Evaluating the Regulation of Diamine Cadaverine Content as a Cold Stress Tolerance Index in Chickpea

1. مقدمه

نخود زراعی (Cicer arietinum L.) گیاهی خودگشن و دیپلوئید (2n=2x=16) محسوب شده و محتوی ژنتیکی نسبتا کوچکی 740 Mbp)) ‌دارد (Varshney et al., 2013). به­طور کلی بذر این گیاه دارای 2/31-4/16 درصد پروتئین، 0/9-6/1 درصد فیبر، 3/73-1/38 درصد کربوهیدرات و 8/6-5/1 درصد چربی است (Mantri et al., 2007). پتانسیل تولید نخود در دنیا 5 تن در هکتار بوده؛ درحالی­که تولید واقعی آن 8/0 تن در هکتار است FAO, 2012)). میزان سطح زیر کشت این گیاه در ایران 500189 هکتار و عملکرد در واحد سطح آن 542 کیلوگرم در هکتار است (آمارنامه کشاورزی 95-1394). پایین­بودن عملکرد نخود در ایران، غالباً به­دلیل کشت ارقام کم­محصول و حساسیت آن به تنش‌های محیطی است.

کشت بهاره نخود زراعی با مشکلاتی از جمله خشکی و کمبود رطوبت آخر فصل همراه است که منجر به کاهش­یافتن بهره­وری و تولید تا میزان 400-300 کیلوگرم در هکتار می‌شود. کشت­های پاییزه یا زمستانه این گیاه با­توجه­به وجود رطوبت امکان­پذیر بوده، ولی سرما عامل محدودکننده در توسعه کشت پاییزه نخود محسوب می‌شود
 (Kazemi Shahandashti et al., 2013). بنابراین بهبود تحمل به تنش سرما یکی از برنامه‌های اساسی به‌نژادی در سازگاری، بهبود تولید و عملکرد نخود زراعی است (Heidarvand et al., 2011). در طی تنش‌های غیر زیستی از جمله سرما تجمع بیش ‌از حد گونه‌های اکسیژن فعال (ROS) سبب آسیب‌های شدید به ماکرومولکول‌های سلولی از جمله تخریب پروتئین‌ها و آنزیم‌ها، و شکستن مولکول‌های اسیدنوکلئیک در سلول‌های گیاهی می‌شود (Amini et al., 2017). برای مقابله با ROSها و تنش اکسیداتیو القاشده توسط آنها، فرایند سازگاری به تنش با تغییر میزان متابولیت‌های سلولی از طریق تنظیم تظاهر ژن‌ها و فعالیت آنزیم‌ها تغییر می­کند (Heidarvand et al., 2013). بنابراین تحت تنش‌های محیطی برنامه‌ریزی مجدد بیان ژن‌ها با تغییر الگوی بیان ژن‌ها می‌تواند سبب تغییر متابولیسم سلولی و هموستازی جدید شود.

H₂O₂ مولکول پیام‌رسان حیاتی با قابلیت مشارکت در فرآیند‌های فیزیولوژیک گیاهی مانند پاسخ‌ سازگاری به تنش‌هاست (Dickinson & Forman, 2002). کاداوارین (^[1]Cad)، سبک‌ترین عضو خانواده پلی‌آمین‌ها (^[2]PAs) در واقع‌ اسمولیتی پلی‌کاتیونی است که در پویایی فرآیندهای سلولی، رشد، نمو، تمایز و پاسخ به تنش‌های محیطی مشارکت دارد (Handa et al., 2010). این متابولیت از پیش‌ماده لیزین^[3] در یک مسیر بیوسنتزی تولید ‌و در ادامه توسط توسط دی­آمین­اکسیداز (DAO^[4]) به آلکالوئیدها تبدیل می­شود (Rajpal & Tomar, 2020). آنزیم DAO (EC 1.4.3.6) گروهی از آمین‌اکسیدازهای ((AOs گیاهی حاوی مس (CuAOs) است (Cona et al., 2006) که با تنظیم میزان PAs، از جمله کاداوارین (Cad) و تجزیه آن به آلکالوئیدها نقش مهمی در تنظیم فرآیندهای فیزیولوژیک از جمله رشد، نمو، گلدهی، پیری و پاسخ به تنش‌های زیستی و غیر زیستی ایفا می‌کنند
(Angelini et al., 2010; Wimalasekera et al., 2011a,b)؛ فرآیندی که مولکول پیام‌رسان H₂O₂ را نیز از طریق کاتابولیسم این PAs تولید می‌کند (Minocha et al., 2014; Tiburcio et al., 2014).

کاداوارین به­عنوان پلی­آمین سبک، علاوه­بر ایفای نقش اسموپروتکتنت با حذف رادیکال­های آزاد در تنظیم هموستازی سلول نیز موثر است. همچنین کاداوارین می‌تواند به‌عنوان مولکول سیگنال در تنظیم فعالیت­های سلولی و تحریک بیان ژن‌هایی که در بازیابی تنش موثرند نیز نقش ایفا کند (Simon-Sarkadi et al., 2014). محتوی کاداورین از طریق القای فعالیت آنزیم‌ لیزین­دکربوکسیلاز در مسیر بیوسنتز و نیز ممانعت از فعالیت آنزیم‌ دی­آمین اکسیداز ((Cassan et al., 2009 در مسیر تجزیه تجمع می‌یابد. آمینواسید لیزین پیش‌ساز رایج کاداوارین است (Simon-Sarkadi et al., 2014). در شکل 1 مسیر متابولیک کاداوارین به‌طور شماتیک نمایش داده شده است. تغییر محتوی کاداوارین نقش مهمی در پاسخ‌ گیاه به تنش‌های غیر زیستی ایفا می‌کند (Rajpal & Tomar, 2020). تجمع کاداوارین در گونه‌های مختلف گیاهی متفاوت بوده (Alcazar et al., 2010a) و به­طور معمول محتوی آن تحت تنش‌های محیطی افزایش می‌یابد (Rajpal & Tomar, 2020).

تحت تنش­های محیطی شوری و خشکی افزایش محتوی کاداوارین گیاهی به­عنوان یک حفاظت­کننده اسمزی گزارش شده است (Shen & Galston, 1985; Garcia-Garcia et al., 2000; Shalaby, 2000; Carrizo et al., 2001;
Kuznetsov et al., 2009; López-Gómez et al., 2017; Köhler & Szepesi, 2023; Napieraj et al., 2023; Kapoor, 2023; Samanta et al., 2023)؛ به­طوری­که به­موازات جلوگیری از پراکسیداسیون لیپیدها سبب بهبود تحمل به تنش­ها شده است (Kuznetsov et al., 2007; Sziderics et al., 2010; Simon-Sarkadi., 2014). در پاسخ به تنش گرما، برنج محتوی کاداوارین خود را افزایش داده که بیانگر نقش این پلی­آمین در تحمل به تنش گرما است (Kapoor, 2023). این متابولیت به‌عنوان تعدیل‌کننده اسمزی نیز با محافظت از ساختارهای درون­سلولی در طی تنش­های محیطی نقش مهمی در بهبود تحمل به تنش­های محیطی در گیاهان دارد (Simon-Sarkadi et al., 2014). از کاداوارین به‌عنوان یک نشانگر بیوشیمیایی برای تحمل به تنش­های محیطی استفاده شده (Janmohammadi et al., 2012) و ارتباط مثبت و معنی‌دار آن با تحمل تنش گزارش شده است (Rajpal & Tomar, 2002). Kuznetsov et al. (2007) گزارش کردند که اسپری‌پاشی Cad روی بذور گیاهان زراعی با کاهش آثار تنش، جوانه‌زنی بذر و رشد گیاهچه را تحت تنش شوری تسهیل می‌کند (Avusoglu et al., 2007; Tomar et al., 2013b).

شکل 1. نمایش شماتیک مسیر متابولیک کاداوارین در گیاهان (Moschou et al., 2012).

بیان ژن فرآیند مولکولی حائز اهمیتی است که بین تنوع ژنتیکی و فنوتیپی ارتباط برقرار می‌کند و تنظیم آن نقش مهمی در تنوع صفت­ها و تکامل گونه‌ها ایفا می‌کند .(Wang et al., 2018) همچنین تغییرات بیان ژن‌ها در پایه‌ریزی تنوع فنوتیپ بسیاری از موجودات ایفای نقش می‌کند.(Konishi et al., 2006, Hung et al., 2012)  بنابراین مقایسه محتوی رونوشت در شرایط، بافت و یا زمان خاص، الگوهای اختصاصی بیان ژن در هر مرحله را تعیین می­کند و تعیین وظایف ژن­ها را تسهیل می‌کند
 .(Weiberg & Karlovsky, 2009) ترنسکریپتومیکس در یک بافت، زمان و یا شرایط خاص، عنصری کلیدی در ژنومیکس کارکردی است که درک ما را از نحوه کارکرد ژن‌ها افزایش می­دهد.(Weiberg & Karlovsky, 2009)  بنابراین مطالعه تنظیم بیان ژن‌ها، شناخت کارکرد آنها و مکانیسم­های مولکولی تنظیمی سامانه­های زیستی را بهبود می­دهد.

QPCR برای مطالعه خصوصیت­های متنوع ژنتیکی اختصاصی موثر در تنظیم بیان ژن‌ در اکثر جانداران استفاده شده است .(Amini et al., 2017) این مطالعات دیدگاه عمیق و منطقی در زمینه اساس ژنتیکی تنوع طبیعی در سطح mRNA ایجاد کرده و نقش بیان ژن‌ها در ایجاد تنوع فنوتیپی را بررسی کرده است. همچون متابولیت‌های اولیه، متابولیت‌های حد واسط نیز در سازگاری در پاسخ به تغییرات محیطی موثرند .(Kliebenstein & Osbourn, 2012, Moore et al., 2014) به‌نظر می‌رسد کاداوارین، متابولیتی است که در پاسخ به تنش محتوی آن افزایش می‌یابد  .(Alcazar & Tiburcio, 2018)تنظیم بیان ژن‌ها نقش کلیدی در سنتز متابولیت­ها دارد و در ادامه حیات موجودات تحت تنش­های محیطی نقش موثری ایفا می­کند. این ارتباط بدون ایجاد ناهماهنگی در تنظیم بیان ژن‌هایی که در سنتز متابولیت‌های اختصاصی نقش دارند، انعطاف مناسبی در گیاهان برای سازش به تغییرات محیطی فراهم می­کند. پژوهش­ها در زمینه بیان ژن‌ها نقش تنظیم بیان ژن‌ها را در ایجاد تنوع بین ژنوتیپ‌های حساس و متحمل و بهبود تحمل سرما از طریق ایجاد تنوع در متابولیت‌های اختصاصی را نشان داده­اند ((Karami Moalem et al., 2018.

هدف این پژوهش بررسی پاسخ­های متابولیکی و مولکولی سازگاری به تنش سرما در دو ژنوتیپ‌ حساس (ILC533) و متحمل (Sel96th11439) نخود کابلی (C. arietinum L.) است. در این راستا تغییرات محتوی کاداوارین توسط فعالیت عوامل موثر در این مسیر متابولیک یعنی بیان ژن DAO و فعالیت آنزیم DAO به­عنوان بخشی از فعالیت دفاعی چندگانه سلول در برابر تنش سرما به­منظور بهبود محتوی این متابولیت سلولی در جهت بهبود پاسخ‌های متمایز زودهنگام و دیرهنگام ژنوتیپ‌های حساس و متحمل نخود به تنش سرما همراه با H₂O₂ به­عنوان شاخص آسیب‌ سلولی بررسی خواهد شد. شناسایی نحوه تنظیم القایی برخی مسیرهای متابولیسمی پاسخ به تنش از جمله کاداوارین که بیانگر نتایج احتمالی این پژوهش است، امکان دارد تغییرات محتوی این مولکول و مسیرهای تنظیمی آن را به­عنوان نشانگرهای آگاهی­بخش متابولیکی به­منظور شناسایی ژنوتیپ­های متحمل به سرمای نخود پیشنهاد و همچنین منجر به بکارگیری آنها در راستای هدف به­نژادی صفت تحمل تنش سرما از طریق بهبود تحمل و یا افزایش بقا گیاه در راستای اهداف برنامه‌های کشاورزی پایدار شود. همچنین بررسی ارتباط احتمالی بین منابع ایجاد آسیب تنش و عوامل دفاعی سلول به درک بهتر نحوه بهبود تحمل به تنش سرما در نخود زراعی منجر خواهد شد.

2. روش­شناسی پژوهش

در این پژوهش از بذر دو ژنوتیپ نخود کابلی (C. arietinum L.) متحمل به سرما) (Sel96th11439) با منشا ایکاردا و حاصل از تلاقی ژنوتیپ‌های (ILC482×ILWC182) و حساس به سرما (ILC533) منشا گرفته از ارقام بومی مصر استفاده شد. بذور از بانک ژن گروه زراعت و اصلاح نباتات دانشکدگان کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه تهران (کرج) تهیه ‌شدند
al., 2011; Saeed et al., 2011) .(Heidarvand et بذور با هیپوکلریت سدیم 10 درصد به­مدت 10 دقیقه ضدعفونی شده و پس از شستشو با آب مقطر روی کاغذ صافی در پتری‌دیش با رطوبت لازم قرار گرفتند. پتری‌دیش‌ها در شرایط بدون نور و دمای بیست و سه درجه سانتی‌گراد به­مدت سه شبانه‌روز قرار گرفتند و پس از جوانه‌زنی، گیاهچه‌ها به گلدان‌های سایز 12 (با قطر دهانه دوازده سانتی‌متر و ارتفاع ده سانتی­متر حاوی رس، ماسه و کود دامی به نسبت سه به یک به 25/0 حجمی) انتقال یافتند. گلدان‌ها در اتاقک‌ رشد آزمایشگاه گروه زراعت و اصلاح نباتات دانشگاه تهران در سال 1396 با نور دویست میکرومول بر متر مربع بر ثانیه (حدود 10000 لوکس) و شرایط نوری 16 ساعت روز و هشت ساعت شب و دمای بیست و سه درجه سانتی‌گراد و رطوبت نسبی هفتاد و پنج درصد قرار داده شدند. جهت بررسی پاسخ‌های گیاهی به تنش سرما، در روز بیست و یکم گیاهچه‌ها (با ارتفاع حدود بیست سانتی‌متر و دارای حداقل پنج شاخه به طول پنج تا هشت سانتی­متر) به اتاقک رشد (آروین تجهیز، اسپادانا، ایران) با دمای ˚C4 به­عنوان دمای ^[5]LT₅₀ نخود (et al., 2005; Kazemi-Shahandashti et al., 2013 (Nayyar منتقل شدند و نمونه‌گیری از برگ‌­های میانی هر گیاهچه به­عنوان برگ‌های فعال از دیدگاه فیزیولوژیکی در روز اول پس از شروع تنش سرما (جهت بررسی پاسخ‌های زودهنگام) و روز ششم پس از شروع تنش (جهت بررسی پاسخ‌های دیرهنگام گیاه) انجام شد .(Rakei et al., 2016)

نمونه‌گیری از گیاهچه‌ها در اتاقک رشد با دمای بیست و سه درجه سانتی‌گراد نیز به­عنوان گیاهان شاهد انجام گرفت (سن فیزیولوژیک تمام گیاهان یکسان درنظر گرفته شدHurry & Huner, 1991; Kazemi-Shahandashti et al., 2014) ). بنابراین در این پژوهش اثر سه نوع تیمار دمایی (شامل گیاهچه‌ها در دمای 23 درجه سانتی­گراد، گیاهچه‌ها یک روز و شش روز پس از شروع تنش سرما) در دو ژنوتیپ متحمل و حساس به­صورت آزمایش فاکتوریل در قالب طرح کاملا تصادفی و با سه تکرار بررسی شد.

مقدار 350 میلی‏گرم نمونه تازه برگی با نیتروژن مایع در هاون چینی به پودر تبدیل شد. پودر تهیه­شده به فالکون 15 میلی‌لیتری انتقال یافت و سپس 5 میلی‌لیتر محلول تری‌کلرواستیک­اسید یک درصد (محلول در حمام یخ) به تیوب اضافه شد و تیوب‎‌‌ها تا یکنواخت‌شدن نمونه‌ها در حمام یخ قرار داده ‌شد. تیوب حاوی نمونه یکنواخت­شده به­مدت 15 دقیقه و در دمای˚C 4 با سرعت
 × g 12000 سانتریفیوژ شد. سپس500 میکرو‌لیتر از مایع رویی به یک تیوب جدید حاوی یک میلی‌لیتر محلول یک مولار یدید پتاسیم و 5/0 میلی‌لیتر بافر فسفات 10 میلی‌مولار افزوده شد و پس از چندبار وارونه­کردن تیوب در محیط تاریک برای یکنواخت­کردن محتوی آن، مقدار جذب هر نمونه در طول موجnm 390 توسط دستگاه اسپکتروفوتومتر
 (Shimadzu UV-160, Kyoto, Japan) اندازه‌گیری شد .(Loreto & Velikova, 2001) نتایج به­صورت میکرومول در هر گرم وزن تر گیاه بیان شد.

سنجش کمی Cad به­روش(1987)   Walter & Geunانجام شد. 250 میلی‌گرم از بافت گیاهی در دو میلی‌لیتر محلول پرکلریک­اسید (^[6]PCA) چهار درصد حاوی 1و 7 دی‌آمینوهپتان) ^[7]پنج میلی‌گرم در لیتر از اسیدکلریدریک دو نرمال( هموژنیزه شد. پس از یک ساعت قرارگیری درC ˚4، از فیلتر) پالایشگر( 45 درصد میکرونی عبور داده شد. روی 2/0 میلی­لیتر از این محلول، یک میلی‌لیتر بافر کربنات با 9 pH و یک میلی‌لیتر محلول دانسیل‌کلراید) ^[8]10میلی‌‌گرم در یک میلی‌لیتر استون( اضافه و مخلوط شد. پس از اضافه­کردن 50 میکرولیتر محلول پرولین (100 میلی‌گرم در لیتر) دانسیل­کلراید اضافی حذف شد و سپس 400 میکرولیتر تولوئن به آن اضافه و به­مدت 30 ثانیه ورتکس شد و پس از سانتریفوژ × g 500 به­مدت دو دقیقه فاز آلی (رویی) برداشته و این محلول برای ارزیابی Cad توسط HPLC استفاده ‌شد. به­منظور ارزیابی کمی Cad 10 میکرولیتر از محلول پایانی به ستون
 Chrompack-Nederland در دستگاه HPLC مدل Unickam-crystal 200 تزریق شد. دتکتور این دستگاه از نوع UV است که در طول موج 337 نانومتر تنظیم شد. از نمونه‌های استاندارد برای تعیین وجود Cad و غلظت­سنجی آن استفاده ‌شد.

بر اساس روش López-Gómez et al. (2014)، پس از پودر­کردن 4/0 گرم بافت برگی در 2/1 میلی‌لیتر بافر استخراج (بافر سدیم­فسفات 100 میلی‌مولار با 5/6pH ) نمونه‌ها سانتریفوژ (C˚4،min  20،× g  10000( و مایع رویی برداشته شد. واکنش سنجش فعالیت آنزیم‌ DAO حاوی 630 میکرولیتر بافر سدیم­فسفات 100 میلی‌مولار با 5/6pH ، 70 میکرولیتر محلول واکنش
) 25/6 میکرولیتر ان‌ان­دی‌متیل‌آنیلن^[9]، 5/2 میلی‌گرم 4-آمینوآنتی‌پرین^[10]، 25 میلی‌لیتر بافر سدیم­فسفات 100 میلی‌مولار با
 5/6 pH)، 100 میکرولیتر پراکسیداز (42/1 میلی‌گرم در هر میلی‌لیتر بافر سدیم­فسفات 100 میلی‌مولار با 5/6pH )، 100 میکرولیتر نمونه برگی و 100 میکرولیتر cad (2/3 میلی‌گرم در هر میلی‌لیتر بافر سدیم­فسفات 100 میلی‌مولار با 5/6pH ) بود. میزان فعالیت این آنزیم‌ در طول موج‌ 550 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه‌گیری شد.

1-3. استخراج RNA، سنتز cDNA و واکنشQuantitative Reverse-Transcriptase PCR  (QRT-PCR)

استخراجRNA  کل سلول به­روش ترایزول با 80 میلی‌گرم نمونه‌های بافت برگی خردشده به­کمک ازت مایع در هاون چینی استریل انجام گرفت. کیفیت RNA استخراج­شده توسط الکتروفورز روی ژل آگارز یک درصد تعیین شد (شکل 2). تشکیل دو باندRNA  ریبوزومی S18و S25 روی ژل کیفیت بالای RNA تخلیص­شده را تایید کرد. برای بررسی کمی میزان غلظت RNA از دستگاه نانودراپ (Thermo Scientific model 1000) در طول موج nm 260 استفاده شد. در مرحله بعد RNA استخراج­شده با آنزیم DNaseІ براساس روش پیشنهادی شرکت فرمنتاز تیمار شد. دو میکروگرم RNA، یک میکرولیتر بافر، یک واحد (u) آنزیم DNaseІ و 10 واحد (u) آنزیمRNase inhibitor ، مخلوط و با افزودن آبDEPC  حجم محلول به 10 میکرولیتر رسانده شد و به­مدت 30 دقیقه در دمای˚C 37 قرار گرفتند. سپس یک میکرولیتر EDTA به تیوب‌ها اضافه ‌شد و به­مدت 10 دقیقه در دمای
˚C 65 قرار داده ‌شدند. تیوب‌ها در˚C 80- نگه‌داری شدند. به­منظور ساخت cDNA، پنج میکرولیتر RNA تیمار­شده با DNaseI با کمک آغازگر الیگو­دی­تی (یک پیکومول) (20-18 نوکلئوتید) مخلوط شد و حجم محلول با استفاده از آب DEPC به 11 میکرولیتر رسانده شد. این مخلوط به­مدت پنج دقیقه در دمای˚C 70 قرار گرفت و پس از آن روی یخ سرد شد. سپس چهار میکرولیتر بافر واکنش و دو میکرولیتر دی‌اکسی­نوکلئوتری­فسفات (dNTPs) با غلظت 10 میکرومول و 20 واحد آنزیم  RNase inhibitorبه هر تیوب اضافه شد و حجم محلول با آب DEPC به 19 میکرولیتر رسانده شد و به­مدت پنج دقیقه در دمای˚C37 قرار داده شد. بعد از آن 200 واحد (u) آنزیم Revert Aid M-Mulv به این محلول افزوده شده و پس از مخلوط­کردن به­مدت یک ساعت در دمای˚C 42 قرار داده‌شد. سپس برای غیر فعال­کردن واکنش، تیوب‌ها به­مدت 10 دقیقه در دمای˚C 70 قرار گرفتند. به‌منظور تایید سنتز cDNA از روش تکثیر ژن خانه‌دار اکتین1 (Actin1) استفاده شد، به­طوری­که پس از رقیق‌سازی و رساندن غلظت cDNA سنتز­شده به 200 نانوگرم در میکرولیتر واکنش  PCRو الکتروفورز قطعه تکثیر­شده روی ژل آگارز یک درصد انجام شد
(Peng et al., 2010) . نتایج حاکی از مطابقت اندازه باند مشاهده­شده با اندازه ژن خانه‌دار  bp)189) بود. مقدار 20 میکرولیتر مخلوط واکنش شامل 10 میکرولیتر کیت حاوی رنگ فلورسنت Evagreen، سه میکرولیتر آب مقطر استریل، یک میکرولیتر از هر یک از آغازگرهای اختصاصی مستقیم و معکوس با غلظت 10 میکرومول و پنج میکرولیتر نمونه cDNAسنتزشده با غلظت 200 نانوگرم در میکرولیتر (رقیق­شده با نسبت 1:20) بررسی شد. پس از آماده­کردن مخلوط واکنش، پلیت موردنظر به دستگاه iQ5 منتقل شد و واکنش زنجیره‌ای پلیمراز به این صورت انجام گرفت: دو دقیقه در دمای ˚C94 و 35 تکرار با چرخه‌های 10 ثانیه در دمای˚C 95، 10 ثانیه در دمای˚C 57 Tm آغازگر و 10 ثانیه در دمای ˚C72. تایید اختصاصی­بودن قطعات تکثیرشده با­استفاده­از تجزیه و تحلیل منحنی ذوب انجام شد. منحنی ذوب با خنک­شدن تا دمای ˚C55 با سرعت˚C 20 در ثانیه ثبت شد، سپس در دمای ˚C 55 به­مدت 30 ثانیه ثابت ماند و سپس با گرمایش آهسته با سرعت˚C 5/0 در ثانیه تا دمای ˚C95 افزایش یافت. فلورسانس به­طور مداوم در طول دوره افزایش آهسته دما برای نظارت بر تفکیک رنگ Evagreen اندازه­گیری شد.

ترسیم سیگنال­های فلورسانس به­طور خودکار در زمان واقعی و در مقابل دما برای ایجاد منحنی­های ذوب انجام گرفت. بر اساس منحنی­های استاندارد رسم­شده حاصل از پنج سریال رقت (1، 1:10، 1:20، 1:50 و 1:100) کارایی PCR در تمام آغازگرها در حدود 9/1 تا 2 بود و شیب خط رگرسیون بین 23/3- و 42/3- بود Pfaffl, 2001)). نسبت بیان نسبی هر توالی با­توجه­به شاخص Cq محاسبه­شده که میانگین کارآیی PCR ژن­های خانه­دار مورد نظر در Plate را در بر می­گیرد. با­توجه­به نتایج منحنی­های استاندارد، از نرم­افزار REST می­توان برای محاسبه نسبت بین میزان ژن هدف و ژن خانه‌دار (Actin1) در هر نمونه مشخص با روش^-ΔΔCT 2 به­عنوان بیان نسبی آن ژن استفاده کرد .(Livak & Schmittgen, 2001) در این روش بیان ژن مورد نظر با بیان Actin1 که یک ژن خانه‌دار تنظیم شده است نرمال شده و سپس از مقادیر نرمال­شده برای مقایسه بیان متفاوت ژن­ها در نمونه­های مختلف استفاده شد. طراحی آغازگر برای ژن اختصاصی DAO و ژن خانه‌دار  Actin1با­استفاده­از تارنمای
 Integrated DNA Technologies, Inc. (IDT)به آدرس  (https://www.idtdna.com)برای دست­یابی به آغازگرهای دارای خصوصیات مناسب انجام گرفت. در جدول 1 نام آغازگرهای ژن‌های اختصاصی و خانه­دار، توالی و شماره دسترسی آنها ارائه شده است.

شکل 2. نگاره نوارهای RNA استخراج­شده. از چپ به راست به­ترتیب: 1) نشانگر اندازه با نوارهای مشخص­شده ، 2 و 3) ژنوتیپ متحمل و حساس شاهد، 4 و 5) ژنوتیپ متحمل و حساس روز اول تنش سرما.

جدول 1. توالی‌های آغازگر استفاده­شده در واکنش زنجیره‌ای پلیمراز در زمان واقعی.(QPCR)

3. یافته­های پژوهش و بحث

تفاوت معنی‌داری بین تیمارهای آزمایشی از نظر میزان H₂O₂، کاداوارین، فعالیت آنزیم‌‌ DAO و بیان ژن‌ DAO (01/0P<) وجود داشت (جدول 2). میزان تجمع H₂O₂ که از مهمترین شاخص‌های تنش اکسیداتیو در سلول می‌باشد
 (Kazemi Shahandashti & Maali Amiri, 2018)، تحت تنش سرما در ژنوتیپ حساس در مقایسه با ژنوتیپ متحمل بیشتر بود (حداکثر بیش از 69% در روز ششم تنش). در ژنوتیپ متحمل میزان H₂O₂ پس از افزایش معنی‌دار در روز اول تنش، در روز ششم کاهش یافته، به­طوری‌که تجمع آن در مقایسه با شرایط شاهد به­طور معنی­داری کمتر شد (بیش از 7/4%)، در­حالی­که تجمع آن در ژنوتیپ حساس در مقایسه با شرایط شاهد به­طور پیوسته افزایش یافت (تا 50%) (شکل 3-الف). بنابراین درجه تحمل به تنش سرما در دو ژنوتیپ نخود با یکدیگر متفاوت بوده؛ به­طوری­که این نتایج بیانگر ارتباط احتمالی تاثیر پاسخ‌های دفاعی ژنوتیپ‌های نخود می‌باشد. همچنین حداقل میزان H₂O₂ در روز ششم تنش سرما در گیاهان متحمل مشاهده شده (شکل 3-الف) که بیانگر فرآیند سرما سازگاری نسبی است. چنین فرآیندهایی احتمالا از برنامه‌ریزی مجدد ژنوم و هموستازی متابولیکی منشا می‌گیرد (Heidarvand & Maali Amiri, 2010). بنابراین سنجش شاخص H₂O₂ می‌تواند به­عنوان یک نشانگر تحمل سرما در نخود به­کار رود.

در گیاهان بخشی از سازگاری‌ به تنش در اثر تنظیم میزان کاداوارین از طریق مسیر بیوسنتزی آن و یا فعالیت مسیر تخریب کاداوارین ایجاد می‌شود (Su & Bai, 2008). نتایج نشان داد که در شرایط شاهد میزان متابولیت‌ها و فعالیت آنزیم‌ اندازه­گیری­شده در ژنوتیپ متحمل بیشتر از ژنوتیپ حساس بود (شکل 3-ب و ج). تحت تنش سرما میزان کاداوارین، فعالیت آنزیم‌ DAO و بیان ژن‌ DAO در هر دو ژنوتیپ افزایش یافت؛ به­طوری‌که این افزایش در ژنوتیپ متحمل در مقایسه با ژنوتیپ حساس معنی‌دار بود، چنین نتایجی بیانگر پاسخ­های ژنتیکی مطلوب ژنوتیپ متحمل در جهت حفظ محتوی کاداوارین برای مقابله با آثار مخرب ROS سلولی است (شکل 3-الف-د).

جدول 2. تجزیه واریانس صفات مورد مطالعه در دو ژنوتیپ حساس و متحمل به سرما نخود زراعی در سطوح مختلف تنش سرما.

نتایج نشان داد که محتوی Cad تنها در ژنوتیپ متحمل در روز ششم پس از تنش سرما به­میزان 18 نانومول بر گرم در وزن تر بود و این متابولیت در بقیه تیمارهای سرمایی و همچنین شرایط شاهد در هر دو ژنوتیپ وجود نداشت (شکل 3-ب). در امتداد با داده­های پیشین در گیاهان زراعی، این نتایج به نقش القایی این متابولیت تحت تنش اشاره دارد (Kuznetsov et al., 2007; Sziderics et al., 2010; Simon-Sarkadi, 2014).

شکل 3. تغییر میزان H₂O₂ (الف)، کاداوارین (ب)، فعالیت آنزیم دی‌آمین‌اکسیداز (DAO) (ج) و بیان ژن دی‌آمین‌اکسیداز (DAO) (د) در ژنوتیپ‌های متحمل Sel96Th11439 (ستون سیاه) و حساس ILC533 (ستون خاکستری) به سرمای نخود تحت تیمارهای دمایی شامل دمای طبیعی (23°C)، روز اول و روز ششم تنش سرما (°C4). حروف متفاوت نشان­دهنده اختلاف معنی­دار بین میانگین­ها براساس مقایسه میانگین دانکن.

یافته­ها نشان داده که اسپری­پاشی کاداوارین (یک میلی­مولار) روی برگ و بذور گیاهان آثار نامطلوب تنش شوری و فلزات سنگین را از طریق افزایش رنگیزه­های فتوسنتزی، فعالیت نیترات­ردوکتاز، نیتروژن آلی، پروتئین محلول، رشد گیاهچه و حذف آثار نامطلوب رادیکال­های آزاد اکسیژن افزایش داده است (Aziz et al., 1997; 1999; Cavusoglu et al., 2007;
Sziderics et al., 2010; Tomar et al., 2013a; Tomar et al., 2013b). براساس همخوانی نتایج این پژوهش با داده­های گذشته به­نظر می‌رسد در نخود زراعی ارتباط معنی‌داری بین ظهور کاداوارین و محتوی کاهش­یافته شاخص­های خسارت سرما (از جمله نتایج H₂O₂) وجود داشته که بیانگر تاثیر آن در بهبود پایداری غشای سلولی تحت تنش سرما می­باشد نتایجی که نیاز به پژوهش­های عمیق­تری در این زمینه دارد (Kim et al., 2002). افزایش نسبی میزان H₂O₂ در پاسخ‌های زودهنگام در ژنوتیپ متحمل و کاهش معنی‌دار آن در روز ششم تنش سرما (شکل 3-الف) از یک طرف بیانگر نقش پیام‌رسانی H₂O₂ در القا پاسخ‌های دفاعی سلول‌های گیاهی و از طرف دیگر در امتداد با افزایش میزان کاداوارین، ارتباط معنی­دار آنها را نشان می­دهد.

عدم وجود Cad در پاسخ‌های زودهنگام و دیرهنگام ژنوتیپ حساس و پاسخ‌های زودهنگام ژنوتیپ متحمل احتمالا می‌تواند به­دلیل ضعف سامانه‌های دفاعی در ژنوتیپ حساس و یا افزایش محتوی سایر متابولیت‌های سازگارساز موثر در بهبود تحمل سرما در ژنوتیپ متحمل باشد (Rakei et al., 2016). اگرچه نتایج هیچ همبستگی معنی‌دار مستقیمی بین محتوی Cad با شاخص‌های خسارت سلولی نشان نداد، اما وجود رابطه منفی بین آنها بیانگر نقش حفاظتی این پلی‌آمین در بهبود تحمل به تنش سرما در گیاه نخود بوده که با نتایج تحقیقات پیشین در خصوص اتصال کاداوارین به رادیکال­های آزاد اکسیژن و خنثی سازی آثار مضر آنها بر اجزای مختلف سلول و تعدیل آثار تنش مطابقت دارد (Cavusoglu et al., 2007; Tomar et al., 2013b).

بر خلاف الگوی تغییر Cad تحت تنش سرما، فعالیت آنزیم  DAOکه آنزیمی است که در تجزیه کاداوارین موثر است، در ژنوتیپ متحمل و حساس در مقایسه با شاهد به­طور تدریجی افزایش یافت (حداکثر تا بیش از سه برابر) و در روز ششم تنش سرما در ژنوتیپ متحمل به بالاترین میزان رسید (شکل 3-ج). این نتایج بیانگر نقش این آنزیم در تجزیه سایر پلی­آمین­ها از جمله پوتریسین است (Amini et al., 2021). مشابه­با نتایج این آزمایش، در بذر برنج نیز تحت تنش سرما فعالیت آنزیم DAO روند افزایشی نشان داد Sheteiwy et al., 2017)). اگرچه در ژنوتیپ حساس نیز فعالیت DAO تحت تنش سرما در مقایسه با شاهد روند افزایشی داشت (حداکثر تا 5/2 برابر)، اما این روند صعودی در ژنوتیپ حساس در مقایسه با ژنوتیپ متحمل نرخ کندتری داشت (شکل 3-ج) که بیانگر فعالیت کمتر این آنزیم در ژنوتیپ حساس به­دلیل عدم بیوسنتز دی­آمین کاداوارین (شکل 3-ب) و همچنین بیوسنتز کمتر سایر دی­آمین­ها از جمله پوتریسین (Amini et al., 2021) و در نتیجه نیاز کمتر به فعالیت این آنزیم است.

بر اساس نتایج، الگوی تغییر میزان H₂O₂ (شاخص خسارت) به­عنوان محصول جانبی فعالیت آنزیم DAO ( شاخص دفاع) در شرایط شاهد و تحت تنش سرما متفاوت با الگوی فعالیت DAO بوده که احتمالا به­دلیل کارایی مطلوب فعالیت سامانه آنتی‌اکسیدانی ژنوتیپ متحمل در جهت حذف ROS  می­باشد (Heidarvand & Maali-Amiri, 2013). پژوهش
 ((Duan et al., 2008 نشان داد که تحت تنش شوری همزمان با افزایش میزان پلی­آمین­ها، فعالیت آنزیم‌ DAO نیز افزایش یافته و میزان تجمع پلی‌آمین­ها با فعالیت آنزیم‌ DAO در ارتباط است. بنابراین به‌نظر می‌رسد که فعالیت‌ DAO تحت تنش سرما وابسته­به غلظت کاداوارین و پوتریسین بوده که در هر دو ژنوتیپ، به­منظور پاسخ آسیب‌های سلولی (نتایج H₂O₂) می­شود،‌ اگرچه در ژنوتیپ متحمل به­دلیل تجمع بیشتر کاداوارین با فعالیت شدیدتر آنزیم‌ DAO کاهش H₂O₂ شدیدتر خواهد بود. پژوهش‌ها نشان داده که در گوجه‌فرنگی سازگار شده به سرما فعالیت DAO در رقم متحمل بطور چشمگیری در مقایسه با حساس افزایش یافت (Song et al., 2015). بنابراین افزایش معنی‌دار فعالیت آنزیم‌ تجزیه‌‌کننده دی­آمین­های کاداوارین و پوتریسین از طریق کاراتر­کردن مسیرهای متابولیکی پاسخ به سرما می‌تواند در بهبود تحمل گیاه به تنش‌های غیر زیستی از جمله سرما ایفای نقش کند (Shelp et al., 2012a). تحت تنش‌های محیطی کاتابولیسم دی­آمین­ها علاوه­بر ایفای نقش در سازوکار‌های دفاعی، در بسیاری از فرآیندهای رشد و نموی و پیام‌رسانی سلولی نیز مشارکت دارد (Tavladoraki et al., 2012). همچنین اگرچه مسیر بیوسنتز PAs نقش مهمی در تنظیم میزان این متابولیت‌ها دارد، مسیر تجزیه آنها نیز از یک سو به­دلیل ارتباط با مسیرهای متابولیسمی مختلف از جمله برخی آلکالوئیدها و از سوی دیگر تولید مولکول‌های پیام‌رسان از جمله  H₂O₂در هموستازی آنها موثر خواهد بود (Moschou et al., 2012). بنابراین نتایج این پژوهش، الگوی متمایز فعالیت آنزیم‌ DAO در پاسخ‌های زودهنگام و دیرهنگام به سرما و همچنین ژنوتیپ‌های حساس و متحمل نخود زراعی را نشان داده، به­طوری‌‌که مطالعه فعالیت این آنزیم‌ به‌عنوان عامل موثر در مسیر تجزیه دی­مین کاداواین در شرایط آزمایش تاییدکننده تمایز آشکاری در تجمع این متابولیت‌ به‌عنوان یکی از شاخص­های‌ تحمل به سرما در برابر عوامل آسیب­های سلولی (نتایج H₂O₂)‌ در نخود در نظر گرفته می­شود

ژن DAO (CuAO) رمز کننده آنزیم DAO بوده و نقش مهمی در تنظیم شبکه متابولیک پاسخ به تنش‌های محیطی دارد (Wimalasekera et al., 2011b). به­منظور دستیابی به فرایند مولکولی چگونگی تغییر فعالیت این آنزیم در پاسخ به تنش سرما، بیان نسبی ژن‌ DAO بررسی شد. نتایج نشان داد که میزان بیان نسبی توالی رمزکننده آنزیم DAO در هر دو ژنوتیپ حساس و متحمل تحت تنش سرما در مقایسه با شاهد به طور پیوسته افزایش یافت (تقریبا حداکثر تا بیش از 3/3 برابر) (شکل 3-د) که حاکی از موثرتر بودن این مسیر در ژنوتیپ متحمل در مقایسه با ژنوتیپ حساس در جهت القا تحمل به سرما بود. در روز اول و همچنین روز ششم تنش سرما میزان بیان این ژن در ژنوتیپ متحمل به­طور معنی‌داری بیشتر از ژنوتیپ حساس بود (حداکثر تا بیش از 7/1 برابر در روز ششم پس از تنش سرما) (شکل 3-د). بیان این ژن در ژنوتیپ متحمل در روز اول و ششم تنش سرما در مقایسه با شاهد به­ترتیب بیش از 2/2 و 5/3 برابر افزایش یافت (شکل 3-د). این نتایج بیانگر القا موثرتر فعالیت ژنوم در سطح رونویسی به‌منظور آماده­سازى گیاه براى رویارویى با دماهاى پایین­تر به­موازات بروز کمترین خسارت می­باشد، مشاهداتی که توسط نتایج شاخص‌ آسیب سلولی نیز تایید شد. افزایش میزان رونوشت­ها به موازات افزایش فعالیت آنزیم DAO اشاره به تنظیم این مسیر بیوشیمیایی هم در سطح رونویسی و هم ترجمه دارد که بایستی با جزئیات بیشتر بررسی شود. این یافته‌ها با نتایج
 (Tanou et al. (2014 که گزارش کردند که تحت تنش شوری بیان نسبی ژن‌های مسیر تجزیه PAs در نارنج
 (Citrus aurantium L.) افزایش یافته، هماهنگ بود. همچنین موتاسیون در ژن CuAo سبب حساسیت آرابیدوپسیس به تنش اسمزی شد (Wimalasekera et al., 2011b). بنابراین با­توجه­به نتایج به­دست­آمده، القای بیان این ژن در گیاهان متحمل در اثر برنامه­ریزی مجدد بیان ژن­ها و هوموستازی سلولی نقش موثری در ایجاد الگوی پاسخ‌های سازگاری به تنش سرما ایفا می‌کند.

4. نتیجه­گیری

ارتباط شاخص آسیب سلولی (H₂O₂) و میزان متابولیت‌ دی­آمین کاداوارین در این آزمایش ناهمسو بود، به­طوری­که تجمع این متابولیت‌ در ژنوتیپ متحمل به موازات فعالیت آنزیم‌ DAO و بیان ژن DAO با کاهش آسیب سلولی در ارتباط بود. به­منظور بهبود تحمل تنش سرما در نخود، محتوای کاداوارین توسط تنظیم دقیق فعالیت عوامل مختلف موثر در تنظیم این متابولیت، افزایش می­یابد. پاسخ‌های متمایز زودهنگام و دیرهنگام ژنوتیپ‌ها به تنش سرما بیانگر راهبرد چندگانه دفاعی سلولی نخود به تنش سرما است. این یافته که گیاه نخود دارای تجمع بیشتر کاداوارین به‌عنوان اسموپروتکتنت سلولی با کاهش میزان آسیب‌های سلولی تحمل بیشتری به تنش سرما دارد، ممکن است به قابلیت این گیاه برای بقا و یا بهبود آن طی تنش سرما بیانجامد و کاربرد جدیدی برای اسپری‌پاشی کاداوارین در برنامه‌های کشاورزی پایدار پیشنهاد کند. با انجام مطالعات تکمیلی در ژنوتیپ­های نخود به­نظر می­رسد کاربرد کاداوارین در جهت بهبود تحمل به تنش سرما در برنامه‌های کشاورزی پایدار نخود استفاده شود. به­نظر می‌رسد این فرایندها غالباً همراه­با القای سامانه­های دفاعی خواهد بود. با­توجه­به چالش­های زیست­محیطی، ضروری است آثار کاربرد اسپری‌پاشی کاداوارین، بر عملکرد و کیفیت نخود به­طور جامع مطالعه شود.

5. منابع

Alcázar, R., Altabella, T., Marco, F., Bortolotti, C., Reymond, M., Koncz, C., & Tiburcio, A.F. (2010a). Polyamines: Molecules with regulatory functions in plant abiotic stress tolerance. Planta, 231(6), 1237-1249.

Alcázar, R., & Tiburcio, A.F. (Eds.). (2018). Polyamines: Methods and Protocols. Humana Press.

Amini, S., Maali-Amiri, R., Kazemi-Shahandashti, S.S., Lopez-Gomez, M., Sadeghzadeh, B., Sobhani-Najafabadi, A., & Kariman, K. (2021). Effect of cold stress on polyamine metabolism and antioxidant responses in chickpea. Journal of Plant Physiology, 258, 153387.

Angelini, R., Cona, A., Federico, R., Fincato, P., Tavladoraki, P., & Tisi, A. (2010). Plant amine oxidases “on the move”: An update. Plant Physiology and Biochemistry, 48(7), 560-564.

Aziz, A., Martin-Tanguy, J., & Larher, F. (1997). Plasticity of polyamine metabolism associated with high osmotic stress in rape leaf discs and with ethylene treatment. Plant Growth Regulation, 21, 153-163.

Aziz, A., Martin-Tanguy, J., & Larher, F. (1999). Salt stress-induced proline accumulation and changes in tyramine and polyamine levels are linked to ionic adjustment in tomato leaf discs. Plant Science, 145(2), 83-91.

Carrizo, C.N., Pitta-Alvarez, S.I., Kogan, M.J., Giulietti, A.M., & Tomaro, M.L. (2001). Occurrence of cadaverine in hairy roots of Brugmansia candida. Phytochemistry, 57(5), 759-763.

Cassan, F., Maiale, S., Masciarelli, O., Vidal, A., Luna, V., & Ruiz, O. (2009). Cadaverine production by Azospirillum brasilense and its possible role in plant growth promotion and osmotic stress mitigation. European Journal of Soil Biology, 45(1), 12-19.

Çavuşoğlu, K., Kılıç, S., & Kabar, K. (2007). Some morphological and anatomical observations during alleviation of salinity (NaCI) stress on seed germination and seedling growth of barley by polyamines. Acta Physiologiae Plantarum, 29, 551-557.

Cona, A., Rea, G., Angelini, R., Federico, R., & Tavladoraki, P. (2006). Functions of amine oxidases in plant development and defence. Trends in Plant Science, 11, 80-88.

Dickinson, D.A., & Forman, H.J. (2002). Cellular glutathione and thiols metabolism. Biochemical Pharmacology, 64(5-6), 1019-1026.

Duan, J., Li, J., Guo, S., & Kang, Y. (2008). Exogenous spermidine affects polyamine metabolism in salinity-stressed Cucumis sativus roots and enhances short-term salinity tolerance. Journal of Plant Physiology, 165, 1620–1635.

Garcia-Garcia, P., Brenes-Balbuena, M., Hornero-Méndez, D., Garcia-Borrego, A., & Garrido-Fernández, A. (2000). Content of biogenic amines in table olives. Journal of Food Protection, 63(1), 111-116.

Groppa, M.D., & Benavides, M.P. (2008). Polyamines and abiotic stress: Recent advances. Amino Acids, 34, 35-45.

Heidarvand, L., & Amiri, R.M. (2010). What happens in plant molecular responses to cold stress? Acta Physiologia Plantarum, 32(3), 419-431.

Heidarvand, L., & Maali-Amiri, R. (2013). Physio-biochemical and proteome analysis of chickpea in early phases of cold stress. Journal of Plant Physiology, 170(5), 459-469.

Hung, H.Y., Shannon, L.M., Tian, F., Bradbury, P.J., Chen, C., Flint-Garcia, S.A., & Holland, J.B. (2012). ZmCCT and the genetic basis of day-length adaptation underlying the post domestication spread of maize. Proceedings of the National Academy of Sciences, 109(28), E1913-E1921.

Hurry, V.M., & Huner, N.P. (1991). Low growth temperature effects a differential inhibition of photosynthesis in spring and winter wheat. Plant Physiology, 96(2), 491-497.

Janmohammadi, M., Abbasi, A., & Sabaghnia, N. (2012). Influence of NaCl treatments on growth and biochemical parameters of castor bean (Ricinus communis L.). Acta Agriculturae Slovenica, 99(1), 31.

Kapoor, R.T. (2023). Role of polyamines in plants under abiotic stresses: Regulation of biochemical interactions. Plant Stress Mitigators, 209-220.

Karami-Moalem, S., Maali-Amiri, R., & Kazemi-Shahandashti, S.S. (2018). Effect of cold stress on oxidative damage and mitochondrial respiratory properties in chickpea. Plant Physiology and Biochemistry, 122, 31-39.

Kazemi Shahandashti, S.S., Maali Amiri, R., Zeinali, H., & Ramezanpour, S.S. (2013). Change in membrane fatty acid compositions and cold-induced responses in chickpea. Molecular Biology Reports, 40(2), 893-903.

Kazemi-Shahandashti, S.S., & Maali-Amiri, R. (2018). Global insights of protein responses to cold stress in plants: Signaling, defence, and degradation. Journal of Plant Physiology, 226, 123-135.

Kazemi-Shahandashti, S.S., Maali-Amiri, R., Zeinali, H., Khazaei, M., Talei, A., & Ramezanpour, S.S. (2014). Effect of short-term cold stress on oxidative damage and transcript accumulation of defense-related genes in chickpea seedlings. Journal of Plant Physiology, 171(13), 1106-1116.

Kim, T.E., Kim, S.K., Han, T.J., Lee, J.S., & Chang, S.C. (2002). ABA and polyamines act independently in primary leaves of cold-stressed tomato (Lycopersicon esculentum L.). Physiologia Plantarum, 115, 370–376.

Kliebenstein, D.J., & Osbourn, A. (2012). Making new molecules evolution of pathways for novel metabolites in plants. Current Opinion in Plant Biology, 15, 415–423.

Köhler, Z.M., & Szepesi, Á. (2023). More than a diamine oxidase inhibitor: L-aminoguanidine modulates polyamine-related abiotic stress responses of plants. Life, 13(3), 747.

Konishi, S., Izawa, T., Lin, S.Y., Ebana, K., Fukuta, Y., Sasaki, T., & Yano, M. (2006). An SNP caused loss of seed shattering during rice domestication. Science, 312, 1392–1396.

Kuznetsov, V., Shorina, M., Aronova, E., Stetsenko, L., Rakitin, V., & Shevyakova, N. (2007). NaCl-and ethylene-dependent cadaverine accumulation and its possible protective role in the adaptation of the common ice plant to salt stress. Plant Science, 172(2), 363-370.

Kuznetsov, V.V., Stetsenko, L.A., & Shevyakova, N.I. (2009). Exogenous cadaverine induces oxidative burst and reduces cadaverine conjugate content in the common ice plant. Journal of Plant Physiology, 166(1), 40-51.

Livak, K.J., & Schmittgen, T.D. (2001). Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2^−ΔΔCT method. Methods, 25, 402–408.

López-Gómez, M., Hidalgo-Castellanos, J., Iribarne, C., & Lluch, C. (2014) Proline accumulation has prevalence over polyamines in nodules of Medicago sativa in symbiosis with Sinorhizobium meliloti during the initial response to salinity. Plant Soil, 374, 149-159.

López-Gómez, M., Hidalgo-Castellanos, J., Muñoz-Sánchez, J.R., Marín-Peña, A.J., Lluch, C., & Herrera-Cervera, J.A. (2017). Polyamines contribute to salinity tolerance in the symbiosis Medicago truncatula-Sinorhizobium meliloti by preventing oxidative damage. Plant Physiology and Biochemistry, 116, 9-17.

Loreto, F., & Velikova, V. (2001) Isoprene produced by leaves protects the photosynthetic apparatus against ozone damage, quenches ozone products, and reduces lipid peroxidation of cellular membranes. Plant Physiology, 127(4), 1781-1787.

Mantri, N.L., Ford, R., Coram, T.E., & Pang, E.C. (2007). Transcriptional profiling of chickpea genes differentially regulated in response to high-salinity, cold and drought. BMC Genomics, 8(1), 303.

Moore, B.D., Andrew, R.L., K€ulheim, C., & Foley, W.J. (2014). Explaining intraspecific diversity in plant secondary metabolites in an ecological context. New Phytologist, 201, 733–750.

Moschou, P.N., Wu, J., Cona, A., Tavladoraki, P., Angelini, R., & Roubelakis-Angelakis, K.A. (2012). The polyamines and their catabolic products are significant players in the turnover of nitrogenous molecules in plants. Journal of Experimental Botany, 63, 5003–5015.

Napieraj, N., Janicka, M., & Reda, M. (2023). Interactions of polyamines and phytohormones in plant response to abiotic stress. Plants, 12(5), 1159.

Nayyar, H., Satwinder, K., Kumar, S., Singh, K.J., & Dhir, K.K. (2005). Involvement of polyamines in the contrasting sensitivity of chickpea (Cicer arietinum L.) and soybean (Glycine max (L.) Merrill.) to water deficit stress. Botanical Bulletin of Academia Sinica, Sin 46.

Peng, H., Cheng, H., Yu, X. et al. (2010). Molecular analysis of an actin gene, CarACT1, from chickpea (Cicer arietinum L.). Molecular Biology Reports, 37, 1081.

Pfaffl, M.W. (2001). A new mathematical model for relative quantification in real-time RT–PCR. Nucleic Acids Research, 29(9), e45-e45.

Rajpal, C., & Tomar, P.C. (2020). Cadaverine: A diamine presence & role in plants. Plant Arch, 20, 1754-1763.

Rakei, A., Maali-Amiri, R., Zeinali, H., & Ranjbar, M. (2016). DNA methylation and physio-biochemical analysis of chickpea in response to cold stress. Protoplasma, 253(1), 61-76.

Saeed, A., Hovsepyan, H., Darvishzadeh, R., Imtiaz, M., Panguluri, S. K., & Nazaryan, R. (2011). Genetic diversity of Iranian accessions, improved lines of chickpea (Cicer arietinum L.) and their wild relatives by using simple sequence repeats. Plant Molecular Biology Reporter, 29(4), 848-858.

Samanta, I., Roy, P.C., Das, E., Mishra, S., & Chowdhary, G. (2023). Plant peroxisomal polyamine oxidase: A ubiquitous enzyme involved in abiotic stress tolerance. Plants, 12(3), 652.

Shalaby, A.R. (2000). Changes in biogenic amines in mature and germinating legume seeds and their behavior during cooking. Food/Nahrung, 44(1), 23-27.

Shelp, B.J., Bozzo, G.G., Trobacher, C.P., Zarei, A., Deyman, K.L., & Brikis, C.J. (2012a). Hypothesis/review: contribution of putrescine to 4-aminobutyrate (GABA) production in response to abiotic stress. Plant Science, 193, 130-135.

Shen, H.J., & Galston, A.W. (1985). Correlations between polyamine ratios and growth patterns in seedling roots. Plant Growth Regulation, 3(3-4), 353-363.

Sheteiwy, M., Shen, H., Xu, J., Guan, Y., Song, W., & Hu, J. (2017). Seed polyamines metabolism induced by seed priming with spermidine and 5-aminolevulinic acid for chilling tolerance improvement in rice (Oryza sativa L.) seedlings. Environmental and Experimental Botany, 137, 58-72.

Simon-Sarkadi, L., Ludidi, N., & Kocsy, G. (2014). Modification of cadaverine content by NO in salt-stressed maize. Plant Signaling & Behavior, 9, e27598.

Song, Y., Diao, Q., & Qi, H. (2015). Polyamine metabolism and biosynthetic genes expression in tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) seedlings during cold acclimation. Plant Growth Regulation, 75(1), 21-32.

Su, G.X., & Bai, X. (2008). Contribution of putrescine degradation to proline accumulation in soybean leaves under salinity. Biologia Plantarum, 52(4), 796.

Sziderics, A.H., Oufir, M., Trognitz, F., Kopecky, D., Matušíková, I., & Hausman, J.F. (2010). Organ-specific defence strategies of pepper (Capsicum annuum L.) during early phase of water deficit. Plant Cell Report, 29, 295–305.

Tanou, G., Ziogas, V., Belghazi, M., Christou, A., Filippou, P., Job, D., & Molassiotis, A. (2014). Polyamines reprogram oxidative and nitrosative status and the proteome of citrus plants exposed to salinity stress. Plant, Cell Environment, 37(4), 864-885.

Tavladoraki, P., Cona, A., Federico, R., Tempera, G., Viceconte, N., Saccoccio, S., & Agostinelli, E. (2012). Polyamine catabolism: target for antiproliferative therapies in animals and stress tolerance strategies in plants. Amino Acids, 42(2-3), 411-426.

Tomar, P.C., Lakra, N., & Mishra, S.N. (2013b). Effect of cadaverine on Brassica juncea (L.) under multiple stresses. Indian Journal of Experimental Biology, 51, 758–763.

Varshney, R.K., Song, C., Saxena, R.K., Azam, S., Yu, S., Sharpe, A.G., & Millan, T. (2013). Draft genome sequence of chickpea (Cicer arietinum L.) provides a resource for trait improvement. Nature Biotechnology, 31(3), 240.

Walter H.J.P., & Geuns J.M. (1987) High speed HPLC analysis of polyamines in plant tissues. Plant Physiology, 83, 232-234.

Wang, X., Chen, Q., Wu, Y., Lemmon, Z.H., Xu, G., Huang, C., & Tian, F. (2018). Genome-wide analysis of transcriptional variability in a large maize-teosinte population. Molecular Plant, 11(3), 443-459.

Weiberg, A., & Karlovsky, P. (2009). Components of variance in transcriptomics based on electrophoretic separation of cDNA fragments (cDNA‐AFLP). Electrophoresis, 30(14), 2549-2557.

Wimalasekera, R., Villar, C., Begum, T., & Scherer, G.F.E. (2011b). Copper amine oxidase1 (CuAO1) of Arabidopsis thaliana contributes to abscisic acid and polyamine-induced nitric oxide biosynthesis and abscisic acid signal transduction. Molecular Plant, 4, 663–678.

Wimalasekera, R., Tebartz, F., & Scherer, G.F. (2011a). Polyamines, polyamine oxidases and nitric oxide in development, abiotic and biotic stresses. Plant Science, 181, 593–6.

[1]. Cadaverine

[2]. Polyamines

[3]. Lysine

[4]. Diamine oxidase

[5]. Lethal Temprature 50

[6]. Perchloric acid (CLO4H)

[7]. 1,7-diaminoheptane

[8]. Dansyl chloride

[9]. NN-dimethylaniline

[10]. 4-aminoantiprine