Physiological responses and expression pattern of SOS genes of bread wheat to salt stress

مقدمه

شوری خاک، یکی از مهم‌ترین تنش‌های غیر زیستی است که تولید محصولات کشاورزی را در بسیاری از نقاط جهان محدود می­کند. علت اصلی تراکم نمک در نیم­رخ خاک در مناطق خشک و نیمه­خشک، کیفیت آب آبیاری و یا کمبود آن است. مواردی نیز نشان می‌دهد که شوری خاک در نتیجه ویژگی‌های سنگ‌های مادری است
Pazira & Homaee, 2010)). در اراضی کشاورزی این مشکل در اثر استفاده از کودهای محلول، آبیاری شدید و بالا آمدن سطح آب­های زیرزمینی، شدت یافته است (Rengasamy, 2010; Jan et al., 2017). تخمین زده شده است که حدود 20 درصد زمین‌های کشاورزی شور هستند (Long et al., 2013). در ایران حدود 20 درصد از اراضی کشور)حدود 34 میلیون هکتار( تحت تاثیر شوری قرار دارد که 5/8 میلیون هکتار آن شدیدا تحت تاثیر شوری است (Ranjbar et al., 2016). افزایش شوری خاک، رشد محصولات زراعی را تحت تاثیر قرار داده، پنجه­زنی را کاهش و میزان تولید را محدود می‌کند. اصلاح گیاهان متحمل به شوری، یکی از موثرترین راهکار برای بهبود عملکرد محصول در نواحی شور است
(Zhu et al., 2006). گندم نان (L. Triticum aestivum) از نظر اهمیت و میزان تولید، اولین غله دنیاست و در کشورهای مختلف جهان به‌ویژه کشورهای درحال‌توسعه منبع اصلی تامین­کننده کالری انسان است. ارزش غذایی بالا، هضم آسان، تنوع و مرغوبیت فرآورده­های آن، سهولت تبدیل، نگهداری و سایر ویژگی­ها، گندم را در میان سایر غلات متمایز کرده است (Pask et al., 2014).

در اکثر مناطق خشک جهان که راهکاری جز آبیاری با آب شور برای تولید محصولات زراعی وجود ندارد، شور­شدن خاک غیر قابل اجتناب بوده و متاسفانه به‌تدریج به یک مشکل عمده به ویژه در مناطق خشک و نیمه­خشک ایران تبدیل شده است. اگرچه تنش شوری درتمام مراحل رشدی گیاه می­تواند رخ دهد؛ اما باتوجه‌به اینکه شرایط استقرار اولیه و بقای گیاه در عملکرد نهایی تاثیر زیادی دارد، لذا تنش شوری در مرحله گیاهچه­ای می­تواند برای گیاه بسیار مضر باشد (Ghorbani et al., 2019; Ramadoss et al., 2013). اثرات مخرب تنش شوری، به دلیل کاهش پتانسیل اسمزی در محیط ریشه و تاثیر بر تعادل آبی گیاه و کاهش فشار آماس، در مراحل مختلف رشدی گندم نان توسط پژوهشگران زیادی گزارش شده است (Zhu et al., 2016).

از مهم­ترین مکانیسم­های مقاومت، کنترل تعادل در جذب Na⁺ از ریشه، تنظیم جریان آن در داخل سلول و کنترل انتقال طولانی مسیر آن و همچنین کده­بندی[1] آن در سلول و بافت­ها است (Flowers & Colmer, 2008)؛ به‌طوری‌که ارقام متحمل کم­ترین میزان Na⁺ را در بافت­های خود نشان می‌دهند. جذب انتخابی پتاسیم در برابر Na⁺ یک مکانیسم فیزیولوژیکی فوق­العاده مهم برای مقابله با تجمع شوری در بسیاری از گونه‌های گیاهی است (Zeeshan et al., 2020). گزارش­های زیادی مبنی بر تحمل بیشتر گیاه در ارتباط با سیستم مطلوب­تر جذب انتخابی K⁺ به Na⁺ وجود دارد. دراین‌ارتباط
Zeeshan et al. (2020) گزارش کردند که ارقام جو و گندم متحمل به شوری، سطح پایین­تری از Na⁺ را نسبت به ارقام حساس به شوری در بافت‌ها نگه می­دارند. مشاهده شده که در شرایط غیر تنش نسبت K⁺ به Na⁺ بالا بوده؛ اما در شرایط تنش مقدار آن کاهش می‌یابد. در شوری بالا، یون Na⁺ با سایر یون­ها به‌ویژه K⁺ رقابت می­کند و منجر به کاهش K⁺ در گیاه می شود
(Parida & Das, 2005). نسبت K⁺/Na⁺ در طی تنش شوری کاهش می­یابد و این کاهش در گونه‌های حساس به شوری بیشتر است (Sairam et al., 2002;
Zeeshan et al., 2020). تغییر در بیان ژن‌ها از مهمترین رویدادهایی است که در سلول‌های گیاهی تحت تنش رخ داده و منجر به پاسخ‌های بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی در برابر تنش می‌شود. بررسی بیان و نحوه تنظیم ژن‌ها یکی از ابزارهای مهم در اصلاح مقاومت به تنش در گیاهان است Yousefi Rad et al., 2019)). بررسی بیان ژن‌ها با استفاده از روش Real-time PCR به دلیل تکرارپذیری، حساسیت و اختصاصی­بودن امروزه کاربرد فراوانی در مطالعات زیستی یافته است
Mohammadi Purfard et al., 2017) ).

تنظیم هموستازی یونی درون سلول یکی از جنبه­های مهم فیزیولوژی سلول­های زنده در تحمل به تنش شوری محسوب می­شود که توسط مسیر سیگنالینگ فوق حساسیت به شوری SOS1)) انجام می­شود
(Tounsi et al., 2017). این مسیر بیوشیمیایی شامل سه ژن اصلی SOS1، SOS2 ،SOS3 می­باشد. ژن SOS3 یکی از ژن­های کلیدی در این مسیر تنظیمی بوده که باعث فعال­سازی این مسیر می­شود (Tiwari et al., 2020). در مسیرSOS  پروتئین متصل­شونده به کلسیم یاSOS3 سیگنال تنش شوری را دریافت و منتقل می­کند. SOS3 پروتئین SOS2  را فعال کرده و به سمت غشای پلاسمایی هدایت می­کند تا فسفریلاسیون پروتئین  SOS1توسط مجموعه SOS2-SOS3 فراهم شود. ژن SOS1 کدکننده یک آنتی­پورتر پروتون/سدیم واقع در غشای پلاسمایی است که نقش مهمی را در انتقال Na⁺ به نواحی آپوپلاست سلول و یا انتقال Na⁺ از ریشه به اندام هوایی از طریق سیستم آوندی ایفا می­کند (Qiu et al., 2002;
Li et al., 2020). ژن SOS1 از گیاهان حساس به شوری نظیر برنج (OsNHA1 و OsSOS1) (Zhou et al., 2016)، گندم نان (TaSOS1) (Xu et al., 2008)، نی
 Phragmites australis (PhaNHA1-u)
(Takahashia et al., 2009) و همچنین گیاهان متحمل به شوری نظیرThellungiella halophile  (ThSOS1) (Oh et al., 2007)، Cymodocea nodosa (CnSOS1A و CnSOS1B) (Garciadebla et al., 2007) شناسایی شده است (Ghasemi et al., 2015). Sathee et al. (2015) در بررسی تاثیر تنش شوری بر بیان ژن­های SOS1،SOS2  و SOS3 در سه رقم متحمل، نیمه متحمل و حساس نشان دادند که بیان ژن­های SOS1 وSOS2  در ژنوتیپ متحمل در شرایط تنش شوری افزایش یافته در حالی‌که در ژنوتیپ نیمه­متحمل و حساس این افزایش به ترتیب به میزان کمتری بود. هدف از انجام این تحقیق شناسایی برخی مکانیسم‌های تحمل به تنش شوری بر اساس تجمع میزان Na⁺ و K⁺ در بافت و بیان ژن­های SOS دخیل در این مسیر بود.

مواد و روش­ها

به منظور بررسی اثر تنش شوری در زمان­های مختلف بر خصوصیات مورفولوژیک، غلظت عناصر و بیان برخی ژن­های مسیر تنش شوری آزمایشی به صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملا تصادفی با دو فاکتور شامل تنش شوری 200 میلی­مولار در زمان های صفر، یک، 10 و 20 روز پس از اعمال تنش و چهار ژنوتیپ لاین 7، لاین 8، لاین 16 و سیستان (جدول 1) در سه تکرار در گلخانه مرکز تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی استان یزد انجام شد. انتخاب ژنوتیپ‌ها بر اساس نتایج آزمایش­های قبلی مزرعه‌ای بود (Mokarian et al., 2021). بذور در گلدان­هایی با قطر 15 سانتی­متر حاوی ورمی­کولیت و خاک مزرعه (به نسبت 1:1) کشت شد و تا مرحله سبز­شدن کامل گیاهچه­ها، آبیاری با آب مقطر انجام شد. پس از آن تا رسیدن گیاهان به مرحله سه­برگی، گیاهچه­ها با محلول هوگلند آبیاری و سپس جهت اعمال تنش شوری نمکNaCl  در غلظت مورد نظر به محلول هوگلند اضافه شد. شرایط کنترل­شده جهت رشد مطلوب گیاهچه­ها شامل آبیاری صحیح و به­موقع، دمای مناسب رشد 25-18 درجه سانتی­گراد و شدت نور 300 میکرومول بر متر مربع بر ثانیه با ۱۶ ساعت روشنایی و هشت ساعت تاریکی فراهم شد.

جدول 1- ژنوتیپ­های گندم مورد استفاده در این آزمایش

Table 1. Genotypes of wheat used in this study

برای حفظ شرایط نرمال رشد و جلوگیری از اعمال ناگهانی تنش، گیاهان به تدریج در معرض تیمار محلول نمک قرار گرفتند. در چند روز اول آبیاری با آب شور محتوی غلظت کم نمک با 50 میلی­مولار شروع شد و سپس به مدت هفت روز تا حد پیش­بینی شده افزایش یافت. در هر نوبت آبیاری آبی که به هر گلدان اضافه می­شد بر­اساس ظرفیت زراعی بود. برای اطمینان از جلوگیری از خروج آب از گلدان از زیر­گلدانی استفاده شد. از طرف دیگر هر سه روز یکبار EC عصاره اشباع خاک در گلدان­های آزمایش به همراه هدایت الکتریکی آب خارج­شده از گلدان­ها اندازه‌گیری می­شد.

پس از اجرای آزمایش و اعمال تنش شوری در زمان­های مربوطه پس از اعمال تنش، گلدان­ها تخریب و نمونه کافی از بافت برگ جهت اندازه­گیری عناصرNa⁺، K⁺ و بیان ژن­های SOS1،SOS2  و SOS3 تهیه شد. نمونه­ها در داخل فویل پیچیده و پس از قرارگیری در نیتروژن مایع بلافاصله به فریزر 80- درجه سانتی‌گراد منتقل شدند. اندازه­گیری عناصر در نمونه­های گیاهی به­روش خاکستر­کردن خشک و ترکیب با HCl انجام شد (Zeeshan et al., 2020). برای اندازه­گیری غلظت Na⁺ و K⁺ از دستگاه فلیم­فتومتر استفاده شد (Zeeshan et al., 2020).

استخراج RNA با استفاده از بافر ترایزول انجام شد. برای ساخت cDNA از کیتRevertAid™ First Strand cDNA Synthesis K1622 شرکت فرمنتاز و بر­اساس دستورالعمل شرکت سازنده استفاده شد. غلظت RNA پس از هر استخراج، با استفاده از دستگاه نانودراپ و در طول موج 260 و 280 نانومتر تعیین شد. مقدار کل RNA  بر حسب میکروگرم در میکرولیتر محاسبه شد. در مرحله بعد RNA استخراج­شده با آنزیم DNase I براساس روش پیشنهادی شرکت فرمنتاز تیمار شد. دو میکروگرم RNA، یک میکرولیتر بافر، یک واحد (u) آنزیم DNase І و 10 واحد (u) آنزیم RNase inhibitor، مخلوط و با افزودن آبDEPC  حجم محلول به 10 میکرولیتر رسانده شد و به مدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی گراد قرار گرفتند. سپس یک میکرولیترEDTA  به تیوب‌ها اضافه ‌شد و به مدت 10 دقیقه در دمای 65 درجه سانتی گراد قرار داده ‌شدند. تیوب‌ها در 80- درجه سانتی گراد نگه‌داری شدند. به منظور ساخت cDNA، پنج میکرولیتر RNA تیمارشده با DNase با کمک آغازگر الیگو­دی­تی (یک پیکومول) (20-18 نوکلئوتید) مخلوط و حجم محلول با استفاده از آب DEPC به 11 میکرولیتر رسانده شد. این مخلوط به مدت پنج دقیقه در دمای 70 درجه سانتی گراد قرار گرفت و سپس روی یخ سرد شد. در ادامه چهار میکرولیتر بافر واکنش و دو میکرولیتر دی‌اکسی­نوکلئوتری­فسفات (dNTPs) با غلظت 10 میکرومول و 20 واحد آنزیم RNase inhibitor به هر تیوب اضافه و حجم محلول با آب DEPC به 19 میکرولیتر رسانده شد. سپس تیوب­ها به مدت پنج دقیقه در دمای 37 درجه سانتی گراد قرار داده شدند. بعد از آن 200 واحد (u) آنزیم Revert Aid M-Mulv به این محلول افزوده و پس از مخلوط­کردن به مدت یک ساعت در دمای 42 درجه سانتی گراد قرار داده ‌شد. سپس برای غیر فعال­کردن واکنش، تیوب‌ها به مدت 10 دقیقه در دمای 70 درجه سانتی گراد قرار گرفتند. پس از ساخت cDNA، به منظور نگهداری، نمونه­ها به فریزر 20- درجه سانتی‌گراد منتقل و برای اطمینان از ساخت cDNA با استفاده از ژن مرجع اکتین واکنش زنجیره­ای پلی­مراز روی cDNA ساخته­شده انجام شد. طراحی آغازگرها با برنامه آنلاین Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/) انجام شد (جدول 2).

جدول 2- مشخصات آغازگرهای استفاده­شده در این تحقیق

 Table 2. Property of primers used in this study.

تمامی نکات مربوط به طراحی آغازگر از قبیل درصد GC بالای 50 درصد و حضور G و یا  Cدر انتهای 3' آغازگرها، دمای اتصال 60 درجه و طراحی آغازگر از ناحیه 3' ژن مورد توجه قرار گرفت. در این تحقیق از دستگاهiQ5 شرکت بایورد[2] و کیت حاوی رنگ فلورسنت
 SYBR BioParsبرای ارزیابی کمی استفاده شد. 20 میکرولیتر مخلوط واکنش PCR شامل 10 میکرولیتر مخلوط SYBR BioPars، یک میکرولیتر از هریک از آغازگرهای اختصاصی پیشرو و پسرو با غلظت 10 میکرومول، سه میکرولیتر آب مقطر استریل و پنج میکرولیتر نمونه cDNA استفاده شد. برای هر واکنش (تکرار بیولوژیکی) سه تکرار در نظر گرفته شد. پس از آماده­کردن مخلوط واکنش، پلیت مورد نظر به دستگاه iQ5  منتقل و با شرایط زیر واکنش زنجیره­ای پلیمراز انجام شد: دو دقیقه در دمای 94 درجه سانتی‌گراد و 35 تکرار با چرخه‌های 10 ثانیه در دمای 95 درجه سانتی‌گراد، 10 ثانیه در دمای 58 درجه سانتی‌گراد (دمای Tm آغازگر) و 10 ثانیه در دمای 72 درجه سانتی­گراد. بیان نسبی ژن­ها با روش ^–ΔΔCT2 محاسبه شد (Pfaffl, 2007). جهت تجزیه داده­ها از نرم­افزار REST[3] استفاده شد (Pfaffl et al., 2002).

این پژوهش به صورت آزمایش فاکتوریل (دو فاکتوری) و در قالب طرح کاملا تصادفی با سه تکرار انجام شد. برای تجزیه و تحلیل داده‌ها از نرم­افزار SAS 9.2 و به منظور انجام مقایسات میانگین از آزمون چند دامنه­ای دانکن در سطح احتمال پنج درصد و برای رسم نمودار­ها از نرم­افزار Excel استفاده شد.

نتایج و بحث

نتایج تجزیه واریانس اختلاف معنی­داری بین ژنوتیپ‌ها و زمان شوری و اثر متقابل آن‌ها در صفات مطالعه­شده نشان داد (جدول 3).

بر اساس نتایج، میانگین وزن خشک اندام هوایی در شرایط تنش نسبت به شرایط شاهد (بدون تنش) کاهش معنی­داری داشت و بیشترین کاهش در لاین 16 و کمترین کاهش مربوط به لاین 7 بود. وزن خشک اندام هوایی از آغاز تنش تا بیست روز پس از تنش حدود 50 درصد کاهش یافت (شکل 1).

جدول 3-تجزیه واریانس صفات اندازه­گیری­شده در گندم تحت تنش شوری

Table 3. Analysis of variance in wheat genotypes under salt stress conditions

^ns، ^*و ^** به ترتیب عدم اختلاف معنی­دار و معنی­داری در سطوح احتمال پنج و یک درصد.

^ns , ^* and ^**: non-significant difference and significant differences at 5 and 1% probability levels, respectively.

تحت شرایط شاهد (بدون تنش) میزان Na⁺ اندام هوایی در کلیه ژنوتیپ­ها اختلاف معنی­داری  نشان نداد اما در شرایط تنش شوری با گذشت زمان بر میزان Na⁺اندام هوایی همه ژنوتیپ­ها افزوده شد. مقایسه میزانNa⁺ در ده روز پس از تنش تفاوت‌ معنی­داری در لاین‌های مختلف نشان نداد که حاکی از آن است که در تنش کوتاه­مدت احتمالا همه ژنوتیپ‌ها ظرفیت سلولی مشابهی در عدم جذب یا دفع Na⁺ و تحمل شوری داشتند. با­این وجود با گذشت زمان این تفاوت در ژنوتیپ­ها آشکار شد به طوری که در تنش طولانی­مدت، این افزایش به ترتیب در لاین 7 کمترین میزان (46/2 برابر) و در لاین 16 بیشترین میزان (63/4 برابر) را به خود اختصاص داد (شکل 2-الف). یکی از مهم­ترین زمینه­های مقاومت، تنظیم تعادل در جذب Na⁺ از ریشه، تنظیم جریان آن در داخل سلول، کنترل انتقال طولانی مسیر آن و همچنین کده­بندی آن در سلول و بافت­ها است (Flowers & Colmer, 2008). دفع Na⁺ از اندام­های هوایی به عنوان یکی از مکانیسم­های مهم تحمل شوری در برخی از گیاهان از جمله گندم شناسایی شده و تحمل به شوری در این گونه­ها به توانایی آن­ها برای دفع Na⁺ وابسته بوده به طوری‌که از تجمع غلظت­های بالای یون Na⁺ در برگ به ویژه پهنک برگ جلوگیری می­کند (Hasanuzzaman et al., 2017). از آنجایی که تحمل شوری در گندم و بسیاری از تک­لپه‌ای­ها همبستگی بالایی با غلظت پایین Na⁺ اندام هوایی دارد (Colmer et al., 2005)  به نظر می‌رسد که لاین 7 احتمالا میزان بالاتری Na⁺ دفع و یا در واکوئل خود ذخیره کرده و پاسخ‌های تحمل مطلوبتری داشته است.

تحمل شوری گیاه نه تنها با میزان Na⁺  اندام هوایی تعیین می‌شود بلکه به توانایی حفظ میزان بالای K⁺ درون سلول نیز بستگی دارد (Shabala & cuin; 2008;
Maha et al., 2017). نتایج مطالعه حاضر نشان داد که در شرایط شاهد تغییری در میزان K⁺ مشاهده نشد اما در شرایط تنش شوری با گذشت زمان از میزان K⁺ اندام هوایی کاسته شد به طوری که بیست روز پس از تنش در لاین 16 و 7 بیشترین (72/1 برابر) و کمترین (18/1 برابر) کاهش مشاهده شد اگرچه روند کاهشی در لاین 7 (متحمل) در زمان ده روز پس از تنش متوقف شد (شکل 2-ب).

جذب انتخابی K⁺ در برابرNa⁺  یک مکانیسم فیزیولوژیکی مهم برای مقابله با تجمع شوری در بسیاری از گونه‌های گیاهی است (Aly et al., 2018). تنظیم هموستازی یون­ها در گیاه، برای تحمل گیاه و حفظ حالت پایداری در سلول‌های گیاهی در برابر تنش شوری لازم است.et al.  Iqra (2020) نشان دادند که شوری تجمع K⁺ را در ارقام متحمل به نمک تحریک کرده در حالی که این پاسخ در ارقام نیمه­حساس و حساس برعکس بود. بنابراین با توجه به تجمع بیشتر K⁺ در زمان تنش، لاین 7 تحمل مطلوبتری در مقایسه با سایر لاین­های مطالعه شده دارد.

شکل 1- الگوی تغییر وزن خشک اندام هوایی ژنوتیپ‌های گندم پس از یک، 10 و 20 روز تنش شوری 200 میلی­مولار

Figure 1. Pattern of shoot dry weight changes of wheat genotypes after one, 10 and 20 days of 200 mM salinity stress

شکل 2- الگوی تغییر میزان  Na⁺(الف) و K⁺ (ب) اندام هوایی ژنوتیپ‌های گندم پس از یک، ده و بیست روز تنش شوری 200 میلی­مولار. ستون­های دارای حداقل یک حرف مشترک، اختلاف معنی­داری بر اساس آزمون دانکن در سطح احتمال پنج درصد ندارند.

Figure 2. Pattern of Na⁺ and K⁺ shoot changes in wheat genotypes after one, 10 and 20 days of 200 mM salinity stress. Columns with at least one letter in common did not have a statistically significant difference based on the Duncan test at 5%)

گزارش­ها نشان داده که در شرایط شاهد نسبت K⁺به Na⁺ بالا بوده اما در شرایط تنش شوری مقدار آن رو به کاهش رفت. در شوری بالا، یون Na⁺ با سایر یون­ها به­ویژه K⁺ رقابت می‌کند (Zeeshan et al., 2020). در تحقیق حاضر نیز نسبت K⁺/Na⁺ اندام هوایی در شرایط تنش شوری کاسته شد. کمترین میزان کاهش در لاین 7 (92/2 برابر) بوده که در زمان ده روز پس از تنش متوقف شد و بیشترین کاهش نسبت K⁺/Na⁺ را لاین 16 به خود اختصاص داد (01/8 برابر) (شکل 3). بنابراین تحت تنش شوری، یون Na⁺ با سایر یون­ها به­ویژه K⁺ در تقابل بوده و منجر به کاهش K⁺ در گیاه می­شود
(Zeeshan et al., 2020).

بیشترین افزایش در میزان Na⁺ و کمترین میزان K⁺ مربوط به لاین 16 بوده که قابل مقایسه با مقادیر مشابه در لاین 7 می‌باشد. بنابراین به نظر می‌رسد لاین 7 با کمترین تجمع Na⁺ در برگ و بیشترین میزان K⁺ وضعیت تعادل یونی مطلوبی را جهت رشد اولیه در خود ایجاد کرده و بیانگر فتوسنتز مطلوب احتمالی در آن می‌باشد. بیشترین میزان وزن خشک اندام هوایی تحت تنش تایید­کننده این موضوع است (شکل 1). نکته جالب‌تر آن­که لاین 7 پاسخ­های دیرهنگام مطلوب‌تری به تنش شوری در مقایسه با دیگر ژنوتیپ‌ها نشان داد. تحت شرایط یک روز پس از تنش، کمترین کاهش‌ در  Na⁺/ K⁺به لاین 7 اختصاص یافته (8/1 برابر) و 20 روز پس از تنش نیز این نسبت کمترین کاهش (92/2 برابر) را در مقایسه با دیگر ژنوتیپ‌ها داشت. مطالعات نشان داده که ارقام متحمل پاسخ‌های اولیه و دیرهنگام مطلوب‌تری به تنش نشان می‌دهند در حالی‌که ارقام حساس تنها پاسخ‌های اولیه موقت دارند و سریعا در اثر تنش از بین می‌روند(Heidarivand & Maali Amiri, 2013) . پاسخ­های زودهنگام مربوط به ساعات پس از تنش تا یک روز پس از تنش بوده در حالی­که پاسخ­های دیرهنگام مربوط به زمان­های طولانی­تر یعنی چند روز پس از زمان شروع تنش می­باشد (Rakei et al., 2016).

شکل 3- الگوی تغییر نسبت K⁺ به Na⁺ اندام هوایی ژنوتیپ‌های گندم پس از یک، 10 و 20 روز تنش شوری 200 میلی­مولار. ستون­های دارای حداقل یک حرف مشترک، اختلاف معنی­داری بر اساس آزمون دانکن در سطح احتمال پنج درصد ندارند.

Figure 3. Pattern of change in ratio of K ⁺ to Na ⁺ shoots of wheat genotypes after one, 10 and 20 days of salinity stress of 200 mM. Columns with at least one letter in common did not have a statistically significant difference based on the Duncan test at 5%.

در گیاهان، تنظیم تعادل یونی تحت تنش شوری اغلب تحت کنترل بیان ژن‌های تولید­کننده پروتئین‌‌هایی است که در غشاهای پلاسمایی و اجزای سلولی از جمله اندامک‌ها فعالیت می‌کنند (Suo et al., 2017). بنابراین ارزیابی بیان نسبی این ژن‌ها از جمله پورترهای دخیل در نقل و انتقال سدیم تحت تنش اطلاعات مفیدی ارائه می‌کند. با توجه به اینکه روند تغییر الگوی صفات مرتبط با تعادل یونی در ژنوتیپ متحمل در روزهای دهم و بیستم مشابه (عدم تغییر معنی­دار) یکدیگر بوده، لذا در جهت بررسی الگوی بیان ژن­های دخیل در تنظیم تعادل یونی، تنها تیمارهای زمانی ده روز پس از تنش شوری در مقایسه با روز اول و شرایط شاهد ارزیابی شد (جدول 4).

نتایج نشان داد بعد از اعمال تنش شوری سطوح بیان SOS3  در لاین 7 به طور مداوم در مقایسه با شرایط شاهد افزایش یافت و در بیست روز پس از تنش به حداکثر مقدار خود (74/2 برابر) رسید. در حالی که در سایر ژنوتیپ­ها روند نامنظمی در طول زمان تنش مشاهده شد به­طوری که به جز لاین 7، در سایر ژنوتیپ­ها میزان بیان این ژن بیست روز پس از تنش به شدت کاهش یافت و بیشترین کاهش در لاین 16 ( 15/3- برابر) بود. به نظر می­رسد با افزایش شدت تنش فرایند رونویسی این ژن دچار خسارت شده و بنابراین به دلیل عدم فعالیت مطلوب آنتی­پورتر SOS1 انتظار خسارت شدید در سلول قابل پیش­بینی خواهد بود. کاهش معنی­دار میزان وزن خشک و پتاسیم اندام هوایی و همچنین بیشترین تجمع سدیم در سیستان و لاین 16 تایید­کننده چنین پاسخ سلولی در سطح رونوشت می­باشد. بیان نسبی ژنSOS2  نیز در شرایط تنش شوری افزایش نشان داد. بر اساس نتایج، بیان نسبی ژن SOS2 لاین 16 در شرایط تنش شوری با گذشت زمان، کمترین افزایش را داشت (89/2 برابر) ولی در لاین 7 بیشترین افزایش (99/5 برابر) مشاهده شد. همچنین در لاین 8 و 16 در شرایط تنش شوری با گذشت زمان ابتدا افزایش و سپس کاهش میزان بیان این ژن مشاهده شد. روند تغییر سطوح بیان ژن SOS3 در ژنوتیپ­های استفاده­شده تقریبا مشابه با ژنSOS2  بود که بیانگر آن است که پروتئین SOS3  پس از فعال­شدن و اتصال به SOS2 باعث دایمر­شدن و در نتیجه افزایش فعالیت SOS2 می­شود. تطابق بالای الگوی بیان دو ژن  SOS2و  SOS1موید نوعی ارتباط ساختاری این دو پروتئین و نقش مکمل آن­ها در تحمل تنش شوری می­باشد. SOS2 در مسیر درک تنش شوری و پاسخ به آن قرار داشته و باعث القای بیان برخی از ژن­ها از جملهSOS1  می­شود (Feki et al., 2011)، همچنین این پروتئین کیناز ممکن است با فعال­کردن پروتئین­های غشای پلاسمایی و واکوئلی مانند  ATPase -HوAVP ، با تامین شیب پروتون، به­طور غیر مستقیم بیان و فعالیت آنتی­پورترهای غشاییNa⁺/H⁺  از جمله SOS1  و NHX1 را در ریشه گیاهچه­های گندم افزایش دهد. بدین ترتیب Na⁺ وارد­شده به داخل سلول، از آن خارج و یا در واکوئل سلولی، کده‌بندی می­شود
((Ben Amar et al., 2014. تحت تنش شوری افزایش القای بیان ژن SOS1 در ژنوتیپ­ها نسبت به شاهد مشابه SOS2 وSOS3  بود به­طوری­که بیشترین افزایش بیان نسبت به کنترل مربوط به لاین 7 و بیست روز پس از تنش بود (42/7 برابر). در واقع افزایش کمپلکس پروتئینیSOS3/SOS2  باعث فسفریله­شدن و فعالیت بیشتر آنتی­پورتر (SOS1)Na⁺/H⁺ واقع در غشای پلاسمایی سلول می‌شود. بنابراین فعال­شدن SOS1 موجب خارج­شدن Na⁺ از سیتوپلاسم به محیط آپوپلاست شده و به ایجاد تعادل اسمزی در داخل سلول می­انجامد
(Shi et al., 2002; Hasegawa, 2013) . مقایسه الگوی بیان ژن  SOS1و میزان Na⁺ در ژنوتیپ‌ها نشان داد که همزمان با افزایش بیان ژنSOS1 ، از میزان تجمع Na⁺ دربافت‌ها کاسته­شده؛ به همین دلیل به نظر می‌رسد که پروتئینSOS1  می‌تواند به عنوان مکانیسم پاکسازی Na⁺ عمل کرده و پاسخ لاین متحمل 7 در مقایسه با دیگر ژنوتیپ­ها از این نظر مطلوب­تر بود. بیان پایین SOS1 در لاین 16 بیانگر ظرفیت محدود ژنتیکی این ژنوتیپ در مهار یون Na⁺ و حساسیت بالاتر آن به شوری بود.

مطالعات زیادی در مورد SOS3 از جمله بررسی تاثیر بیان هم­زمان ژن­های مسیرSOS در افزایش تحمل گیاه نسبت به شوری انجام شده است (Xu et al., 2008;
Tiwari et al., 2020). Yousefirad et al. (2018) در بررسی تاثیر تنش شوری بر بیان ژن‌های مسیر سیگنالینگ در دو رقم متحمل موتانت و وحشی به این نتیجه رسیدند که بیان ژن SOS1 در ژنوتیپ موتانت در شرایط تنش شوری با گذشت زمان ابتدا افزایش و سپس کاهش یافت ولی در ژنوتیپ وحشی این افزایش به ترتیب به میزان کمتری بود. بیان بالای هم­زمان ژن‌های SOS1، SOS2 و  SOS3در نمونه اندام هوایی لاین متحمل به شوری تحت تنش طولانی­مدت در شکل 4 نشان می‌دهد که بیان ژن SOS1 تحت تنش شوری با مسیر تنظیمی SOS3/SOS2 تنظیم می‌شود. بیان نسبی ژنSOS3  در شرایط تنش شوری در لاین 7 با گذشت زمان افزایش یافته و لیکن در سه لاین دیگر ابتدا افزایشی و سپس کاهشی بود (شکل 4). بنابراین ژنوتیپ متحمل به شوری (لاین 7) توانایی بیشتری در بیان ژن‌های مربوط به پاسخ‌های فیزیولوژیکی و هموستازی یونی داشته و همچنین توانایی دفع Na⁺ بیشتری از درون سلول داشت. در نتیجه سبب افزایش میزان K⁺ و افزایش نسبت Na⁺/K⁺ در اندام هوایی گیاه می‌شود. چنین فرایندی تحت تنش شوری خسارت کمتری به ژنوتیپ متحمل در مقایسه با ژنوتیپ حساس وارد می‌کند.

جدول 4- تجزیه واریانس تاثیر تنش شوری بر بیان برخی ژن­های مسیر تنش شوری در ژنوتیپ­های مختلف گندم در زمان­های مختلف.

Table 4. Analysis of variance expresses the effect of salinity stress some genes of salinity stress pathway in different wheat genotypes at different times.

^**: معنی­دار در سطح احتمال یک درصد

**: Significantly difference at 1 % probability levels

شکل 4- الگوی تغییر میزان بیان ژنSOS1  (الف)، SOS2 (ب) و SOS3 (ج) اندام هوایی ژنوتیپ‌های گندم پس از یک و ده روز تنش شوری 200 میلی­مولار. ستون­هایی دارای حداقل یک حرف مشترک، اختلاف معنی­داری بر اساس آزمون دانکن در سطح احتمال پنج درصد ندارند.

Figure 4. Pattern of changes of SOS1, SOS2, and SOS3 genes expression in wheat genotypes after one and 10 days of 200 mM salinity. Columns with at least one letter in common did not have a statistically significant difference based on the Duncan test at 5%.

نتیجه­گیری کلی

شناسایی مسیرهای مولکولی و همچنین مولکول­های واسط که در انتقال و پردازش تنش در گیاهان نقش دارند بسیار مهم و اساسی است. برهمکنش بین شبکۀ پیچیدة انتقال سیگنال در گیاهان، باعث ظهور تحمل به تنش شوری می­شود. نتایج نشان داد تنش شوری باعث کاهش بیوماس اندام هوایی در کلیه لاین­ها شد که کمترین میزان کاهش بیوماس مربوط به لاین 7 بود. همچنین کمترین افزایش تجمع Na⁺ در بافت­ها، در لاین 7 مشاهده شد. بررسی بیان ژن­های SOS1، SOS2 و SOS3 نشان داد که لاین 7 در شرایط تنش شوری بیشترین میزان بیان ژن­های SOS1، SOS2 و SOS3 را دارا بوده و کمترین میزان بیان ژن­های فوق در لاین­های 16 و 8 مشاهده شد. نتایج این پژوهش پیشنهاد می­کند لاین 7 از درجه تحمل بالاتری برخوردار بوده و می‌تواند در شرایط شور، رشد رویشی و احتمالا عملکرد بالاتری داشته باشد. توصیه می‌شود این لاین در برنامه‌های اصلاحی و نیز جهت کشت در مناطق شور مورد توجه بیشتری قرار گیرد.

REFERENCES

1. Aly, A. A., Maraei, R. W., & Ayadi, S. (2018). Some biochemical changes in two Egyptian bread wheat cultivars in response to gamma irradiation and salt stress. Bulgarian Journal of Agricultural Science, 24(1), 50-59.‏
2. Ben Amar, S., Brini, F., Sentenac, H., Masmoudi, K., & Véry, A. A. (2014). Functional characterization in Xenopus oocytes of Na⁺ transport systems from durum wheat reveals diversity among two HKT1; 4 transporters. Journal of Experimental Botany,65(1), 213-222.
3. Colmer, T. D., Munns, R, & Flowers, T. J. (2005). Improving salt tolerance of wheat and barley: Future prospects. Australian Journal of Experimental Agricultural, 45, 1425–1443.
4. Feki, K., Quintero, F. J., Pardo, J. M., & Masmoudi, K. H. (2011). Regulation of durum wheat Na⁺/H⁺exchanger TdSOS1 by phosphorylation. Plant Molecular Biology, 76(6), 545–556.
5. Flowers, T. J., & Colmer, T. D. (2008). Salinity tolerance in halophytes. New Phytologist, 945-963.‏
6. Garciadeblás, B., Haro, R., & Benito, B. (2007). Cloning of two SOS1 transporters from the seagrass Cymodocea nodosa. SOS1 transporters from Cymodocea and Arabidopsis mediate potassium uptake in bacteria. Plant Molecular Biology, 63(4), 479-490.‏
7. Ghasemi Omran, V.O., A. Bagheri, G.A. Nematzadeh, A. Mirshamsi & Babaiian Jelodar, N.A. (2015). Isolation and expression analysis of Alsos1 Gene under NaCl stress in halophyte grass Aeluropus Littoralis Journal of Crop Breeding, 7(16): 60-69.
8. Ghorbani, A., Omran, V. O. G., Razavi, S. M., Pirdashti, H., & Ranjbar, M. (2019). Piriformospora indica confers salinity tolerance on tomato (Lycopersicon esculentum) through amelioration of nutrient accumulation, K⁺/Na⁺ homeostasis and water status. Plant Cell Reports, 38(9), 1151-1163.
9. ‏Hasegava, P. M. (2013). Sodium (Na⁺) homeostasis and salt tolerance of plants. Environmental and Experimental Botany, 92, 19-31.
10. Hasanuzzaman, M., Nahar, K., Rahman, A., Anee, T. I., Alam, M. U., Bhuiyan, T. F., ... & Fujita, M. (2017). Approaches to enhance salt stress tolerance in wheat. Wheat Improvement, Management and Utilization, 151-187.‏
11. Heidarvand, L. & Maali Amiri, R. (2013). Physio-biochemical and proteome analysis of chickpea in early phases of cold stress. Journal of Plant Physiology, 170:459-469.
12. Iqra, L., Rashid, M. S., Ali, Q., Latif, I., & Mailk, A. (2020). Evaluation for Na⁺/K⁺ ratio under salt stress condition in wheat. Life Science Journal, 17(7), 43-47.‏
13. Jan, A. U., Hadi, F., Nawaz, M. A., & Rahman, K. (2017). Potassium and zinc increase tolerance to salt stress in wheat (Triticum aestivum L.). Plant Physiology and Biochemistry, 116, 139-149.‏
14. Li, J., Zhou, H., Zhang, Y., Li, Z., Yang, Y., & Guo, Y. (2020). The GSK3-like kinase BIN2 is a molecular switch between the salt stress response and growth recovery in Arabidopsis thaliana. Developmental Cell, 55(3), 367-380.‏
15. Long, N. V., Dolstra, O., Malosetti, M., Kilian, B., Graner, A., Visser, R. G., & van der Linden, C. G. (2013). Association mapping of salt tolerance in barley (Hordeum vulgare). Theoretical and Applied Genetics,126(9), 2335-2351.‏
16. Maha, A., Sanaa, Mabrook, I., Amira, Y.M., & Gouda, M. A. (2017). Evaluation of some Egyptian bread wheat (Triticum aestivum) cultivars under salinity stress. Alexandria Science Exchange Journal, 38(260), 2.
17. Mohammadi Purfard, A., Nouri, M. Z., & Dehestani, A. (2017). Dissection of the molecular mechanism of salinity stress tolerance in halophyte plant, Aeluropus littoralis using AlSOS Crop Biotechnology, 15, 18-24.
18. Mokarian, K., Maali-Amiri, R., Peyghambari, S. A., Tabatabai, S. T.,‏ & Daneshmand, F. (2021). Response evaluation to salinity stress in some bread wheat genotypes using tolerance indices. Iranian Journal of Field Crop Science, 52(3), 97-111. (In Persian)
19. Oh, D. H., Gong, Q., Ulanov, A., Zhang, Q., Li, Y., Ma, W., ... & Bohnert, H. J. (2007). Sodium stress in the halophyte Thellungiella halophila and transcriptional changes in a thsos1‐RNA interference line. Journal of Integrative Plant Biology, 49(10), 1484-1496.‏
20. Parida, A. K., & Das, A. B. (2005). Salt tolerance and salinity effects on plants: A review. Ecotoxicology and Environmental Safety,60(3), 324-349.‏
21. Pask, A., Joshi, A. K., Manès, Y., Sharma, I., Chatrath, R., Singh, G. P., ... & Reynolds, M. P. (2014). A wheat phenotyping network to incorporate physiological traits for climate change in South Asia. Field Crops Research, 168, 156-167.‏
22. Pazira, E., & Homaee, M. (2010). Salt leaching efficiency of subsurface drainage systems at presence diffusing saline water table boundary: A case study in Khuzestan plains, Iran. CIGR XVIIth World Congress, 13-17 June, Québec city, Canada.
23. Pfaffl, M. W. (2007). Relative quantification in: real-time PCR, Dorak M.T. (ed). Taylor and Francis Group. U.K.
24. Pfaffl, M. W., Horgan, G. W., & Dempfle, L. (2002). Relative expression software tool (REST) for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results in real-time PCR. Nucleic Acids Research, 30(9): 36–46.
25. Qiu, Q. S., Guo, Y., Dietrich, M. A., Schumaker, K. S., & Zhu, J. K. (2002). Regulation of SOS1, a plasma membrane Na⁺/H⁺ exchanger in Arabidopsis thaliana, by SOS2 and SOS3. Proceedings of the National Academy of Sciences, 99(12), 8436-8441.‏
26. Rakei, A., Maali-Amiri, R., Zeinali, H. & Ranjbar, M. (2016). DNA methylation and physio-biochemical analysis of chickpea in response to cold stress. Protoplasma, 253(1), 61-76.
27. Ranjbar, Gh., Pirasteh-Anosheh, H., Banakr, H., & Miri, H. R. (2016). A review on halophytes researches in Iran: explanation of challenges and solutions. Journal of Plant Ecophysiology, 32, 117-129.
28. Ramadoss, D., Lakkineni, V. K., Bose, P., Ali, S., & Annapurna, K. (2013). Mitigation of salt stress in wheat seedlings by halotolerant bacteria isolated from saline habitats. SpringerPlus, 2(1), 1-7.‏
29. Rengasamy, P. (2010). Soil processes affecting crop production in salt-affected soils.Functional Plant Biology, 37(7), 613-620.‏
30. Sairam, R. K., Rao, K. V., & Srivastava, G. C. (2002). Differential response of wheat genotypes to long term salinity stress in relation to oxidative stress, antioxidant activity and osmolyte concentration. Plant science, 163(5), 1037-1046.‏
31. Sathee, L., Sairam, R. K., Chinnusamy, V., & Jha, S. K. (2015). Differential transcript abundance of salt overly sensitive (SOS) pathway genes is a determinant of salinity stress tolerance of wheat. Acta Physiologiae Plantarum, 37(8), 1-10.
32. Shabala, S. & Cuin, T. A. (2008). Potassium transport and plant salt tolerance. Physiologia Plantarum, 133(4), 651-659.
33. Shi, H.,‏ J. Quintero, J.M. Pardo & Zhu, J. K. (2002). The putative plasma membrane Na(⁺)/H(⁺) antiporter SOS1 controls long distance Na(⁺) transport in plants. Plant Cell, 14, 465-477.
34. Suo, J., Zhao, Q., David, L., Chen, S. & Dai, S. (2017). Salinity response in chloroplasts: Insights from gene characterization. International Journal of Molecular Sciences, 18(5), 1011.
35. Takahashi, R., Liu, S., & Takano, T. (2009). Isolation and characterization of plasma membrane Na⁺/H⁺ antiporter genes from salt-sensitive and salt-tolerant reed plants. Journal of Plant Physiology, 166(3), 301-309.‏
36. Tiwari, B. K., Aquib, A., & Anand, R. (2020). Analysis of physiological traits and expression of NHX and SOS3 genes in bread wheat (Triticum aestivum ) under salinity stress. Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, 9, 362-366.‏
37. Tounsi, S., Feki, K., Hmidi, D., Masmoudi, K., & Brini, F. (2017). Salt stress reveals differential physiological, biochemical and molecular responses in monococcum and T. durum wheat genotypes. Physiology and Molecular Biology of Plants, 23(3), 517-528.‏
38. Xu, H., Jiang, X., Zhan, K., Cheng, X., Chen, X., Pardo, J. M., & Cui, D. (2008). Functional characterization of a wheat plasma membrane Na⁺/H⁺ antiporter in yeast. Archives of Biochemistry and Biophysics, 473(1), 8-15.‏
39. Yousefirad, S., Soltanloo, H., Ramezanpour, S. S., & Zaynali Nezhad, Kh. (2019). The study of SOS genes expression in mutant barley root under salt stress. Journal of Crop Breeding, 29, 1-8
40. Yousefirad, S., Soltanloo, H., Ramezanpour, S. S., Zaynalinezhad, K., & Shariati, V. (2018). Salt oversensitivity derived from mutation breeding improves salinity tolerance in barley via ion homeostasis. Biologia Plantarum, 62(4), 775-785.‏
41. Zeeshan, M., Lu, M., Sehar, S., Holford, P., & Wu, F. (2020). Comparison of biochemical, anatomical, morphological, and physiological responses to salinity stress in wheat and barley genotypes deferring in salinity tolerance. Agronomy, 10(1), 127.
42. ‏ Zhu, G.A., Y. Jiang, Q. Yang, J.F. Wang, J.I. Huang and H.S. Zhang. (2006). Isolation and characterization of a new Na⁺/H⁺ antiporter gene OsNHA1 from rice. Oryza sativa L. DNA Sequence, 17, 24-30
43. Zhu, M., Shabala, S., Shabala, L., Fan, Y., & Zhou, M. X. (2016). Evaluating predictive values of various physiological indices for salinity stress tolerance in wheat. Journal of Agronomy and Crop Science, 202(2), 115-124.

[1]. Compartmentalization

[2]. BioRad

[3]. Relative expression software tool