resistance in spring and winter wheat under field conditions in north-west Iran. Field Crops Research, 97, 182-187.

Nejadsadeghi, L., Maali-Amiri, R., Zeinali, H., Ramezanpour, S., & Sadeghzade, B. (2015). Membrane fatty acid compositions and cold-induced responses in tetraploid and hexaploid wheats. Molecular Biology Reports, 42, 363-372.

Orlova, I.V., Serebriiskaya, T.S., Popov, V., Merkulova, N., Nosov, A.M., Trunova, T.I., Tsydendambaev, V.D., & Los, D.A. (2003). Transformation of tobacco with a gene for the thermophilic acyl-lipid desaturase enhances the chilling tolerance of plants. Plant Cell Physiology, 44, 447-450.

Samsami, H., & Maali-Amiri, R. (2024). Global insights into intermediate metabolites: Signaling, metabolic divergence and stress response modulation in plants. Plant Physiology and Biochemistry, 213, 108862.

Shen, Y., Li, J., Gu, R., Yue, L., Wang, H., Zhan, X., & Xing, B. (2018). Carotenoid and superoxide dismutase are the most effective antioxidants participating in ROS scavenging in phenanthrene accumulated wheat leaf. Chemosphere, 197, 513-525.

Shourbalal, S.K., Soleymani, A., & Javanmard, H.R. (2019). Shortening vernalization in winter wheat (Triticum aestivum L.) using plant growth regulators and cold stratification. Journal of Cleaner Production, 10, 443-50.

Sun, J., Yang, L., Wang, J., Liu, H., Zheng, H., Xie, D., Zhang, M., Feng, M., Jia, Y., Zhao, H., & Zou, D. (2018). Identification of a cold-tolerant locus in rice (Oryza sativa L.) using bulked segregant analysis with a next-generation sequencing strategy. Rice, 11, 1-12.

Waalen, W.M., Stavang, J.A., Olsen, J.E., & Rognli, O.A. (2014). The relationship between vernalization saturation and the maintenance of freezing tolerance in winter rapeseed. Environmental and Experimental Botany, 106, 164-173.

Wu, Z.G., Jiang, W., Chen, S.L., Mantri, N., Tao, Z.M., & Jiang, C.X. (2016). Insights from the cold transcriptome and metabolome of dendrobium officinale: Global reprogramming of metabolic and gene regulation networks during cold acclimation. Frontiers in Plant Science, 7, 1653.

1.Vernalization

[2]. Acclimation

[3]. Cold tolerance

[4]. Freezing

[5]. Reactive oxygen species

[6]. Superoxide dismutase

[7]. Catalase

[8]. Guaiacol peroxidase

[9]. Polyphenol oxidase

[10]. Desaturase

[11]. Recombinant inbred line

[12]. Facultative

[13]. Lethal temperature (LT50)

[14]. Malondialdehyde

[15]. Complementary DNA

[16]. Quantitative reverse transcriptase PCR  

[17]. Nanodrop spectrophotometer

[18]. Diethyl pyrocarbonate

[19]. Deoxynucleotide triphosphates

[20]. Annealing temperature

[21]. Representational state transfer software

[22]. Vernalization

[23]. Acetyl-CoA carboxylase

[24]. Malonyl-CoA

[25]. Facultative