Determination of genetic and metabolic markers related to GABA shunt pathway in chickpea (Cicer arietinum L.) under cold stress

مقدمه

نخود زراعی (Cicer arietinum L.) گیاهی خودگشن و دیپلوئید (2n=2x=16)، محتوی ژنتیکی نسبتا کوچکی 740 Mbp)) دارد (Varshney et al., 2013). به­طور کلی بذر این گیاه دارای 2/31-4/16 درصد پروتئین، 0/9-6/1 درصد فیبر، 3/73-1/38 درصد کربوهیدرات و 8/6-5/1 درصد چربی است (Mantri et al., 2007). پتانسیل تولید نخود در دنیا (5 تن در هکتار) بوده؛ درحالی که تولید واقعی آن (8/0 تن در هکتار) می­باشد
FAO, 2012)). میزان سطح زیر کشت این گیاه در ایران 500189 هکتار و عملکرد در واحد سطح آن 542 کیلوگرم در هکتار است (آمارنامه کشاورزی 95-1394). پایین­بودن عملکرد نخود در ایران، غالباً به­دلیل کشت ارقام کم­محصول و حساسیت آن به تنش‌های محیطی است.

اساسی­ترین مشکل کشت بهاره نخود زراعی
 (Cicer arietinum L.) کمبود رطوبت آخر فصل و تنش خشکی است که به کاهش بهره­وری و تولید تا میزان350 کیلوگرم در هکتار منجر می‌شود. با توجه به بارندگی و وجود رطوبت در فصل­های پاییز و زمستان، امکان کشت نخود در این فصل­ها نیز وجود دارد؛ درحالی­که تنش سرما یکی از عوامل محدود­کننده توسعه کشت پاییزه می­‌باشد (et al., 2013 Kazemi Shahandashti)؛ بنابراین بهبود تحمل به تنش سرما یکی از مهمترین برنامه‌های به‌نژادی در سازگاری، بهبود تولید و عملکرد نخود زراعی است (Heidarvand et al., 2011). تنش‌های غیر زیستی از جمله سرما منجر به تجمع بیش ‌از حد گونه‌های اکسیژن فعال (ROS[1]) شده که نهایتا منجر به آسیب‌های شدید به ماکرومولکول‌های سلولی از جمله پروتئین‌ها، آنزیم‌ها و مولکول‌های اسید­نوکلئیک در سلول‌های گیاهی می‌شود (Amini et al., 2017). در طی فرایند سازگاری به تنش در جهت مقابله با تنش اکسیداتیو القا­شده توسط ROSها، میزان متابولیت‌ها در اثر تنظیم تظاهر ژن‌ها و فعالیت آنزیم‌ها تغییر می‌کند (Heidarvand & Maali-Amiri, 2013). بنابراین تحت تنش‌های غیر زیستی برنامه‌ریزی مجدد ژنوم با تغییر الگوی بیان ژن‌ها می‌تواند سبب تغییر هموستازی و متابولیسم سلولی شود.

از دیدگاه فیزیولوژیک در گیاهان، مسیر آنزیمی
 GABA shunt در تنظیم مولکولی بسیاری از فرایندهای رشد، نمو و پاسخ به تنش‌های مختلف غیر زیستی موثر است (Tavladoraki et al., 2012). این مسیر متابولیسمی از یک سو با فعالیت آنزیم گلوتامات­دکربوکسیلاز
 (GAD[2] در سنتز گاما آمینوبوتریک اسید ([3]GABA) نقش داشته و از سوی دیگر با فعالیت آنزیم GABA ترانس‌آمیناز ([4]GABA-T) این متابولیت را تجزیه می‌کند (Liao et al., 2017). مولکولGABA  یک آمینواسید آزاد[5] چهار­کربنه نیتروژن‌دار با تعداد گروه­های بار مثبت و بار منفی برابر و دارای خاصیت اتصال به ROS و حذف آنها است که به­عنوان اسموپروتکتنت (زیست­سازگارساز) غیر آنزیمی در پاسخ به تنش­های غیر زیستی سریعا سنتز و در شارکربن[6]، تنظیم اسمزی و سیتوپلاسمی، چرخه تری‌کربوکسیلیک­اسید (TCA[7])، پیام‌رسانی سلولی و محافظت در برابر تنش‌های اکسیداتیو موثر است.(Yang et al., 2011) بر اساس مطالعات انجام­شده در سلول‌های گیاهی، میزان GABA توسط دو مسیر مختلف آنزیمی GABA-Shunt و تجزیه پلی­آمین­ها [8]سنتز می‌شود (Shelp et al., 2012a). مسیر آنزیمی GABA-Shunt به­عنوان مسیر اصلی تنظیم میزان این متابولیت با فعالیت  GADو GABA-T تنظیم می­شود (Hyun et al.,2013) و مسیر تخریب PAs توسط فعالیت آنزیم­های آمین­کسیداز (AOs[9]) کاتالیز می­شود
 (Wang et al., 2016).

مطالعات انجام­شده ارتباط بین میزان GABA و آشفتگی‌های فیزیولوژیک و همچنین آثار حفاظتی این اسموپروتکتنت در پاسخ به تنش‌های محیطی را نشان داده است (Daszkowska-Golec & Szarejko, 2013; Mekonnen et al., 2016) به­طوری­که محتوی GABA در گیاهان تحت تنش‌های غیر زیستی از جمله سرما، گرما، کمبود اکسیژن[10]، مکانیکی، گیاه‌خواری، زخم و آلودگی با پاتوژن‌ها تجمع ‌یافت
 (Kinnersley & Turano, 2000; Shelp et al., 2012a). تجمع GABA نقش مهمی در بسته­شدن روزنه­های آرابیدوپسیس تحت تنش خشکی داشت
 (Mekonnen et al., 2016). در فلفل، باقلا، چای و ریشه سویا به­ترتیب تحت تنش کمبود نور، کمبود و بیشبود اکسیژن[11] و شوری با افزایش محتوی GABA آسیب­های سلولی کاهش یافت (Xing et al., 2007; Yang et al., 2011; Li et al., 2017 (. اسپری­پاشی GABA خسارت اکسیداتیو تنش سرما و کمبود اکسیژن در گوجه‌فرنگی و خربزه را کاهش داده (Malekzadeh et al., 2014; Wang et al., 2014) و باعث افزایش تحمل سرما در طی دوره انبارداری میوه‌ هلو از طریق افزایش فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان شد (Yang et al., 2011). بنابراین GABA می‌تواند به­عنوان نشانگر متابولیکی در ارزیابی تحمل به دمای پایین استفاده شود.

هر یک از عوامل محیطی، برنامه­ریزی تظاهر ژن­ها را به شکل متفاوتی تغییر می­دهد. امروزه با استفاده از فناوری­های نوین می­توان با بررسی بیان ژن­ها بخشی از پاسخ­های یاخته در سطح رونوشت (ترانسکریپتوم) را شناسایی کرد. تغییر فعالیت آنزیم­های مختلف از جمله GAD که در مسیر متابولیکGABA shunt  از طریق تجمع یون‌های هیدروژن و کلسیم سیتوسلی تحت تنش فعال شده و متابولیتGABA  را به­منظور ارائه پاسخ به شرایط تنش سنتز می­کند (Shelp et al., 2012a)، یکی از ویژگی­های یاخته گیاهی است که توسط تغییر بیان ژن رمز­کننده آن یعنی GAD1 تنظیم می­شود. بنابراین با بررسی الگوی بیان نسبی این ژن اطلاعات سودمندی درباره چگونگی تغییر فعالیت این آنزیم تحت تنش حاصل می­شود. کاهش میزان GABA و پاسخ‌های دفاعی سلول در گیاهچه جهش‌یافته آرابیدوپسیس که ژن‌های بیوسنتزکننده GAD در آن از دست رفته‌اند تایید­کننده فرضیه مشارکت آن­ها در پاسخ به تنش‌های خشکی و شوری است (Mekonnen et al., 2016;
Zarei et al., 2017).

آنزیم GABA-T (EC 2.6.1.19) از طریق کاتالیز واکنش برگشت‌پذیر تجزیه GABA به سوکسینیک سمی‌آلدئید ([12]SSA) میزان این متابولیت را در سلول تحت تنش‌های غیر زیستی تنظیم می­کند، فرایندی که توسط آلفاکتوگلوتارات (GABA-TK[13]) یا پیرووات/­گلی­اکسیلات (GABA-TP[14]/GABA-TG[15]) به­عنوان گیرنده­های آمینو به­ترتیب آمینواسیدهای گلوتامات یا آلانین/گلایسین را نیز سنتز می­کند
 (Vijayakumari & Puthur, 2016). SSA سپس با سنتز سوکسینیک­‌اسید توسط سوکسینیک ‌سمی ‌آلدئید ­دهیدروژناز([16]SSADH) ، سوبسترای لازم برای ادامه زنجیره انتقال الکترون و چرخه TCA را فراهم می‌کند .(Shelp et al., 2012a) این فرایند می­تواند به­عنوان سوبسترای متابولیک موثر در حفظ اسکلت کربنی و انتقال انرژی تحت تنش­های غیر زیستی نیز به­کار رود (Jacoby et al., 2011). با­این­وجود میزان تجمع اسمولیت‌ها بر اساس نوع، شدت و مدت زمان تنش در ژنوتیپ‌ها یا گونه‌های گیاهی متفاوت بوده به­طوری‌که بیانگر درجه تحمل گیاه به تنش است
 .(Hussain et al., 2011) H₂O₂ مولکول پیام‌رسان حیاتی با قابلیت مشارکت در فرایند‌های فیزیولوژیک گیاهی مانند پاسخ‌ سازگاری به تنش‌هاست
 (Dickinson & Forman, 2002).

هدف این پژوهش بررسی پاسخ­های متابولیکی و مولکولی سازگاری به تنش سرما در دو ژنوتیپ‌ حساس (ILC533) و متحمل (Sel96th11439) نخود زراعی است. در این راستا تغییرات بیوسنتز GABA توسط فعالیت عوامل موثر در مسیر GABA Shuntیعنی بیان ژن GAD1 و فعالیت آنزیم GABA-T به­عنوان فعالیت دفاعی چندگانه سلول در برابر تنش سرما به­منظور افزایش محتوی این متابولیت سلولی در جهت بهبود پاسخ‌های متمایز زودهنگام و دیرهنگام ژنوتیپ‌های حساس و متحمل نخود به تنش سرما همراه با H₂O₂ به­عنوان شاخص آسیب‌ سلولی مطالعه خواهد شد. شناسایی نحوه تنظیم مسیرهای متابولیسمی بیوسنتز و تجزیه GABA که بیانگر نتایج احتمالی این پژوهش هستند امکان دارد تغییرات محتوی GABA و مسیرهای بیوسنتز و تجزیه آن را به­عنوان نشانگرهای آگاهی­بخش متابولیکی به­منظور شناسایی ژنوتیپ­های متحمل به سرمای نخود پیشنهاد و همچنین منجر به استفاده احتمالی آن به صورت اسپری‌پاشی GABA در راستای بهبود تحمل و یا افزایش بقا این گیاه تحت تنش سرما در جهت برنامه‌های کشاورزی پایدار شود. همچنین بررسی ارتباط احتمالی بین منابع ایجاد آسیب تنش و عوامل دفاعی سلول به درک بهتر نحوه بهبود تحمل به تنش سرما در نخود زراعی منجر خواهد شد.

مواد و روش‌ها

مواد گیاهی و شرایط رشد

در این پژوهش از دو ژنوتیپ نخود (C. arietinum L.) کابلی) (Sel96th11439) متحمل به سرما با منشا ایکاردا و حاصل از تلاقی ژنوتیپ‌های (ILC482×ILWC182) و ILC533  حساس به سرما منشا گرفته از مصر که اجداد آن هنوز ردیابی نشده­اند (Heidarvand et al., 2011; Saeed et al., 2011)) استفاده شد. دو ژنوتیپ مذکور از موسسه تحقیقات کشاورزی دیم ایران (مراغه، آذربایجان شرقی) تهیه ‌شدند. بذور با هیپوکلریت سدیم 10 درصد به­مدت 10 دقیقه ضدعفونی شده و پس از شستشو با آب مقطر روی کاغذ صافی در پتری‌دیش با رطوبت لازم قرار گرفت. پتری‌دیش‌ها در شرایط بدون نور و دمای ˚C23 به مدت سه شبانه‌روز قرار گرفتند و پس از جوانه‌زنی، گیاهچه‌ها به گلدان‌های سایز 12 (با قطر دهانه 12 سانتی‌متر و ارتفاع ده سانتی­متر حاوی رس، ماسه و کود دامی به نسبت سه به یک به 25/0 حجمی) انتقال یافت. گلدان‌ها در اتاقک‌ رشد آزمایشگاه گروه زراعت و اصلاح نباتات دانشگاه تهران با نور دویست میکرومول بر متر مربع بر ثانیه و شرایط نوری 16 ساعت روز و هشت ساعت شب و دمای˚C 23 و رطوبت نسبی 75 درصد قرار داده شد. جهت بررسی پاسخ‌های گیاهی به تنش سرما، در روز بیست و یکم گیاهچه‌ها (با ارتفاع حدود 20 سانتی‌متر و دارای حداقل پنج شاخه به طول پنج تا هشت سانتی­متر) به اتاقک رشد (آروین تجهیز، اصفهان، ایران) با دمای
˚C 4 به­عنوان دمای LT₅₀ (Lethal Temprature 50) نخود
 (Nayyar et al., 2005; Kazemi-Shahandashti et al.,2013)  منتقل شدند و نمونه‌گیری از برگ‌­های میانی هر گیاهچه به­عنوان برگ‌های فعال از دیدگاه فیزیولوژیکی در روز اول پس از شروع تنش سرما (جهت بررسی پاسخ‌های زودهنگام) و روز ششم پس از شروع تنش (جهت بررسی پاسخ‌های دیرهنگام گیاه) انجام شد .(Rakei et al., 2016) نمونه‌گیری از گیاهچه‌ها در اتاقک رشد با دمای˚C 23 نیز به­عنوان گیاهان شاهد (زمان صفر) انجام گرفت (سن فیزیولوژیک تمام گیاهان یکسان در نظر گرفته شدHurry & Huner, 1991;
Kazemi-Shahandashti et al., 2014) ). بنابراین در این پژوهش اثر سه نوع تیمار دمایی (شامل گیاهچه‌ها در دمای˚C 23، گیاهچه‌ها یک روز و شش روز پس از تنش سرما) در دو ژنوتیپ متحمل و حساس بررسی شد.

سنجش میزان پراکسید هیدروژن  (H₂O₂)

مقدار 350 میلی‏گرم نمونه تازه برگی با نیتروژن مایع در هاون چینی به پودر تبدیل شد. پودر تهیه­شده به فالکون 15 میلی‌لیتری انتقال یافت و سپس 5 میلی‌لیتر محلول تری‌کلرواستیک­اسید یک درصد (محلول در حمام یخ) به تیوب اضافه شد و تیوب‎‌‌ها تا یکنواخت‌شدن نمونه‌ها در حمام یخ قرار داده ‌شدند. تیوب حاوی نمونه یکنواخت­شده به مدت 15 دقیقه و در دمای˚C 4 با سرعت×g 12000 سانتریفیوژ شد. سپس500 میکرو‌لیتر از مایع رویی به یک تیوب جدید حاوی یک میلی‌لیتر محلول یک­مولار یدید پتاسیم و 5/0 میلی‌لیتر بافر فسفات 10 میلی‌مولار افزوده شد و پس از چندبار وارونه­کردن تیوب در محیط تاریک برای یکنواخت­نمودن محتوی آن، مقدار جذب هر نمونه در طول موجnm 390 توسط دستگاه اسپکتروفتومتر Shimadzu UV-160, Kyoto, Japan)) اندازه‌گیری شد .(Loreto & Velikova., 2001)  نتایج به­صورت میکرومول در هر گرم وزن تر گیاه بیان شد.

سنجش میزان GABA

مقدار 250 میلی‌گرم بافت برگی در 800 میکرولیتر محلول) ECA حاوی اتانول 70 درصد حجمی/حجمی، کلروفرم و هیدروکلریک­اسید (HCl) یک­دهم مولار) به نسبت 12:5:1 حجمی) هموژنیزه و در هاون پودر شد. سپس به­مدت یک دقیقه ورتکس شد و پس از آن سانتریفوژ (10 دقیقه،˚C 4،× g 12000 (انجام شد. روشناور به تیوب جدید انتقال یافت. فرایند استخراج مجددا دو مرتبه تکرار و روشناورها باهم مخلوط شدند. روشناور به­مدت یک شبانه‌روز در دمای˚C 4 قرار گرفت. سپس فاز مایع در مدت یک ساعت در دستگاه خشک‌کن Speed Back  خشک شد. به پلیت باقی‌مانده در هر تیوب 300 میکرولیتر متانول و 2/1 میلی‌لیتر استونیتریل افزوده شد و پیش از تزریق از فیلتر 22/0 میکرومتری عبور داده شد .(Palma et al., 2015) به منظور ارزیابی کمیGABA ، 15 میکرولیتر از این محلول به سیستم Hewlett-Packard  به­طول 250 میلی­متر و قطر داخلی 6/4 میلی­متر متصل به دستگاه HPLC تزریق شد. فاز متحرک (شستشو) با سرعت 4/0 میلی­لیتر بر دقیقه از محلول آب مقطر حاوی 01/0 درصد فرمیک­اسید بود
 ( .(Oh & Choi, 2001دتکتور این دستگاه از نوع فلورومتریک و در طول موج 330 نانومتر تنظیم شد. از نمونه‌ استاندارد (محلول  GABAخالص) برای تعیین وجود GABA و تعیین غلظت آن استفاده ‌شد. نتایج به­صورت میکرومول بر میلی­گرم پروتئین بیان شد.

استخراج و سنجش فعالیت آنزیم GABA-T

دو گرم بافت برگی در شش میلی‌لیتر بافر استخراج (حاوی Tris-HCl 1/0 مولار با 1/9pH=، گلیسرول10% (حجمی/حجمی)، دی‌تیوتریتول ([17]DTT) یک میلی‌مولار، EDTA پنج میلی‌مولار،[18] PLP5/0میلی‌مولار و PMSF[19] یک میلی‌مولار) پودر و سپس سانتریفوژ
  × g15000 به‌مدت 20 دقیقه در دمای C˚4 انجام شد. از سوپرناتانت برای سنجش GABA-T استفاده شد. فعالیت آنزیمی با ترکیب­کردن 200 میکرولیتر عصاره آنزیمی با 500 میکرولیتر محلول واکنش حاوی
 Tris-HCl 50 میلی‌مولار با 8pH=، دی‌تیوتریتول 5/1 میلی‌مولار، EDTA 75/0 میلی‌مولار، PLP 1/0 میلی‌مولار و گلیسرول 10% (حجمی/حجمی)، پیروات چهار میلی‌مولار و GABA 16 میلی‌مولار سنجش شد. پس از ورتکس، محلول به‌مدت یک ساعت در دمای C˚30 قرار داده شد. برای توقف واکنش 100 میکرولیتر هیدروکلریک­اسید (HCl) 5/0 مولار و 400 میکرولیتر کلروفرم به محلول افزوده شد. به‌منظور سنجش فعالیت GABA-T، میزان آلانین سنتز­شده هر نمونه در طی این یک ساعت بر­اساس سنجش فعالیت آنزیمی آلانین‌دهیدروژناز (ADH) اندازه‌گیری شد. نمونه شاهد حاوی عصاره آنزیمی و یک میلی‌لیتر  HCl5/0 مولار و 400 میکرولیتر کلروفرم در آغاز واکنش بود. یک میلی‌لیتر محلول واکنش حاوی نمونه‌هایی که واکنش آنها پایان یافته، NAD⁺ 5/1 میلی‌مولار و 02/0 ADH باکتری باسیلیوس­سوبتیلیس (Bacillus subtilis)، (ساخت شرکت سیگما) بود. محلول واکنش 10 دقیقه در دمای ˚C 25 قرار گرفت. میزان جذب در طول موج 340 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر
 (Shimadzu UV-1603 cell positioner CPS 240A, Kyoto, Japan) قرائت شد (Deewatthanawong et al., 2010b). فعالیت آنزیم GABA-T برحسب نانومول آلانین بر میلی‌گرم وزن ‌تر گیاهچه در دقیقه بیان شد.

استخراج RNA، سنتز cDNA و واکنشQuantitative Reverse-Transcriptase PCR  (QRT-PCR)

استخراجRNA  کل سلول به­روش ترایزول با 80 میلی‌گرم نمونه‌های بافت برگی خردشده به کمک ازت مایع در هاون چینی استریل انجام گرفت. کیفیت RNA استخراج­شده توسط الکتروفورز روی ژل آگارز یک درصد تعیین شد (شکل 1). تشکیل دو باند RNA ریبوزومی S18و S25 روی ژل کیفیت بالای RNA تخلیص­شده را تایید کرد. برای بررسی کمی میزان غلظت RNA از دستگاه نانودراپ (Thermo Scientific, model 1000) در طول موج nm 260 استفاده شد. در مرحله بعد RNA استخراج­شده با آنزیم DNaseІ براساس روش پیشنهادی شرکت فرمنتاز تیمار شد. دو میکروگرم RNA، یک میکرولیتر بافر، یک واحد (u) آنزیم DNaseІ و 10 واحد (u)  آنزیمRNase inhibitor ، مخلوط و با افزودن آبDEPC  حجم محلول به 10 میکرولیتر رسانده شد و به­مدت 30 دقیقه در دمای˚C 37 قرار گرفتند. سپس یک میکرولیتر EDTA به تیوب‌ها اضافه ‌شد و به­مدت 10 دقیقه در دمای˚C 65 قرار داده ‌شدند. تیوب‌ها در
˚C 80- نگه‌داری شدند. به­منظور ساخت cDNA، پنج میکرولیتر RNA تیمار­شده با DNase با کمک آغازگر الیگو دی تی (یک پیکومول) (18-20 نوکلئوتید) مخلوط و حجم محلول با استفاده از آب DEPC به 11 میکرولیتر رسانده شد. این مخلوط به­مدت پنج دقیقه در دمای
˚C 70 قرار گرفت و پس از آن روی یخ سرد شد. سپس چهار میکرولیتر بافر واکنش و دو میکرولیتر دی‌اکسی­نوکلئوتری فسفات (dNTPs) با غلظت 10 میکرومول و 20 واحد آنزیم  RNase inhibitorبه هر تیوب اضافه شد. حجم محلول با آب DEPC به 19 میکرولیتر رسانده و به­مدت پنج دقیقه در دمای ˚C37 قرار داده شد. بعد از آن 200 واحد (u) آنزیم Revert Aid M-Mulv  به این محلول افزوده و پس از مخلوط­کردن به­مدت یک ساعت در دمای˚C 42 قرار داده‌شد. سپس برای غیر فعال­کردن واکنش، تیوب‌ها به مدت 10 دقیقه در دمای˚C 70 قرار گرفتند. به‌منظور تایید سنتز cDNA از روش تکثیر ژن خانه‌دار
 اکتین 1(Peng et al., 2010) (Actin1)  از ژنوم نخود روی cDNA ساخت­شده (پس از رقیق‌سازی و رساندن غلظت cDNA سنتز­شده به 200 نانوگرم در میکرولیتر) توسط   PCRو الکتروفورز آن روی ژل آگارز یک درصد استفاده شد. نتایج حاکی از مطابقت اندازه باند مشاهده­شده با اندازه ژن خانه‌دار  bp)189) بود. 1145 نانوگرم در میکرو لیتر RNA برای سنتز cDNA استفاده شد. مقدار 20 میکرولیتر مخلوط واکنش شامل 10 میکرولیتر کیت حاوی رنگ فلورسنت Evagreen، سه میکرولیتر آب مقطر استریل، یک میکرولیتر از هر یک از آغازگرهای اختصاصی مستقیم و معکوس با غلظت 10 میکرومول و پنج میکرولیتر نمونه cDNA سنتز­شده با غلظت 250 نانوگرم در میکرولیتر (رقیق­شده با نسبت 1:20) بررسی شد. برای هر واکنش دو تکرار زیستی و سه تکرار تکنیکی استفاده شد. پس از آماده­کردن مخلوط واکنش، پلیت مورد نظر به دستگاه iQ5 منتقل شد و واکنش زنجیره‌ای پلیمراز به­این­صورت انجام گرفت: 2 دقیقه در دمای ˚C94 و 35 تکرار با چرخه‌های 10 ثانیه در دمای˚C 95، 10 ثانیه در دمای˚C 57 Tm آغازگر و 10 ثانیه در دمای ˚C72. تایید اختصاصی­بودن قطعات تکثیر­شده با­استفاده از تجزیه و تحلیل منحنی ذوب انجام شد. منحنی ذوب با خنک­شدن تا دمای ˚C55 با سرعت˚C 20 در ثانیه ثبت شد، سپس در دمای˚C 55 به مدت 30 ثانیه ثابت ماند و سپس با گرمایش آهسته با سرعت˚C 5/0 در ثانیه تا دمای ˚C95 افزایش یافت. فلورسانس به­طور مداوم در طول دوره افزایش آهسته دما برای نظارت بر تفکیک رنگ Evagreen اندازه­گیری شد. ترسیم سیگنال­های فلورسانس به­طور خودکار در زمان واقعی و در مقابل دما برای ایجاد منحنی­های ذوب انجام گرفت. بر اساس منحنی­های استاندارد رسم­شده حاصل از پنج سریال رقت (1، 1:10، 1:20، 1:50 و 1:100) کارایی PCR در تمام آغازگرها در حدود 9/1 تا 2 بود و شیب خط رگرسیون بین و23/3- و 42/3- بود
 Pfaffl, 2001)). نسبت بیان نسبی هر توالی با­توجه­به شاخص Cq محاسبه شده که میانگین کارآیی PCR ژن­های خانه­دار مورد نظر در Plate را در­بر­می­گیرد. با­توجه­به نتایج منحنی­های استاندارد، از نرم­افزار  REST می­توان برای محاسبه نسبت بین میزان ژن هدف و ژن خانه‌دار (Actin1) در هر نمونه مشخص با روش^-ΔΔCT 2 به­عنوان بیان نسبی آن ژن استفاده کرد
 .(Livak & Schmittgen, 2001) در این روش بیان ژن مورد نظر با بیان Actin1که یک ژن خانه‌دار تنظیم شده است نرمال شده و سپس از مقادیر نرمال­شده برای مقایسه بیان متفاوت ژن­ها در نمونه­های مختلف استفاده شد. طراحی آغازگر برای ژن اختصاصی GAD1و ژن خانه‌دار Actin1با­استفاده از تارنمای Integrated DNA Technologies, Inc. (IDT) به آدرس (https://www.idtdna.com) برای دست­یابی به آغازگرهای دارای خصوصیات مناسب انجام گرفت. در جدول 1 نام آغازگرهای ژن‌های اختصاصی و خانه­دار، توالی و شماره دسترسی آنها ارائه شده است.

تجزیه و تحلیل آماری

این مطالعه بر اساس آزمایش فاکتوریل در قالب طرح کاملا تصادفی با سه تکرار زیستی برای آزمایش‌های بخش فیزیولوژی و دو تکرار زیستی و سه تکرار تکنیکی برای آزمایش‌های بخش بیان نسبی ژن GAD1 انجام شد و آزمون مقایسة میانگین به روش دانکن (01/0P<) و با نرم­افزار SAS 9.4 انجام شد.

نتایج و بحث

بر اساس نتایج تجزیه واریانس تفاوت معنی‌داری بین تیمارهای آزمایشی از نظر میزان H₂O₂، GABA، بیان ژن‌ GAD1 و فعالیت آنزیم‌‌ GABA-T (01/0P<) وجود داشت (جدول 2).

شکل 1- نگاره نوارهای RNA استخراج­شده. از چپ به راست به­ترتیب: 1) نشانگر اندازه با نوارهای مشخص­شده، 2 و 3) ژنوتیپ متحمل و حساس شاهد، 4 و 5) ژنوتیپ متحمل و حساس روز اول تنش سرما

Figure 1. Extracted RNA. From left to right: 1) 100 bp DNA size marker, Fermentas; 2,3)
tolerant and sensitive genotypes under control conditions and 4,5) tolerant and sensitive
genotypes on the first day of cold stress.

جدول 1- توالی‌های آغازگر استفاده شده در واکنش زنجیره‌ای پلیمراز در زمان واقعی.

Table 1. Primer sequences used in qRT-PCR amplification.

جدول 2- تجزیه واریانس صفات مورد مطالعه در دو ژنوتیپ حساس و متحمل نخود زراعی در سطوح مختلف تنش سرما.

Table 2. Variance analysis of studied traits of tolerant (Sel96th11439) and susceptible (ILC533) chickpea genotypes under cold stress.

میزان تجمع H₂O₂ که یکی از مهمترین شاخص‌های تنش اکسیداتیو در سلول می‌باشد
 (Kazemi Shahandashti & Maali Amiri, 2018)، تحت تنش سرما در ژنوتیپ حساس در مقایسه با ژنوتیپ متحمل بیشتر بود (حداکثر بیش از 69 % در روز ششم تنش). در ژنوتیپ متحمل میزان H₂O₂ پس از افزایش معنی‌دار در روز اول تنش، در روز ششم کاهش یافته، بطوری‌که تجمع آن در مقایسه با شرایط شاهد به طور معنی­داری کمتر شد (بیش از 7/4%)، در­حالی­که تجمع آن در ژنوتیپ حساس در مقایسه با شرایط شاهد به طور پیوسته افزایش یافت (تا 50%) (شکل 2). بنابراین درجه تحمل به تنش سرما در دو ژنوتیپ نخود با یکدیگر متفاوت بوده به­طوری که این نتایج بیانگر ارتباط احتمالی تاثیر پاسخ‌های دفاعی ژنوتیپ‌های نخود می‌باشد.

میزان GABA تحت تنش در ژنوتیپ متحمل در مقایسه با شاهد افزایش معنی­داری یافت به طوری‌که بیشترین میزان آن در روز ششم تنش مشاهده شد (تا 89%) (شکل 3-الف). در ژنوتیپ حساس نیز میزان GABA در روز ششم تنش در مقایسه با شاهد افزایش معنی­داری یافت (44/44 درصد) اگر چه تجمع آن در ژنوتیپ متحمل هم در شرایط شاهد (33 درصد) و هم تحت تنش (80- 74 درصد) به طور معنی­داری در مقایسه با ژنوتیپ حساس بیشتر بود (شکل 3-الف). این نتایج با یافته‌های Shelp et al., (2012a) در خصوص افزایش میزان GABA تحت تنش­های غیر زیستی مطابقت داشت. افزایش میزانH₂O₂  در پاسخ‌های زودهنگام و کاهش معنی‌دار آن در روز ششم تنش سرما در ژنوتیپ متحمل (شکل 2) بیانگر نقش پیام‌رسانی  H₂O₂ در القا پاسخ‌های دفاعی سلول‌های گیاهی می‌باشد که با افزایش میزان GABA مطابقت دارد. همانطور می­دانید ROSها به عنوان مولکول­های پیام­رسان ثانویه در سلول­های یوکاریوتی ایفای نقش می­کنند
 (Kazemi-Shahandashti & Maali-Amiri, 2018). لذا افزایش اولیه آنها در پاسخ­های زودهنگام می­تواند در القای پاسخ­های دفاعی سلول تحت تنش ضروری باشد. بنابراین ژنوتیپ­های متحمل هم پاسخ­های اولیه و هم پاسخ­های دیرهنگام مطلوبی به شرایط تنش­زای محیطی نشان می­دهند (Hannah et al., 2005;
Heidarvand & Maali-Amiri, 2013).

شکل 2- تغییر میزان H₂O₂ در ژنوتیپ‌های متحمل Sel96th11439 (ستون سیاه) و حساس ILC533 (ستون خاکستری) نخود تحت تیمارهای دمایی شامل دمای طبیعی (°C23)، روزهای اول و ششم تنش سرما (°C4). حروف متفاوت نشان­دهنده اختلاف معنی­دار بین میانگین­ها براساس مقایسه میانگین دانکن.

Figure 2. Change in hydrogen peroxide (H₂O₂) content in the leaves of tolerant (Sel96th11439) and susceptible (ILC533) chickpea genotypes (black and light gray bars, respectively) grown under control (23°C), day 1 and 6 of cold stress (4°C) (DPT). Different letters indicate a significant difference among the means based on the comparison of the average Duncan.

در گیاهان بخشی از سازگاری‌ به تنش در نتیجه کاهش میزان ROS سلولی در اثر تنظیم میزانGABA ، از طریق مسیرهای تخریب PAs توسط فعالیت آنزیم­های پلی­آمین­اکسیداز (PAO) و دی­آمین­اکسیداز (DAO) همراه با تولید H₂O₂ (Alcazar et al., 2010;
Amini et al., 2021) و همچنین تنظیم سنتز آن (فعالیت آنزیمی GAD) و یا تغییر در فعالیت مسیر تجزیه آن (فعالیت آنزیمی GABA-T) ایجاد می‌شود (Xing et al., 2007). نتایج نشان داد که در شرایط شاهد محتوی GABA بر­خلاف فعالیت آنزیم‌ GABA-T در ژنوتیپ متحمل بیشتر از ژنوتیپ حساس بود (شکل 3-الف و ج). تحت تنش سرما محتوی GABA و بیان ژن‌ GAD1 (حداکثر تا 17 برابر در ژنوتیپ متحمل) در هر دو ژنوتیپ افزایش یافت (شکل 3-الف و ب) به­ طوری‌که این افزایش در ژنوتیپ متحمل در مقایسه با ژنوتیپ حساس معنی‌دار بود، در­حالی­که تحت تنش سرما فعالیت آنزیم‌ GABA-T در ژنوتیپ حساس به طور پیوسته کاهش و در ژنوتیپ متحمل در روز ششم تنش در مقایسه با شاهد به طور پیوسته کاهش یافت (حداکثر تا 8/2 برابر در ژنوتیپ حساس)، (شکل 3-ج) چنین نتایجی توجیه­کننده محتوی کمتر GABA در ژنوتیپ حساس در مقایسه با ژنوتیپ متحمل در شرایط شاهد و تحت تنش سرما و همچنین بیانگر ظرفیت ژنتیکی فعال‌تر ژنوتیپ متحمل در جهت تولید یا حفظ محتوی GABA برای مقابله با آثار مخرب ROS سلولی است.

گزارش شده که میزان GABA در گیاهان تحت تنش‌های زیستی و غیر زیستی (از جمله کمبود اکسیژن، سرما، گرما و آسیب‌های مکانیکی و گیاه‌خواری، زخم و آلودگی با پاتوژن‌ها) تجمع می‌یابد .(Shelp et al., 2012a) بنابراین به نظر می‌رسد در نخود زراعی ارتباط معنی‌داری بین میزان آسیب سرما) از جمله نتایج (H₂O₂ و افزایش میزان GABA وجود دارد و این متابولیت به­ عنوان اسموپروتکتنت سلولی در پاسخ به تنش­های زیستی و غیر زیستی ایفای نقش می‌کند  .(Bouchereau et al., 1999) همچنین این یافته­ها با نتایج
 (Malekzadeh et al., 2014; Wang et al., 2014;
Yang et al., 2011) در مورد اثر محلول‌پاشی GABA بر کاهش خسارت اکسیداتیو، تسریع افزایش پایداری غشا و افزایش فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان گوجه‌فرنگی، خربزه و میوه‌ هلو تحت تنش سرما و کمبود اکسیژن همخوانی داشت. تحت تنش‌های محیطی القا سنتزGABA از طریق سازوکارهای مختلفی از جمله فعال‌سازی GAD وابسته به تغییر غلظت یون کلسیم/کالمودولین و یا اسیدی شدنpH  فضای سیتوسول به دنبال اختلالات مکانیکی یا متابولیکی ناشی از تنش افزایش می‌یابد .(Kinnersley & Turano, 2000) بنابراین محتمل است که تغییر شرایط محیطی و تعادل اکسیداسیون/ احیا سلول تحت تنش مستقیما بر فعالیت مسیرهای متابولیک تنظیم میزان GABA موثر باشد. تحت تنش کمبود و بیشبود اکسیژن و شوری به­ترتیب در گیاهان باقلا، چای و ریشه سویا بخش اعظمی از GABA توسط فعالیت آنزیم GAD سنتز می‌شود (Xiang et al., 2007; Yang et al., 2011).

از آنجا که محتوی این متابولیت در سطح رونویسی و ترجمه تنظیم می­شود، لذا به منظور دستیابی به اساس مولکولی چگونگی تغییر متابولیت GABA در پاسخ به تنش سرما، بیان نسبی ژن‌ GAD1 بررسی شد؛ زیرا ژن مذکور رمز­کننده آنزیم GAD و یکی از اجزای شبکه متابولیک پاسخ به تنش‌های محیطی است
 (Mekonnen et al., 2016). مطابق با الگوی تغییر GABA تحت تنش سرما، بیان ژن GAD1 تحت تنش سرما در مقایسه با شاهد در ژنوتیپ حساس و متحمل به­طور پیوسته افزایش یافت، به‌طوری­که میزان بیان نسبی این ژن در ژنوتیپ متحمل در روز ششم تنش سرما 17 برابر در مقایسه با شاهد بود (شکل 3-ب). بیان این ژن در ژنوتیپ حساس در روز اول و ششم تنش سرما در مقایسه با شاهد به ترتیب 5/1 و دو برابر افزایش یافت (شکل 3-ب).

این نتایج بیانگر القا موثرتر فعالیت ژنوم در سطح رونویسی به‌منظور آماده­سازى گیاه براى رویارویى با دماهاى پایین­تر به موازات بروز کمترین خسارت می­باشد. همچنین میزان بیان نسبی این ژن در روز اول تنش در ژنوتیپ متحمل 5/8 برابر بیشتر از ژنوتیپ حساس بود که حاکی از موثرتر­بودن این مسیر در ژنوتیپ متحمل در مقایسه با ژنوتیپ حساس در جهت القا تحمل به سرما بود. همچنین بیان نسبی این ژن با نتایج میزان GABA تحت تنش مطابقت داشت که نشان می‌دهد تنظیم بیان ژن در سطح رونویسی در امتداد با تنظیم میزان متابولیت مسئول پاسخ به سرما در نخود بوده، مشاهداتی که توسط نتایج شاخص‌ آسیب سلولی نیز تایید شد. از دست رفتن پروتئین­های AtGAD در آرابیدوپسیس جهش‌یافته سبب کاهش میزان GABA و پاسخ‌های دفاعی سلول در مقایسه با گیاهان شاهد (تیپ وحشی) تحت تنش­های خشکی و شوری شد (Mekonnen et al., 2016;
Zarei et al., 2017) که بیانگر نقش کلیدی مسیر تبدیل گلوتامات به GABA در پاسخ به تنش‌های غیر زیستی است. بنابراین با توجه به نتایج به­دست­آمده، القای این ژن در گیاهان متحمل در اثر برنامه­ریزی مجدد بیان ژن­ها و هوموستازی سلولی نقش موثری در ایجاد الگوی پاسخ‌های سازگاری به تنش سرما ایفا می‌کند.

کاهش فعالیت GABA-T تحت تنش، باعث ایجاد تغییر معنی‌دار در شاخص خسارت سلولی و محتوی GABA به­منظور سازگاری به سرما بخصوص در گیاهان متحمل شد (شکل‌ 3-ج). میزان فعالیت این آنزیم در شرایط شاهد در ژنوتیپ حساس به طور معنی‌داری بیشتر از ژنوتیپ متحمل بود (تا دوبرابر). همچنین مطابق با تغییرات محتوی GABA تحت تنش، میزان فعالیت GABA-T در هر دو ژنوتیپ‌ حساس و متحمل نخود تحت تنش سرما در مقایسه با شاهد به­طور پیوسته کاهش یافت (حداکثر 8/2 برابر در ژنوتیپ حساس در روز ششم تنش) (شکل 3-ج). این روند نزولی در ژنوتیپ حساس در مقایسه با ژنوتیپ متحمل چشمگیرتر بود
 ( 04/2 برابر) (شکل 3-ج). نرخ سریع کاهش فعالیت این آنزیم تحت تنش در ژنوتیپ حساس در مقایسه با متحمل احتمالا به­دلیل تلاش ناکارامد حتی در ژنوتیپ حساس برای حفظ هموستازی سلولی است، نتایجی که با روند تغییرات GABA و H₂O₂ تحت تنش سرما نیز مطابقت داشت (شکل 3-الف).

شکل 3- تغییر میزان گاما­آمینوبوتریک­اسید (GABA) (الف)، بیان ژن GAD1 (ب)، فعالیت آنزیم گابا­ترانس­آمیناز (GABA-T) (ج) در ژنوتیپ‌های متحمل Sel96th11439 (ستون سیاه) و حساس ILC533 (ستون خاکستری) نخود تحت تیمارهای دمایی شامل دمای طبیعی ( °C23)، روزهای اول و ششم تنش سرما ( °C4). حروف متفاوت نشان­دهنده اختلاف معنی­دار بین میانگین­ها براساس مقایسه میانگین دانکن.

Figure 3. Changes in γ-Aminobutyric acid (GABA) content, Glutamate decarboxylase 1 (GAD1) gene expression and GABA transaminase (GABA-T) enzyme activity and in the leaves of tolerant (Sel96th11439) and susceptible (ILC533) chickpea genotypes (black and light gray bars, respectively) grown under control (23 °C), day 1 and 6 of cold stress (4 °C) (DPT). Different letters indicate a significant difference among the means based on the comparison of the average Duncan.

روند متضاد تغییرات فعالیت آنزیم GABA-T با الگوی محتوی GABA و تغییرات بیان نسبی ژن GAD1 موید نقش محافظت­کننده این متابولیت به­عنوان یکی از مسیرهای پاسخ به تنش سرماست (شکل 3-الف، ب، ج) که بر اساس نتایج تحقیقات پیشین (Amini et al., 2020) در نخود تحت تنش سرما علاوه­بر تنظیم توسط مسیر GABA shunt توسط مسیر تخریب پلی­آمین­ها نیز سنتز می­شود؛ بنابراین به­نظر می­رسد که در نخود زراعی تحت تنش سرما به­منظور تنظیم محتوی GABA هر دو مسیرGABA shunt  و تخریب پلی­آمین­ها فعال هستند. این نتایج با یافته‌هایPalma et al.  (2014, 2015) که گزارش کردند تحت تنش سرما در مقایسه با شاهد در میوه Zucchini، با کاهش فعالیت GABA-T، محتوی GABA افزایش یافته و گزارش
 ((Ditomaso et al., 1992 که به نقش اسپری‌پاشی Gabaculine (بازدارنده آنزیم GABA-T) در تحریک تجمع  GABAاشاره دارد، همخوانی داشت. بنابراین، به­نظر می‌رسد کاهش معنی‌دار فعالیت آنزیم‌ تجزیه‌‌کننده GABA با کاراتر کردن مسیرهای متابولیکی پاسخ به سرما می‌تواند در بهبود تحمل گیاه به تنش‌های غیر زیستی از جمله سرما نقش داشته باشد. همچنین وجود روند متضاد بین فعالیت GABA-T و بیان نسبی GAD1 (شکل 3-ب، ج) تایید­کننده عملکرد متضاد این دو مسیر در تنظیم محتوی GABA است. تحت تنش سرما کاهش شدیدتر فعالیت این آنزیم در ژنوتیپ حساس در مقایسه با متحمل بیانگر تلاش سلول حتی در ژنوتیپ حساس به منظور حفظ محتوی GABA و مبارزه با آثار مخرب آسیب‌های سلولی است، با­این­وجود سلول­های این گیاه ظرفیت جبران عدم کارایی در سنتز GABA (شکل 3-الف، ب) را نداشته­اند. نتایج شاخص‌های خسارت سلولی نیز موید چنین فرضیه‌ای می‌باشد (شکل 2). همچنین در امتداد با نقش حیاتی مسیر بیوسنتز GABA، مسیر تجزیه آن نیز از اهمیت زیادی در تنظیم میزان این متابولیت‌ برخوردار است. تحت تنش‌های محیطی محصولات تجزیه GABA با ورود به چرخه TCA و زنجیره انتقال الکترون در سنتز اسکلت‌ کربنی و انتقال انرژی برای ایجاد هموستازی جدید مشارکت می‌کنند (Jacoby et al., 2011). فرایندی که در اولین مرحله آن به موازات تبدیل GABA به SSA توسط GABA-T، آلفاکتوگلوتارات (GABA-TK) یا پیروات/گلی‌اکسیلات (GABA-TG /GABA-TP) به‌عنوان گیرنده‌های آمینو به‌ترتیب آمینواسیدهای گلوتامات یا آلانین/گلایسین را نیز سنتز می‌کند (Vijayakumari & Puthur, 2016). بنابراین نتایج این پژوهش، الگوی متمایز فعالیت آنزیم‌ GABA-T در ژنوتیپ‌های حساس و متحمل و همچنین در شرایط شاهد و تحت تنش سرما در نخود زراعی را نشان داده، به­طوری‌‌که مطالعه فعالیت این آنزیم‌ به‌عنوان عامل موثر در تجزیه GABA در شرایط آزمایش تاییدکننده اختلافات در تجمع این متابولیت‌ به‌عنوان شاخص‌ تحمل در برابر عوامل آسیب­های سلولی (نتایج H₂O₂)‌ در ژنوتیپ‌های نخود تحت تنش سرما است. قابل ذکر است که در ژنوتیپ حساس نیز تحت تنش سرما اغلب افزایش معنی­دار در میزان فعالیت مسیرهای دفاعی در این پژوهش به موازات ژنوتیپ متحمل مشاهده شد. به نظر می­رسد ژنوتیپ حساس نیز در جهت پاسخ به تنش سرما و القا سازوکار­های دفاعی تلاش کرده اما به­دلیل پاسخ­گویی ناکارآمد در مسیرهای دفاعی قادر به مهار ROS نبوده؛ لذا این چنین سلولی قادر به بقا نخواهد بود.

نتیجه­ گیری کلی

ارتباط شاخص آسیب سلولی (H₂O₂) و محتوی GABA در این آزمایش غیر همسو بود، به­طوری­که تجمع این متابولیت‌ها در ژنوتیپ متحمل به موازات بیان ژن GAD1 و فعالیت آنزیم‌ GABA-T با کاهش آسیب سلولی در ارتباط بود (شکل‌های 1 و 2). به­منظور بهبود تحمل تنش سرما در نخود، بیوسنتز GABA توسط تنظیم دقیق فعالیت عوامل مختلف موثر در مسیر GABA shunt که شامل مسیر بیوسنتز این متابولیت (افزایش بیان نسبی ژن GAD1) و همچنین مسیر تجزیه آن (کاهش فعالیت آنزیم GABA-T) است، افزایش می­یابد. پاسخ‌های متمایز زودهنگام و دیرهنگام ژنوتیپ‌ها به تنش سرما بیانگر راهبرد چندگانه دفاعی سلولی نخود به تنش سرما بود. این یافته که گیاهان نخود دارای تجمع بیشتر GABA (به‌عنوان اسموپروتکتنت سلولی) با کاهش میزان آسیب‌های سلولی، تحمل بیشتری به تنش سرما دارد، ممکن است تغییر محتوی GABA و مسیرهای مختلف بیوسنتز و تجزیه آن را به­عنوان نشانگرهای آگاهی بخش متابولیکی به­منظور شناسایی ژنوتیپ­های متحمل به سرمای نخود پیشنهاد کرده و همچنین به توانایی بقا و یا بهبود تحمل تنش سرما در این گیاه تحت تنش سرما بینجامد. مطالعه این فرایندها که غالباً همراه با القای سامانه­های دفاعی خواهد بود، به درک بهتر نحوه بهبود تحمل به تنش سرما در نخود زراعی منجر خواهد شد. با انجام مطالعات تکمیلی در ژنوتیپ­های نخود به نظر می­رسد کاربرد GABA در جهت بهبود تحمل به تنش سرما در برنامه‌های کشاورزی پایدار نخود استفاده شود. با­توجه­به چالش­های زیست­محیطی، آثار کاربرد اسپری‌پاشی GABA، بر عملکرد و کیفیت نخود باید به­طور جامع مطالعه شود.

REFERENCES

1. Amini, S., & Maali, R. (2020). Evaluation of gama-aminobutyric acid (GABA) biosynthetic pathway in chickpea under cold stress. Agricultural Biotechnology Journal, 12(3), 1-24. (In Persian)
2. Amini, S., Maali-Amiri, R., Kazemi-Shahandashti, S. S., López-Gómez, M., Sadeghzadeh, B., Sobhani-Najafabadi, A., & Kariman, K. (2021). Effect of cold stress on polyamine metabolism and antioxidant responses in chickpea. Journal of Plant Physiology, 258, 153387.
3. Amini, S., Maali-Amiri, R., Mohammadi, R., & Kazemi-Shahandashti, S. S. (2017). cDNA-AFLP analysis of transcripts induced in chickpea plants by TiO₂ nanoparticles during cold stress. Plant Physiology and Biochemistry, 111, 39-49.
4. Bouchereau, A., Aziz, A., Larher, F., & Martin-Tanguy, J. (1999). Polyamines and environmental challenges: Recent development. Plant Science, 140(2), 103-125.
5. Daszkowska-Golec, A., & Szarejko, I. (2013). Open or close the gate–stomata action under the control of phytohormones in drought stress conditions. Frontiers in Plant Science, 4, 138.
6. Deewatthanawong, R., Nock, J. F., & Watkins, C. B. (2010b). γ-Aminobutyric acid (GABA) accumulation in four strawberry cultivars in response to elevated CO₂ storage. Postharvest Biology and Technology, 57(2), 92-96.
7. Dickinson, D. A., & Forman, H. J. (2002). Cellular glutathione and thiols metabolism. Biochemical Pharmacology, 64(5-6), 1019-1026.
8. DiTomaso, J. M., Hart, J. J., & Kochian, L. V. (1992). Transport kinetics and metabolism of exogenously applied putrescine in roots of intact maize seedlings. Plant Physiology, 98(2), 611-620.
9. Heidarvand, L., Amiri, R. M., Naghavi, M. R., Farayedi, Y., Sadeghzadeh, B., & Alizadeh, K. H. (2011). Physiological and morphological characteristics of chickpea accessions under low temperature stress. Russ. Journal of Plant Physiology, 58(1), 157-163.
10. Heidarvand, L., & Maali-Amiri, R. (2013). Physio-biochemical and proteome analysis of chickpea in early phases of cold stress. Journal of Plant Physiology, 170(5), 459-469.
11. Hurry, V.M., & Huner, N.P.A. (1991). Low growth temperature effects a differential inhibition of photosynthesis in spring and winter wheat. Plant Physiology, 96,491–497.
12. Hussain, S.S., Ali, M., Ahmad, M., & Siddique, K.H. (2011). Polyamines: Natural and engineered abiotic and biotic stress tolerance in plants. Biotechnology Advances, 29, 300-311.
13. Hyun, T. K., Eom, S. H., Jeun, Y. C., Han, S. H., & Kim, J. S. (2013). Identification of glutamate decarboxylases as a γ-aminobutyric acid (GABA) biosynthetic enzyme in soybean. Industerial Crops and Products, 49, 864-870.
14. Jacoby, R. P., Taylor, N. L., & Millar, A. H. (2011). The role of mitochondrial respiration in salinity tolerance. Trends in Plant Science, 16(11), 614-623.
15. Kazemi-Shahandashti, S.S., Maali-Amiri, R., Zeinali, H., Khazaei, M., Talei, A., & Ramezanpour, S.S. (2013). Effect of short-term cold stress on oxidative damage and transcript accumulation of defense-related genes in chickpea seedlings. Journal of Plant Physiology, 171:1106-1116.
16. Kazemi-Shahandashti, S. S., & Maali-Amiri, R. (2018). Global insights of protein responses to cold stress in plants: Signaling, defence, and degradation. Journal of Plant Physiology, 226, 123-135.
17. Kazemi-Shahandashti, S. S., Maali-Amiri, R., Zeinali, H., Khazaei, M., Talei, A., & Ramezanpour, S. S. (2014). Effect of short-term cold stress on oxidative damage and transcript accumulation of defense-related genes in chickpea seedlings. Journal of Plant Physiology, 171(13), 1106-1116.
18. Kinnersley, A. M., & Turano, F. J. (2000). Gamma aminobutyric acid (GABA) and plant responses to stress. Critical Review in Plant Science, 19(6), 479-509.
19. Li, Y., Fan, Y., Ma, Y., Zhang, Z., Yue, H., Wang, L., & Jiao, Y. (2017). Effects of exogenous γ-aminobutyric acid (GABA) on photosynthesis and antioxidant system in pepper (Capsicum annuum L.) seedlings under low light stress. Journal of Plant Growth Regulation, 36(2), 436-449.
20. Liao, J., Wu, X., Xing, Z., Li, Q., Duan, Y., Fang, W. & Zhu, X. (2017). γ-Aminobutyric Acid (GABA) accumulation in tea (Camellia sinensis L.) through the GABA shunt and polyamine degradation pathways under anoxia. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 65(14), 3013-3018.
21. Livak, K.J., & Schmittgen, T.D. (2001). Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2^−ΔΔCT method. Methods, 25, 402–408.
22. Loreto, F., & Velikova, V. (2001). Isoprene produced by leaves protects the photosynthetic apparatus against ozone damage, quenches ozone products, and reduces lipid peroxidation of cellular membranes. Plant Physiology, 127(4), 1781-1787.
23. Malekzadeh, P., Khara, J., & Heydari, R. (2014). Alleviating effects of exogenous gamma-aminobutiric acid on tomato seedling under chilling stress. Physiology and Molecular Biology of Plants, 20(1), 133-137.
24. Mantri, N. L., Ford, R., Coram, T. E., & Pang, E. C. (2007). Transcriptional profiling of chickpea genes differentially regulated in response to high-salinity, cold and drought. BMC Genomics, 8(1), 303.
25. Mekonnen, D. W., Flügge, U. I., & Ludewig, F. (2016). Gamma-aminobutyric acid depletion affects stomata closure and drought tolerance of Arabidopsis thaliana. Plant Science, 245.
26. Nayyar, H., Satwinder, K., Kumar, S., Singh, K.J., & Dhir, K.K. (2005). Involvement of polyamines in the contrasting sensitivity of chickpea (Cicer arietinum L.) and soybean (Glycine max (L.) Merrill.) to water deficit stress. Botanical Bulletin of Academia Sinica, Sin 46.
27. Oh, S. H., & Choi, W. G. (2001). Changes in the levels of γ-aminobutyric acid and glutamate decarboxylase in developing soybean seedlings. Journal of Plant Resources, 114(3), 309-313.
28. Palma, F., Carvajal, F., Jamilena, M., Garrido, D. (2014). Contribution of polyamines and other related metabolites to the maintenance of zucchini fruit quality during cold storage. Plant Physiology and Biochemistry, 82, 161–171.
29. Palma, F., Carvajal, F., Ramos, J. M., Jamilena, M., Garrido, D. (2015). Effect of putrescine application on maintenance of zucchini fruit quality during cold storage: Contribution of GABA shunt and other related nitrogen metabolites. Postharvest Biology and Technology, 99, 131-140.
30. Peng, H, Cheng, H, Yu, X. et al. (2010). Molecular analysis of an actin gene, CarACT1, from chickpea (Cicer arietinum L.). Molecular Biology Reports, 37, 1081.
31. Pfaffl, M. W. (2001). A new mathematical model for relative quantification in real-time RT–PCR. Nucleic Acids Research, 29(9), e45-e45.
32. Rakei, A., Maali-Amiri, R., Zeinali, H., & Ranjbar, M. (2016). DNA methylation and physio-biochemical analysis of chickpea in response to cold stress. Protoplasma, 253(1), 61-76.
33. Shelp, B.J., Bozzo, G.G., Trobacher, C.P., Zarei, A., Deyman, K.L., & Brikis, C.J., (2012). Hypothesis/review: Contribution of putrescine to 4-aminobutyrate (GABA) production in response to abiotic stress. Plant Science, 193, 130-135.
34. Tavladoraki, P., Cona, A., Federico, R., Tempera, G., Viceconte, N., Saccoccio, S., & Agostinelli, E. (2012). Polyamine catabolism: target for antiproliferative therapies in animals and stress tolerance strategies in plants. Amino Acids, 42(2-3), 411-426.
35. Varshney, R. K., Song, C., Saxena, R. K., Azam, S., Yu, S., Sharpe, A. G., & Millan, T. (2013). Draft genome sequence of chickpea (Cicer arietinum L.) provides a resource for trait improvement. Nature Biotechnol., 31(3), 240.36.

Vijayakumari, K., & Puthur, J. T. (2016). Gama-Aminobutyric acid (GABA) priming enhances the osmotic stress tolerance in Piper nigrum Linn. plants subjected to PEG-induced stress. Plant Growth Regulation, 78(1), 57-67.

37. Wang, C., Fan, L., Gao, H., Wu, X., Li, J., Lv, G., & Gong, B. (2014). Polyamine biosynthesis and degradation are modulated by exogenous gamma-aminobutyric acid in root-zone hypoxia-stressed melon roots. Plant Physiology and Biochemistry, 82, 17-26.
38. Wang, Y., Luo, Z., Mao, L., & Ying, T. (2016). Contribution of polyamines metabolism and GABA shunt to chilling tolerance induced by nitric oxide in cold-stored banana fruit. Food Chemistry, 197, 333-339.
39. Xing, S.G., Jun, Y.B., Hau Z.W., & Liang, L.Y. (2007). Higher accumulation of γ-aminobutyric acid induced by salt stress through stimulating the activity of diamine oxidases in Glycine max (L.) Merr. roots. Plant Physiology and Biochemistry, 45, 560-566.
40. Yang, A., Cao, S., Yang, Z., Cai, Y., & Zheng, Y. (2011). γ-Aminobutyric acid treatment reduces chilling injury and activates the defence response of peach fruit. Food Chemistry, 129, 1619-1622.
41. Yang, R., Chen, H., & Gu, Z. (2011). Factors influencing diamine oxidase activity and γ-aminobutyric acid content of fava bean (Vicia faba L.) during germination. Journal of Agricaltural and Food Chemistry, 59(21), 11616-11620.
42. Zarei, A., Chiu, G. Z., Yu, G., Trobacher, C. P., & Shelp, B. J. (2017). Salinity-regulated expression of genes involved in GABA metabolism and signaling. Botany, 95(6), 621-627.

[1]- Reactive oxygen species

[2]- Glutamate decarboxylase

[3]- Gama-Aminobutyric acid

[4]- GABA transaminase

[5]- Free amino acid

[6]- Carbon flux

[7]- Tricarboxylic acid

[8]- Polyamines

[9]- Amine oxidases

[10]- Hypoxia

[11]- Anoxia

[12]- Succinic semi aldehyde

[13]- Alpha-ketoglutarate-dependent GABA-T

[14]- Glyoxalase-dependent GABA-T

[15]- Pyruvate-dependent GABA-T

[16]- SSA dehydrogenase

[17]- Dithiothreitol (DTT)

[18]- Pyridoxal phosphate

[19]- Phenylmethylsulfonyl fluoride