Improving some biochemical characteristics of lemon balm (Melissa officinalis L.) with phytohormones-like activity of plant-derived smoke

مقدمه

فیتوهورمون‌ها در مقادیر بسیار کم فرآیندهای بیوشیمیایی، فیزیولوژیک و مورفولوژیک گیاهان را تنظیم می‌کنند (Rademacher, 2015). حداقل نُه گروه از فیتوهورمون‌ها مورد مطالعه وسیع قرار گرفته‌اند. در این میان اکسین‌ها، سیتوکینین‌ها، براسینواستروئیدها، جیبرلین‌ها و استریگولاکتون‌ها نقش مهمی در رشد و توسعه نرمال گیاهان، آبسیزیک­اسید و اتیلن واسطه پاسخ به تنش‌های غیر زیستی، جاسمونیک­اسید دارای نقش در پاسخ‌های دفاعی در مقابل گیاهخواران و سالیسیلیک­اسید در مقابل پاتوژن‌ها هستند. به­علاوه طیف وسیعی از ترکیبات شیمیایی و بسیاری از پپتیدهای ترشحی به‌عنوان مولکول‌های سیگنالی، با فعالیت‌های شبه فیتوهورمونی شناخته شده‌اند (Tavormina et al., 2015). در سال‌های اخیر، نقش محرک دود حاصل از گیاهان نشان داده است که ترکیباتی بیواکتیو در آن وجود دارد. سه دسته از ترکیبات کلیدی دود شامل اکسیدهای نیتروژن، کاریکین‌ها و سیانوهیدرین‌ها مورد بررسی قرار گرفته‌اند که علی‌رغم پاسخ چند گونه گیاهی به اکسیدهای نیتروژن و سیانوهیدرین‌ها به نظر نمی‌رسد که این دسته از ترکیبات بتوانند مسئول پاسخ‌های فیزیولوژیک گیاهان تحت تیمار دود باشند (Flematti et al., 2011). کشف کاریکین‌ها دستاوردی مهم در بیوشیمی و فیزیولوژی گیاهی بود و مطالعات بعدی نشان داد که کاریکین‌ها جنبه‌های فیزیولوژیک مختلفی از چرخه زندگی گیاهان را تحت تاثیر قرار می‌دهند و وقتی در غلظت‌های کم استفاده می‌شوند دارای فعالیت‌های شبه­فیتوهورمونی هستند (Jain et al., 2008). مطالعه روی اثرات ژنوتوکسیک و سیتوتوکسیک دودآب هیچ نوع ژنوتوکسیتی و آسیب به DNA را برای دودآب و کاریکین‌های حاصل از آن نشان نداده است. بنابراین دودآب نهاده‌ای ایمن است که می‌توان از محرک‌های زیستی آن در جهت افزایش عملکرد محصولات زراعی و باغبانی استفاده کرد. آگروکمیکال‌های موجود در دود، ترکیباتی فرار، پایدار در برابر حرارت، محلول و مانا در آب هستند؛ لذا عصاره آبی دود یا اصطلاحاً دودآب روشی تسهیل­شده در کاربرد آن می‌باشد
 (Light et al., 2015). مطالعات نشان می‌دهد که فیتوهورمون‌های رشد موجب بهبود وضعیت بیوشیمیایی گیاهان می‌شوند. بهبود پارامترهای فتوسنتزی (Kumar et al., 2001)، افزایش محتوای کلروفیل کل، کاروتنوئیدها (Bose et al., 2013; Kavina et al., 2011) و ترکیبات فنولی
 (Tian et al., 2011; Sayd et al., 2010)، همچنین افزایش محتوای پروتئین‌های‌ محلول و سرعت فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان (Karalija et al., 2017) در گیاهان مختلف تحت کاربرد خارجی هر یک از فیتوهورمون‌های رشد (اکسین، سیتوکینین و اسید­جیبرلیک) گزارش شده است. عصاره‌های آبی دود نیز دارای پاسخ‌های شبه فیتوهورمونی و همچنین برهمکنش با فیتوهورمون‌های درون‌زاد و برون کاربرد گیاهان هستند (Aremu et al., 2016;
Jain et al., 2008). ترکیبات بیواکتیو دود حاصل از گیاهان می‌توانند جایگزین الگوهای درونی فیتوهورمون‌ها در طول جوانه‌زنی شوند
 (Schwachtje & Baldwin, 2004). علاوه­بر­این مشاهده شده است که کاربرد دودآب و کاریکینولید حاصل از آن در غلظت‌های پایین در حد نانومولار موجب افزایش سرعت فتوسنتز و همچنین افزایش محتوای کلروفیل کل، محتوای کاروتنوئیدها و ترکیبات فنولی می‌شوند (Aremu et al., 2012; Abdelgadir et al., 2013).

بادرنجبویه (Melissa officinalis L.) یک گیاه دارویی پایا از تیره نعناعیان است. این گیاه حاوی متابولیت‌های ارزشمندی عمدتاً متعلق به دو گروه شیمیایی شامل ترکیبات ترپنی و فنیل پروپانوئیدی با ظرفیت بالای آنتی‌اکسیدانی، ضد میکروبی و ضد پروتوزوایی می‌باشد (Cunha et al., 2016; Lin et al., 2012). از­آن‌جایی­که عملکرد کمی و کیفی گیاهان دارویی علاوه بر ژنتیک به­شدت تحت تاثیر عوامل محیطی و مدیریت کشت واقع می‌شود؛ بنابراین استفاده از ترکیبات محرک مانند دودآب می‌تواند با بهبود کارایی بیوشیمیایی و افزایش تولید این گیاهان گامی مهم در پیشبرد اهداف ملی اعم از خودکفایی دارویی، ایجاد اشتغال و توسعه اقتصادی باشد. بررسی منابع انجام­شده نشان می‌دهد که اخیراً استفاده از دود حاصل از سوختن گیاهان و ترکیبات بیواکتیو آن به‌عنوان تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی در پژوهش‌های علمی رواج یافته است؛ ولی مطالعات انجام­شده عمدتاً در زمینه تحریک جوانه‌زنی بذر و افزایش قدرت گیاهچه بوده و کمتر به تاثیر این ترکیبات در سطح سلولی و بیوشیمیایی به‌عنوان یک شبه فیتوهورمون پرداخته شده است. لذا این پژوهش به مقایسه پاسخ‌های فیزیولوژیک و بیوشیمیایی گیاه دارویی بادرنجبویه به غلظت‌های مختلف دودآب و فیتوهورمون‌های رشد (سیتوکینین، اکسین و اسید­جیبرلیک) می‌پردازد.

مواد و روش‌ها

این آزمایش در سال 1396 در گلخانه تحقیقاتی پردیس کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه رازی به صورت اسپلیت­پلات در زمان بر پایه طرح بلوک‌های کامل تصادفی با سه تکرار اجرا شد. در این آزمایش هشت سطح محلول‌پاشی برگی گیاه بادرنجبویه (شامل شاهد، دودآب با غلظت‌های 1:5000، 1:1000، 1:500 و 1:100 (v/v) به همراه فیتوهورمون‌های سیتوکینین، اسید­جیبرلیک و اکسین هر یک با غلظت 50 میکرومولار) در پلات‌های اصلی و دو چین برداشت در پلات‌های فرعی قرار گرفت. فیتوهورمون‌های مورد استفاده عبارت از 6-بنزیل آمینوپورین (6-BAP) (سیتوکینین)، اسید­جیبرلیک (GA₃) و 3-ایندول استیک اسید (IAA) (اکسین) ساخت شرکت سیگما آلدریچ بودند. تیمار شاهد شامل محلول‌پاشی با آب مقطر بود. در هر 250 میلی‌لیتر از محلول‌های مورد استفاده که شامل آب مقطر واحدهای آزمایشی شاهد نیز می‌شد از یک قطره توئین 20 به‌عنوان سورفکتانت استفاده شد.

جهت تهیه دودآب بر مبنای روش Van Staden et al. (2004) دستگاهی بهبود­یافته با شماره ثبت اختراع 990019 در سازمان ثبت اسناد و املاک کشور طراحی شد. با استفاده از این دستگاه دود ناشی از سوختن اندام‌های خشک گیاهی، ابتدا از مخزنی حاوی آب مقطر تا زمان سوختن کامل ماده گیاهی عبور داده شد؛ به­طوری­که آب مقطر کاملاً به رنگ تیره و چگال درآمد. محلول حاصل پس از عبور از کاغذ صافی نمره یک واتمن به‌عنوان محلول پایه در نظر گرفته شد (با شماره ثبت اختراع 100737 در سازمان ثبت اسناد و املاک کشور) و سپس با استفاده از آب مقطر در غلظت‌های مورد نظر رقیق و جهت اعمال تیمارها به کار برده شد. در این مطالعه برای تهیه دودآب از اندام‌های هوایی و خشک گیاه شقایق (Papaver rhoeas L.) در مرحله گلدهی استفاده شد. انتخاب این گیاه و غلظت‌های مورد مطالعه تیمار دودآب، بر اساس نتایج حاصل از پیش­آزمون‌های مربوط به تهیه محلول پایه استاندارد از چند گونه گیاهی، فراوانی آن در منطقه مورد مطالعه و پاسخ گیاهان مختلف از جمله بادرنجبویه به تیمارهای اعمال­شده صورت گرفت.

کرت‌های آزمایشی در زمین گلخانه تهیه شد. بستر کاشت شامل خاک مزرعه، کود دامی و ماسه به نسبت 1-1-1 بود. مشخصات فیزیکی و شیمیایی خاک مزرعه مورد استفاده در جدول 1 آمده است. بذر گیاه بادرنجبویه از مرکز ملی ذخایر ژنتیکی و زیستی ایران تهیه شد. بذرها به­طور مستقیم در عمق یک سانتی‌متری خاک کشت شدند. تراکم نهایی کاشت 10 بوته در متر مربع بود. در طول دوره رشد دمای گلخانه بین 22 تا 30 درجه سانتی‌گراد و رطوبت نسبی هوا 60 درصد بود و آبیاری بسته به نیاز گیاه انجام می‌شد.

جدول 1- خصوصیات فیزیکی و شیمیایی خاک محل آزمایش

Table 1. Physical and chemical characteristics of experiment location soil

پس از استقرار کامل بوته‌ها و رسیدن آن‌ها به ارتفاع حدود 15 سانتی‌متر اقدام به اعمال تیمارها شد. برداشت گیاهان در چین اول از ارتفاع 10 سانتی‌متر انجام شد. محلول‌پاشی برای چین دوم پس از رسیدن گیاهان به مرحله رشدی مطابق با چین اول صورت گرفت. در هر یک از چین‌ها، محلول‌پاشی به­مدت چهار هفته و در هر هفته دو روز متوالی بین ساعت‌های 18 تا 20 به وسیله سمپاش دستی انجام شد. سه روز پس از اعمال آخرین تیمار در هر چین، اقدام به ثبت تمامی صفات مورد مطالعه یا نمونه‌برداری جهت اندازه‌گیری‌های آزمایشگاهی شد. این صفات شامل محتوای رنگدانه‌های فتوسنتزی، پارامترهای تبادلات گازی، شاخص‌های فلورسانس کلروفیل، محتوای پروتئین‌ها و کربوهیدرات‌های محلول، سرعت فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان، مقدار نشت الکترولیت‌ها از غشای پلاسمایی، محتوای ترکیبات فنولیک شامل فنول کل و آنتوسیانین‌ها بود. سنجش تمامی صفات مذکور روی آخرین برگ‌های کاملاً توسعه­یافته گیاه انجام شد. اندازه‌گیری محتوای رنگدانه‌های فتوسنتزی به­روش Arnon (1967) در طول موج‌های 663 نانومتر برای کلروفیل a، 645 نانومتر برای کلروفیل b و 470 نانومتر برای کاروتنوئیدها توسط دستگاه الایزا
(مدل BioTek, Powerwave, XS2) اندازه‌گیری و سپس کمی‌سازی شد. شاخص‌های فلورسانس کلروفیل با استفاده از دستگاه فلورومتر (PEA: Plant Efficiency Analyser) (مدل Pocket Pea, Hansatech Instruments Ltd. UK) اندازه‌گیری شد. آخرین برگ توسعه‌یافته گیاه با استفاده از گیره مخصوص دستگاه به مدت 30 دقیقه در تاریکی قرار گرفت و شاخص زنده‌مانی (PI)، حداکثر کارایی فتوشیمیایی فتوسیستم ‌II (Maximum Photochemical Efficiency of PS-II) (Fv/Fm) و کارایی کمپلکس تجزیه‌کننده آب در فتوسیستم ‌II (Fv/F0) در برگ‌های سازگار به تاریکی اندازه‌گیری شد. سرعت فتوسنتز در واحد سطح برگ، هدایت روزنه‌ای، سرعت تعرق، غلظت دی‌اکسید‌کربن اتاقک زیر روزنه و دمای برگ با استفاده از دستگاه فتوسنتزمتر
 (Portable LCi، ساخت شرکت Bio scientific Ltd) اندازه‌گیری شد.

تمامی اندازه‌گیری‌ها در ساعت 10 تا 11 صبح انجام شد. هدایت مزوفیلی از تقسیم سرعت فتوسنتز به غلظت دی‌اکسید‌کربن درون روزنه‌ها به­دست آمد (Fischer et al., 1998). همچنین به­منظور تعیین کارایی مصرف آب فتوسنتزی، سرعت فتوسنتز به هدایت روزنه‌ای تقسیم شد (Ritchie et al., 1990).

جهت اندازه‌گیری پروتئین‌های محلول و سرعت فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان شامل پراکسیداز، سوپر‌اکسید دیسموتاز و کاتالاز، ابتدا اقدام به تهیه بافر استخراج، عصاره گیاهی و بافر فسفات شد. اندازه‌گیری محتوای پروتئین‌های محلول موجود در برگ به­روش
 Bradford (1976) و با استفاده از عصاره گیاهی و معرف بلو انجام شد. برای رسم منحنی استاندارد محلول‌های صفر، 25، 50 و 100 پی‌پی‌ام از آلبومین گاوی در بافر استخراج تهیه شد. مقدار جذب نوری تیمارها و محلول‌های استاندارد در طول موج 595 نانومتر اندازه‌گیری و سپس نمودار پراکنش این دو پارامتر رسم و خط رگرسیون مربوطه برازش داده شد. سرعت فعالیت آنزیم پراکسیداز به روش
 Chance & Maehly (1955) با استفاده از عصاره گیاهی و سوبسترای آنزیم و محاسبه H₂O₂ مصرف­شده در طول موج 470 نانومتر اندازه‌گیری شد. مقدار H₂O₂ موجود در مخلوط واکنش با استفاده از مفهوم قانون بیر-لامبرت و ضریب خاموشی آنزیم پراکسیداز (0266/0 سانتی‌متر بر مول) محاسبه شد. در نهایت سرعت فعالیت این آنزیم به صورت میکرومول H₂O₂ مصرف­شده در دقیقه (تعداد واحدهای آنزیم) در میلی‌گرم پروتئین‌های محلول بیان شد. سرعت فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز به روش
 Beauchamp & Fridovich (1971) از طریق اندازه‌گیری توانایی آن در جلوگیری از احیای نوری نیتروبلوتترازولیوم و با استفاده از طول موج 560 نانومتر محاسبه شد. در نهایت سرعت فعالیت این آنزیم به صورت میکرومول H₂O₂ تولید­شده در دقیقه (تعداد واحدهای آنزیم) در میلی‌گرم پروتئین‌های محلول بیان شد. سرعت فعالیت آنزیم کاتالاز به­روش Sinha (1972) و با استفاده از محاسبه کاهش جذب H₂O₂ در طول موج 570 نانومتر انجام شد. مقدار H₂O₂ موجود در مخلوط واکنش با استفاده از مفهوم قانون بیر-لامبرت و ضریب خاموشی آنزیم کاتالاز (0394/0 سانتی‌متر بر مول) محاسبه شد.

برای سنجش محتوای فنول کل به روش
 Noreen & Ashraf (2009) از معرف فولین سیکالتو و استاندارد گالیک اسید استفاده شد و مقدار جذب نوری محلول واکنش در طول موج 750 نانومتر قرائت شد. جهت رسم منحنی استاندارد محلول گالیک­اسید با غلظت 100 میکروگرم بر میلی‌لیتر تهیه و سپس از این محلول پایه غلظت‌های پنج، ده، 15، 20 و 30 میکروگرم بر میلی‌لیتر آماده شد و سایر مراحل کار همانند نمونه‌های اصلی انجام گرفت. در نهایت مقدار کل ترکیبات فنولی نمونه بر حسب میلی‌گرم گالیک­اسید بر گرم وزن تر محاسبه شد. محتوای آنتوسیانین‌ها به روش Nadernejad et al. (2013) و با عصاره‌گیری مواد گیاهی در متانول اسیدی (متانول خالص و اسید­کلریدریک خالص به نسبت حجمی 99 به یک) سنجش و جذب نوری آن در طول موج 550 نانومتر اندازه‌گیری شد. کمی‌سازی این ترکیبات با استفاده از مفهوم قانون بیر-لامبرت و در­نظر­گرفتن ضریب خاموشی 33000 سانتی‌متر بر مول محاسبه شد. اندازه‌گیری محتوای کربوهیدرات‌های محلول به روش فنل-اسیدسولفوریک انجام شد (Sheligl, 1986) و مقدار جذب نوری محلول واکنش در طول موج 488 نانومتر قرائت شد. جهت تهیه استانداردها ابتدا محلول‌های 20، 40، 60 و 80 پی‌پی‌ام گلوکز تهیه و سایر مراحل کار همانند نمونه‌های اصلی انجام شد. سپس با توجه به مقادیر جذب نوری منحنی استاندارد رسم شده و مقدار این ترکیبات برحسب میلی‌گرم کربوهیدرات محلول در گرم وزن خشک برگ به­دست آمد. اندازه‌گیری پایداری غشای سلولی به روش
 Lutts et al. (1996) انجام گرفت. به­این­منظور 5/0 گرم دیسک برگی در فالکون‌های حاوی 20 میلی‌لیتر آب مقطر در دمای 25 درجه سانتی‌گراد به مدت 24 ساعت قرار داده شد. سپس هدایت الکتریکی آن‌ها توسط هدایت‌سنج الکتریکی (مدل ExStik®II, EC500) اندازه‌گیری شد (EC1). سپس نمونه‌ها به مدت 20 دقیقه در بن‌ماری با دمای 100 درجه سانتی‌گراد قرار داده شدند و پس از رسیدن دمای آن‌ها به دمای اتاق هدایت الکتریکی آن‌ها مجدداً اندازه‌گیری شد (EC2). پایداری غشای سلولی از نسبت EC1 به EC2 و به صورت درصد به­دست آمد. در نهایت داده‌های حاصل پس از بررسی نرمال­بودن با نرم‌افزار SAS نسخه 4/9 آنالیز و با استفاده از آزمون حداقل اختلاف معنی‌دار (LSD) در سطح پنج درصد مقایسه میانگین شدند.

نتایج و بحث

محتوای رنگدانه‌های فتوسنتزی

نتایج تجزیه واریانس نشان داد که مقدار کلروفیل a، b و کلروفیل کل و محتوای کاروتنوئیدها به‌طور معنی‌داری تحت تاثیر سطوح محلول‌پاشی قرار گرفتند (جدول 2). بیشترین محتوای کلروفیل a (29/1 میلی‌گرم بر گرم وزن تر برگ) مربوط به دودآب‌های 1:500 و 1:100 (v/v) و کمترین مقدار آن (93/0 میلی‌گرم بر گرم وزن تر برگ) مربوط به تیمار شاهد بود. بیشترین مقدار کلروفیل b (75/0 میلی‌گرم در گرم وزن تر برگ) مربوط به دودآب 1:100 (v/v) بدون تفاوت معنی‌دار با دودآب 1:500 (v/v) و سیتوکینین و کمترین مقدار آن (41/0 میلی‌گرم در گرم وزن تر برگ) مربوط به تیمار شاهد بود. بیشترین مقدار کلروفیل کل (04/2 میلی‌گرم بر گرم وزن تر برگ) از دودآب 1:100 (v/v) بدون اختلاف معنی‌دار با دودآب 1:500 (v/v) و سیتوکینین و کمترین مقدار آن (35/1 میلی‌گرم بر گرم وزن تر برگ) از تیمار شاهد حاصل شد (جدول 3).

نسبت کلروفیل a به کلروفیل b تحت تاثیر معنی‌دار سطوح محلول‌پاشی و چین‌های برداشت قرار نگرفت (جدول 2). بیشترین محتوای کاروتنوئیدها (54/0 میلی‌گرم در گرم وزن تر برگ) مربوط به دودآب 1:500 (v/v) بدون تفاوت معنی دار با دودآب 1:100 (v/v) و کمترین مقدار آن (38/0 میلی‌گرم در گرم وزن تر برگ) مربوط به تیمار شاهد بود (جدول 3). نسبت محتوای کلروفیلی به محتوای کاروتنوئیدی به­طور معنی‌داری تحت تاثیر سطوح محلول‌پاشی قرار گرفت (جدول 2). بیشترین مقدار این نسبت مربوط به دودآب 1:100 (v/v) (19/1) بدون اختلاف معنی‌دار با دودآب 1:500 (v/v) و سیتوکینین بود؛ در­حالی­که سایر تیمارها تفاوت معنی‌داری با هم و با تیمار شاهد (59/0) نداشتند (جدول 3). مشاهده شده است که سیگنال‌دهی سیتوکینین و نور در سطح ژن ARR4
(Arabidopsis Responsse Regulator4) و فیتوکروم B همگرا است؛ لذا می‌توان گفت که سیتوکینین می‌تواند بیان بسیاری از ژن‌های هسته‌ای و کلروپلاستی را تنظیم کند (Yaronskaya et al., 2006). تنظیم این ژن‌ها می‌تواند در جهت افزایش بیوسنتز 5-آمینولِوولینیک اسید (5-Aminolevulinic acid)، افزایش بیان ژن‌های کد­کننده آنزیم‌های NADPH-پروتوکلروفیلید اکسیدوردوکتاز (NADPH-protochlorophyllide oxidoreductase)، منیزیم پروتوپورفیرین IX کلاتاز (Mg protoporphyrin IX chelatase) و منیزیم پروتوپورفیرین IX متیل ترانسفراز (Mg protoporphyrin IX methyltransferase) یا کاهش بیان ژن‌های کد­کننده آنزیم‌های کلروفیلاز (Chlorophyllase) و منیزیم کلاتاز (Mg chelatase) باشد (Costa et al., 2005 Yaronskaya et al., 2006,). دودآب در غلظت‌های 1:100 و 1:500 (v/v) بدون اختلاف معنی‌دار با سیتوکینین، محتوای کلروفیل را افزایش داد. با توجه به این مورد می‌توان گفت که احتمالاً مکانیسم اثر دودآب نیز همانند سیتوکینین و وابسته به افزایش بیوسنتز پیش ماده‌ها، افزایش بیان ژن‌های کد­کننده آنزیم‌های درگیر در مسیر بیوسنتز یا کاهش بیان ژن‌های کد­کننده آنزیم‌های تخریب کلروفیل باشد. این نتایج با نتایج Ghebrehiwot et al. (2013) که مشاهده کردند دود در تمامی شکل‌های کاربردی مانند دود آئروسل، دودآب و همچنین کاریکینولید حاصل از آن موجب افزایش سطح کلروفیل a، b و کلروفیل کل شد مطابقت دارد.

جدول 2- تجزیه واریانس رنگدانه‌های فتوسنتزی برگ‌های بادرنجبویه تحت تاثیر سطوح مختلف محلول‌پاشی و چین‌های برداشت

Table 2. Analysis of variance for photosynthetic pigments of lemon balm leaves as affected by different levels of foliar application and harvesting stages

ns، * و ** به­ترتیب عدم وجود تفاوت معنی‌دار، معنی‌دار­بودن در سطح یک درصد و پنج درصد را نشان می‌دهد.

ns, * and ** are non-significant, significant at 1% and 5% level of probability, respectively.

جدول 3- اثر سطوح مختلف محلول‌پاشی روی رنگدانه‌های فتوسنتزی برگ‌های بادرنجبویه

Table 3. Effect of different levels of foliar application on photosynthetic pigments of lemon balm leaves

Ctrl: شاهد، SW: دودآب، Ck: سیتوکینین، GA: اسید­جیبرلیک و IAA: اکسین.

Ctrl: control, SW: Smoke-Water, CK: Cytokinin, GA: Gibberellic acid and IAA: Auxin

نتایج حاصل از این پژوهش نشان داد که دودآب‌های با غلظت بیشتر موجب افزایش محتوای کاروتنوئیدی شدند که با نتایج Ghebrehiwot et al. (2013) مطابقت نداشت. فیتوهورمون‌های استفاده­شده نیز نتیجه بینابینی و وابسته به غلظت در مقدار ترکیبات کاروتنوئیدی ایفا کردند و محتوای این ترکیبات در آن‌ها حد واسط بین دودآب‌های رقیق‌تر یعنی 1:5000، 1:1000 (v/v) و دودآب‌های غلیظ‌تر یعنی 1:100، 1:500 (v/v) بود. فیتوهورمون‌ها می‌توانند با تاثیر بر ژن‌های کد­کننده مسیر بیوسنتز ژرانیل پیروفسفات سنتز کاروتنوئیدها را تحت تاثیر قرار دهد
 (Shaddad et al., 2013). کاربرد فیتوهورمون‌ها به­ویژه سیتوکینین از طریق افزایش غلظت کاروتنوئیدها، موجب محافظت کلروفیل در برابر اکسیداسیون نوری می‌شود (Candan & Tarhan, 2003)

با­توجه­به اینکه صرف نظر از تغییرات نوری و دمایی گلخانه، گیاه در شرایط نسبتاً مطلوبی بود و تنش قابل توجهی وجود نداشت، پس بیان علت دقیق افزایش کاروتنوئیدها در چین‌های برداشت و سطوح محلول‌پاشی چندان ساده نیست. اما بررسی نسبت مقدار محتوای کلروفیل به محتوای کاروتنوئید شاخص مناسب‌تری به نظر می‌رسد. زیرا محتوای کل کلروفیل نشان‌دهنده ویژگی‌های سرسبزی در گیاهان است (Netto et al., 2005). نتایج حاصل از مطالعه حاضر نشان داد که دودآب 1:100 (v/v) بدون تفاوت معنی‌دار با سیتوکینین و دودآب 1:500 (v/v) موجب حصول نسبت کلروفیل کل به کاروتنوئیدهای بالاتری در مقایسه با شاهد شد که با نتایج پیشین مطابقت داشت (Ghebrehiwot et al., 2013; Sosnowski et al., 2017).

پارامترهای کلروفیل فلورسانس

حداکثر کارایی فتوشیمیایی فتوسیستم II، شاخص زنده‌مانی و کارآیی کمپلکس تجزیه‌کننده آب در فتوسیستم II در چین‌های برداشت اختلاف معنی‌داری داشتند ولی هیچ­یک از پارامترهای فلورسانس کلروفیل تحت تاثیر معنی‌دار سطوح محلول‌پاشی قرار نگرفت (جدول 4). حداکثر کارایی فتوشیمیایی فتوسیستم II در چین‌های اول و دوم به­ترتیب برابر با 81/0 و 82/0 بود. چین‌های اول و دوم به­ترتیب دارای شاخص زنده‌مانی برابر با 05/14 و 44/16 بودند. کارآیی کمپلکس تجزیه‌کننده آب در فتوسیستم II نیز در چین‌های اول و دوم برابر با 49/4 و 65/4 بود (جدول 5). عدم تاثیر معنی‌دار سطوح مختلف محلول‌پاشی بر پارامترهای فلورسانس کلروفیل می‌تواند دلایل متعددی از جمله پاسخ‌دهندگی کمتر به فیتوهورمون‌های برون‌زاد یا آگروکمیکال‌های دود یا بهینه کارایی زنجیره انتقال الکترون در شرایط نرمال در این گیاه باشد که بیش از آن تحت کاربرد مواد مذکور امکان‌پذیر نبوده است.

پارامترهای تبادلات گازی

سرعت فتوسنتز، سرعت تعرق و هدایت روزنه‌ای به­طور معنی‌داری تحت تاثیر سطوح محلول‌پاشی قرار گرفتند (جدول 6). بیشترین سرعت فتوسنتز (42/8 میکرومول دی‌اکسید‌کربن بر متر مربع در ثانیه) مربوط به سیتوکینین بود که تفاوت معنی‌داری با دودآب 1:100 (v/v) و پس از آن با دودآب 1:500 (v/v)، اسید­جیبرلیک و اکسین نداشت. کمترین سرعت فتوسنتز (95/3 میکرومول دی‌اکسید‌کربن بر متر مربع در ثانیه) نیز مربوط به تیمار شاهد بود (جدول 7). بیشترین سرعت تعرق (47/3 میلی‌مول آب بر متر مربع در ثانیه) مربوط به دودآب 1:100 (v/v) بدون تفاوت معنی‌دار با تیمار سیتوکینین و دودآب 1:500 (v/v) و کمترین مقدار آن (37/1 میلی‌مول آب بر متر مربع در ثانیه) مربوط به دودآب 1:5000 (v/v) بود (جدول 7).

بیشترین هدایت روزنه‌ای (12/0 مول بر متر مربع در ثانیه) مربوط به دودآب 1:100 (v/v) بدون تفاوت معنی‌دار با سیتوکینین و کمترین مقدار آن (05/0 مول بر متر مربع در ثانیه) مربوط به دودآب 1:1000 (v/v) بدون تفاوت معنی‌دار با تیمار شاهد و دودآب 1:5000 (v/v) بود (جدول 7).

جدول 4- تجزیه واریانس پارامترهای فلورسانس کلروفیل برگ‌های بادرنجبویه تحت تاثیر سطوح مختلف محلول‌پاشی و چین‌های برداشت

Table 4. Analysis of variance for chlorophyll fluorescence parameters of lemon balm leaves as affected by different levels of foliar application and harvesting stages

ns، * و ** به­ترتیب عدم وجود تفاوت معنی‌دار، معنی‌دار­بودن در سطح یک درصد و پنج درصد را نشان می‌دهد.

ns, * and ** are non-significant, significant at 1% and 5% level of probability, respectively.

جدول 5- اثر چین‌های برداشت روی پارامترهای فلورسانس کلروفیل برگ‌های بادرنجبویه

Table 5. Effect of harvest stages on chlorophyll fluorescence parameters of lemon balm leaves

دمای برگ به­طور معنی‌داری تحت تاثیر چین‌های برداشت قرار گرفت. دمای برگ در چین اول و دوم به­ترتیب برابر با 64/33 و 72/30 درجه سانتی‌گراد بود (جدول 9).

افزایش سرعت فتوسنتز تحت کاربرد سیتوکینین با نتایج Gupta et al. (2000) مطابقت داشت. سیتوکینین‌ها می‌توانند از مسیرهای مختلفی همچون افزایش تمایز کلروپلاست‌ها و یا افزایش رونویسی و ترجمه ژن‌های کد­کننده آنزیم‌های درگیر در مسیر فتوسنتز مانند کربنیک­انیدراز، نیترات ردوکتاز، سرعت و کارایی فتوسنتز را افزایش دهند
 (Taiz & Zeiger, 2012). چرا که کربنیک­انیدراز در بافت‌های فتوسنتزی گیاهان C3 و C4 دسترسی دی‌اکسید‌کربن برای روبیسکو را به­وسیله کاتالیزه­کردن واکنش برگشت‌پذیر هیدراته­شده دی‌اکسید‌کربن، تنظیم می‌کند و نیترات ردوکتاز موجب شروع متابولیسم نیترات و متعاقباً سنتز پروتئین در گیاهان می‌شود. فعالیت نیترات­ردوکتاز بسیار متغیر و وابسته به حضور فیتوهورمون‌ها می‌باشد (Hayat & Ahmad, 2003). بنابراین احتمال می‌رود که کاربرد فیتوهورمون‌های مورد مطالعه خصوصاً سیتوکینین در غروب روزهای اعمال تیمار، موجب افزایش سطح پروتئین‌ها و آنزیم‌های مورد نیاز برای آسمیلاسیون در طی شب و افزایش سرعت فتوسنتز در طول روزهای پیش رو شده باشد. افزایش هدایت روزنه‌ای تحت تیمارهای دودآب و سیتوکینین نیز احتمالاً به­دلیل افزایش فعالیت کامبیومی و تشکیل بافت‌های آوندی می‌باشد (Aldesuquy, 2000). عدم تطابق نتایج این مطالعه با نتایج Gilbert et al. (2002) احتمالاً به خاطر تفاوت در روش اعمال ترکیبات بیواکتیو دود بر گیاهان، دمای مناسب دودآب نسبت به دود آئروسل و عدم آسیب به آنزیم‌های حساس به دما مانند روبیسکو بود. علاوه­بر­این دودآب اثر منفی بسته­شدن روزنه‌ها در اثر غلظت بالای دی‌اکسید‌کربن موجود در دود آئروسل را نیز مرتفع کرد (Gilbert et al., 2002).

محتوای فنول کل و آنتوسیانین‌ها

محتوای فنول کل برگ به طور معنی‌داری تحت تاثیر سطوح محلول‌پاشی قرار گرفت (جدول 6). بیشترین محتوای فنول کل (92/0 میلی‌گرم گالیک­اسید بر گرم وزن تر برگ) مربوط به دودآب 1:500 (v/v) بدون تفاوت معنی‌دار با اکسین و کمترین مقدار آن (57/0 میلی‌گرم گالیک­اسید بر گرم وزن تر برگ) مربوط به تیمار شاهد بود (جدول 7). محتوای آنتوسیانین‌های برگ تحت تاثیر معنی‌دار سطوح محلول‌پاشی و چین‌های برداشت قرار نگرفت (جدول 6). افزایش ترکیبات فنولیک در اثر کاربرد فیتوهورمون‌ها
 (Vats et al., 2012) و دودآب (Aremu et al., 2012) گزارش شده است. فیتوهورمون‌ها و ترکیبات شبه فیتوهورمونی دودآب تغییر در محتوای این ترکیبات را با تاثیر بر بیان ژن‌های کلیدی مسیر بیوشیمیایی فنیل­پروپانوئید و مسیرهای ثانویه متابولیسم کربن موجب می‌شوند. علی‌رغم افزایش مقدار فنول کل، محتوای رنگدانه‌های فلاوونوئیدی آنتوسیانین‌ها تحت تاثیر سطوح محلول‌پاشی قرار نگرفت. احتمالاً عدم تغییر معنی‌دار آنتوسیانین‌ها با وجود افزایش محتوای ترکیبات فنولیک، تولید سایر فنول‌ها باشد. علاوه­بر­این سیستم دفاعی آنتوسیانینی بیشتر در گیاهچه‌ها و ابتدای نمو مشاهده می‌شود (Candan & Tarhan, 2003)، بنابراین متاثر­نشدن این رنگدانه‌ها در مرحله نموی مورد مطالعه امری بدیهی می‌باشد.

محتوای کربوهیدرات‌های محلول

محتوای کربوهیدرات‌های محلول برگ به­طور معنی‌داری تحت تاثیر سطوح محلول‌پاشی و چین‌های برداشت قرار گرفت (جدول 8). بیشترین مقدار کربوهیدارت‌های محلول برگ مربوط به تیمار شاهد (23/378 میلی‌گرم بر گرم وزن خشک برگ) بدون تفاوت معنی‌دار با دودآب‌های 1:5000 و 1:1000 (v/v) و کمترین مقدار آن (38/189 میلی‌گرم بر گرم وزن خشک برگ) مربوط به دودآب 1:100 (v/v) بود (شکل a-1). چین اول دارای 25/280 و چین دوم دارای 10/314 میلی‌گرم کربوهیدرات‌های محلول در گرم وزن خشک برگ بود (جدول 9).

کاهش قابل ملاحظه محتوای کربوهیدرات‌های محلول در گیاهان تیمار­شده با دودآب 1:100 (v/v) همراه با اثرات مثبت سایر پارامترهای فتوسنتزی می‌تواند بهبود عملکرد کمی و کیفی گیاه بادرنجبویه ناشی از کاربرد دودآب را توجیه کند (Noroozi Shahri et al., 2020)؛ زیرا افزایش محتوای گلوکز و فروکتوز موجب کاهش فعالیت آنزیم‌های فتوسنتزی و تنفسی مانند روبیسکو و هیدروکسی­پیرووات­ردوکتاز می‌شود. علاوه­بر­این گلوکز و ساکارز رونویسی ژن‌های فتوسنتزی را مهار می‌کنند. حتی در گیاهان جوان نیز افزایش تجمع کربوهیدرات‌های محلول موجب کاهش کلروفیل، کاهش پروتئین‌های فتوسنتزی، انقطاع فلوئم و حذف مخازن می‌شود. در این شرایط خصوصاً اگر شار فوتونی نیز کم باشد پیری برگ‌ها تسریع می‌شود. مطالعات نشان می‌دهند که کاربرد فیتوهورمون‌ها می‌تواند برخی از پاسخ‌های گیاه ناشی از حضور کربوهیدرات‌های محلول را مهار کند (Wingler et al., 1998).

جدول 6- تجزیه واریانس پارامترهای فتوسنتزی و ترکیبات فنولیک برگ‌های بادرنجبویه تحت تاثیر سطوح مختلف محلول‌پاشی و چین‌های برداشت

Table 6. Analysis of variance for photosynthetic parameters and phenolic compounds of lemon balm leaves as affected by different levels of foliar application and harvesting stages

ns، * و ** به­ترتیب عدم وجود تفاوت معنی‌دار، معنی‌دار­بودن در سطح یک درصد و پنج درصد را نشان می‌دهد.

ns, * and ** are non-significant, significant at 1% and 5% level of probability, respectively.

جدول 7- اثر سطوح مختلف محلول‌پاشی روی پارامترهای فتوسنتزی و محتوای فنول کل برگ‌های بادرنجبویه

Table 7. Effect of different levels of foliar application on photosynthetic parameters and total phenolic content of lemon balm leaves

Ctrl: شاهد، SW: دودآب، Ck: سیتوکینین، GA: اسید­جیبرلیک و IAA: اکسین.

Ctrl: control, SW: Smoke-Water, CK: Cytokinin, GA: Gibberellic acid and IAA: Auxin

مصرف دودآب و سیتوکینین موجب افزایش رشد، افزایش انتقال ساکارز از برگ‌ها به­سوی مخازن، کاهش مقدار ساکارز درون سلول‌های منبع و کاهش محتوای کربوهیدرات‌های محلول این تیمارها نسبت به شاهد می‌شود (Oliveira Neto et al., 2009). این نتایج با مشاهدات Iqbal et al. (2018) مطابقت دارد. معنی‌دار­بودن مقدار کربوهیدرات‌های محلول در دو چین مختلف گیاه نیز در اثر تغییر طول روز و مقدار فوتون دریافتی توجیه می‌شود. زیرا با ورود گیاه به شرایط طول روز کوتاه مقدار فیتوهورمون‌های درونی آن تغییر می‌یابد (Wingler et al., 1998).

محتوای پروتئین‌های محلول و سرعت فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان

محتوای پروتئین‌های محلول برگ از نظر آماری تحت تاثیر سطوح محلول‌پاشی و چین‌های برداشت قرار نگرفت. سرعت فعالیت آنزیم پراکسیداز، سوپراکسید­دیسموتاز و کاتالاز نیز از نظر آماری تحت تاثیر هیچ یک از تیمارهای مختلف محلول‌پاشی قرار نگرفتند. تنها سرعت فعالیت آنزیم کاتالاز تحت تاثیر معنی‌دار چین‌های برداشت واقع شد (جدول 8). سرعت فعالیت آنزیم کاتالاز در چین اول برابر با 86/1346 و در چین دوم برابر با 33/1160 واحد آنزیمی بر میلی‌گرم پروتئین‌های محلول بود (جدول 9).

نشت الکترولیت‌ها از غشای پلاسمایی

درصد نشت الکترولیت‌ها از غشای پلاسمایی سلول‌های برگ به طور معنی‌داری تحت تاثیر سطوح محلول‌پاشی و چین‌های برداشت قرار گرفت (جدول 8). بیشترین مقدار نشت الکترولیت‌ها (92/90 درصد) مربوط به غشای پلاسمایی سلول‌های برگ گیاهان شاهد بدون تفاوت معنی‌دار با دودآب‌های 1:5000 و 1:1000 (v/v) و کمترین مقدار آن (76/71 درصد) مربوط به دودآب 1:100 (v/v) بدون تفاوت معنی‌دار با دودآب 1:500 (v/v) و فیتوهورمون‌های مورد مطالعه بود (شکل b-1). چین اول و چین دوم برداشت به­ترتیب دارای نشت الکترولیت‌ها از غشای پلاسمایی برابر با 05/84 و 49/77 درصد بود (جدول 9). ثبات بیشتر غشاهای سلولی و نشت کمتر الکترولیت‌ها یکی از مهمترین پارامترهای کارایی فعالیت‌های بیوشیمیایی و پایداری عملکرد گیاه است. آگروکمیکال‌های موجود در دودآب همانند فیتوهورمون‌ها با کاهش آسیب رادیکال‌های آزاد موجود در سیستم‌های دریافت نور موجب یکپارچگی غشای سلولی و در نتیجه افزایش کارایی فعالیت‌های بیوشیمیایی شدند (Werner & Schmülling, 2009). این نتایج با گزارش Iqbal et al. (2018) مطابقت داشت.

جدول 8- تجزیه واریانس برخی از پارامترهای بیوشیمیایی برگ‌های بادرنجبویه تحت تاثیر سطوح مختلف محلول‌پاشی و چین‌های برداشت

Table 8. Analysis of variance for some biochemical parameters of lemon balm leaves as affected by different levels of foliar application and harvesting stages

ns، * و ** به­ترتیب عدم وجود تفاوت معنی‌دار، معنی‌دار­بودن در سطح یک درصد و پنج درصد را نشان می‌دهد.

ns, * and ** are non-significant, significant at 1% and 5% level of probability, respectively.

جدول 9- اثر چین‌های برداشت روی برخی از پارامترهای بیوشیمیایی برگ‌های بادرنجبویه

Table 9. Effect of harvest stages on some biochemical parameters of lemon balm leaves

شکل 1- اثر سطوح مختلف محلول‌پاشی بر a: محتوای کربوهیدرات‌های محلول و b: نشت الکترولیت‌های برگ‌های بادرنجبویه. Ctrl: شاهد، SW: دودآب، Ck: سیتوکینین، GA: اسید­جیبرلیک و IAA: اکسین. خطوط بار، نشان‌دهنده خطای استاندارد است.

Figure 1. Effect of different levels of foliar application on a: soluble carbohydrates content and b: electrolyte leakage of lemon balm leaves. Ctrl: control, SW: Smoke-Water, Ck: Cytokinin, GA: Gibberellic acid and IAA: Auxin. Bar lines indicate the standard error.

نتیجه‌گیری کلی

دودآب در غلظت‌های 1:100 و 1:500 (v/v) موجب افزایش محتوای رنگدانه‌های فتوسنتزی، نسبت محتوای کلروفیل کل به کاروتنوئیدها، سرعت فتوسنتز، سرعت تعرق و هدایت روزنه‌ای، محتوای فنول کل و کاهش تجمع کربوهیدرات‌های محلول و درصد نشت الکترولیت‌ها از غشای پلاسمایی سلول‌های برگ نسبت به تیمار شاهد شد. سطوح مذکور در اکثر صفات مورد بررسی تفاوت معنی‌داری با فیتوهورمون‌های رشد نداشتند. برآیند این تغییرات در گیاه موجب بهبود وضعیت بیوشیمیایی، افزایش کارایی فتوسنتزی و تثبیت کربن می‌شود. اگرچه هنوز مکانیسم دقیق ترکیبات محرک دودآب در بهبود ویژگی‌های بیوشیمیایی گیاهان مشخص نیست؛ ولی مطالعات حاضر پاسخ‌های شبه فیتوهورمونی و احتمالاً اثر این ترکیبات را بر پروفیل فیتوهورمون‌های درونی گیاه تأیید می­کنند. بنابراین دودآب می‌تواند به­عنوان یک آگروکمیکال طبیعی با تکنیک نسبتاً ساده و مقرون­به­صرفه، پتانسیل لازم جهت بهبود فرآیندهای بیوشیمیایی گیاه بادرنجبویه را داشته باشد.

REFERENCES

1. Abdelgadir, H. A., Kulkarni, M. G., Aremu, A. O. & Van Staden, J. )2013). Smoke-water and karrikinolide (KAR1) foliar applications promote seedling growth and photosynthetic pigments of the biofuel seed crop. Jatropha curcas Journal of Plant Nutrition and Soil Science, 176, 743-747.
2. Aldesuquy, H. S. (2000). Effect of indol-3-yl acetic acid on photosynthetic characteristics of wheat flag leaf during grain filling. Photosynthetica, 38, 135-141.
3. Aremu, A. O., Bairu, M. W., Finnie J. F. & Van Staden, J. (2012). Stimulatory role of smoke–water and karrikinolide on the photosynthetic pigment and phenolic contents of micropropagated ‘Williams’ bananas. Plant Growth Regulation, 67, 271-279.
4. Aremu, A. O., Plačková, L., Novák, O., Stirk, W. A., Doležal, K., & Van Staden, J. (2016). Cytokinin profiles in ex vitro acclimatized Eucomis autumnalis plants pre-treated with smoke-derived karrikinolide. Plant Cell Reports, 35(1), 227-238.
5. Arnon, A. (1967). Method of extraction of chlorophyll in the plants. Agronomy Journal, 23, 112-121.
6. Beauchamp, C. & Fridovich, I. (1971). Superoxide dismutase: Improved assays and an assay predictable to acrylamide gels. Annals of Biochemistry, 44, 276–287.
7. Bose, S. K., Yadav, R. K., Mishra, S., Rajender, S., Sangwan, A., Singh, K., Mishra, B., Srivastava, A. K. & Sangwan, N. S. (2013). Effect of gibberellic acid and calliterpenone on plant growth attributes, trichomes, essential oil biosynthesis and pathway gene expression in differential manner in Mentha arvensis Plant Physiology and Biochemistry, 66, 150-158.
8. Bradford, M. M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principles of protein dye binding. Analytical Biochemistry, 72, 248-254.
9. Candan, N. & Tarhan, L. (2003). Changes in chlorophyll-carotenoid contents, antioxidant enzyme activities and lipid peroxidation levels in Zn-stressed Mentha pulegium. Turkish Journal of Chemistry, 27, 21-30.
10. Chance, B. & Maehly, A. (1955). Assay of catalases and peroxidases. Methods in Enzymology, 2, 764-775.
11. Costa, M. L., Civello, P. M., Chaves, A. R. & Martínez, G. A. (2005). Effect of ethephon and 6-benzylaminopurine on chlorophyll degrading enzymes and a peroxidase-linked chlorophyll bleaching during post-harvest senescence of broccoli (Brassica oleracea) at 20 C. Postharvest Biology and Technology, 35, 191-199.
12. Cunha, F., Tintino, S. R., Figueredo, F., Barros, L., Duarte, A. E., Vega Gomez, M. C., Coronel, C. C., Rolón, M., Leite, N., Sobral-Souza, C. E. & Brito, S. V. (2016). HPLC-DAD phenolic profile, cytotoxic and anti-kinetoplastidae activity of Melissa officinalis. Pharmaceutical Biology, 54(9), 1664-1670.
13. Fischer, R., Rees, D., Sayre, K., Lu, Z. M., Condon, A. & Saavedra, A. L. (1998). Wheat yield progress associated with higher stomatal conductance and photosynthetic rate, and cooler canopies. Crop Science, 38, 1467-1475.
14. Flematti, G. R., Merritt, D. J., Piggott, M. J., Trengove, R. D., Smith, S. M., Dixon, K. W. & Ghisalberti, E. L. (2011). Burning vegetation produces cyanohydrins that liberate cyanide and stimulate seed germination. Nature Communications, 2(1), 1-6.
15. Ghebrehiwot, H., Kulkarni, M., Bairu, M. & Van Staden, J. (2013). Plant-derived aerosol-smoke and smoke solutions influence agronomic performance of a traditional cereal crop, Tef. Experimental Agriculture, 49, 244-55.
16. Gilbert, M., Ripley, B. & Van Staden, J. (2002). The effect of smoke on the photosynthetic gas exchange of Chrysanthemoides monilifera. South African Journal of Botany, 68, 525-531.
17. Gupta, N., Sunita, G. & Arvind, K. (2000). Exogenous cytokinin application increases cell membrane and chlorophyll stability in wheat (Triticum aestivum). Cereal Research Communications, 28, 287-291.
18. Hayat, S. & Ahmad, A. (2003). Soaking seeds of Lens culinaris with 28‐homobrassinolide increased nitrate reductase activity and grain yield in the field in India. Annals of applied biology, 143 (1), 121-124.
19. Iqbal, M., Asif, S., Ilyas, N., Raja, N. I., Hussain, M., Ejaz, M. & Saira, H. (2018). Smoke produced from plants waste material elicits growth of wheat (Triticum aestivum) by improving morphological, physiological and biochemical activity. Biotechnology Reports, 17, 35-44.
20. Jain, N., Stirk, W. A. & Van Staden, J. (2008). Cytokinin-and auxin-like activity of a butenolide isolated from plant-derived smoke. South African Journal of Botany, 74, 327-331.
21. Karalija, E., Zeljković, S. Ć., Tarkowski, P., Muratović, E. & Parić, A. (2017). The effect of cytokinins on growth, phenolics, antioxidant and antimicrobial potential in liquid agitated shoot cultures of Knautia sarajevensis. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC), 131, 347-57.
22. Kavina, J., Gopi, R. & Panneerselvam, R. (2011). Traditional and non-traditional plant growth regulators alter the growth and photosynthetic pigments in Mentha piperita. International Journal of Environmental Sciences, 11(7), 124-134.
23. Kumar, B., Pandey, D., Goswami, C. & Jain, S. (2001). Effect of growth regulators on photosynthesis, transpiration and related parameters in water stressed cotton. Biologia Plantarum, 44, 475-478.
24. Light, M. E., Anthonissen, R., Maes, A., Verschaeve, L., Pošta, M. & Van Staden, J. (2015). Genotoxicity testing of 3, 4, 5-trimethylfuran-2 (5H)-one, a compound from plant-derived smoke with germination inhibitory activity. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, 778, 1-5.
25. Lin, J. T., Chen, Y. C., Lee, Y. C., Hou, C. W. R., Chen, F. L., & Yang, D. J. (2012). Antioxidant, anti-proliferative and cyclooxygenase-2 inhibitory activities of ethanolic extracts from lemon balm (Melissa officinalis) leaves. LWT-Food Science and Technology, 49(1), 1-7.
26. Lutts, S., Kinet, J. & Bouharmont, J. (1996). NaCl-induced senescence in leaves of rice (Oryza sativa) cultivars differing in salinity resistance. Annals of Botany, 78, 389-98.
27. Nadernejad, N., Ahmadimoghadam, A., Hossyinifard, J., & Poorseyedi, S. (2013). Study of the rootstock and cultivar effect in PAL activity, production of phenolic and flavonoid compounds on flower, leaf and fruit in pistachio (Pistacia vera L.). Iranian Journal of Plant Biology, 5(15), 95-109.
28. Netto, A. T., Campostrini, E., De Oliveira, J. G. & Bressan-Smith, R. E. (2005). Photosynthetic pigments, nitrogen, chlorophyll a fluorescence and SPAD-502 readings in coffee leaves. Scientia horticulturae, 104, 199-209.
29. Noreen, Z. & Ashraf, M. (2009). Assessment of variation in antioxidative defense system in salt-treated pea (Pisum sativum) cultivars and its putative use as salinity tolerance markers. Journal of Plant Physiology, 166, 1764-1774.
30. Noroozi Shahri, F., Jalali Honarmand, S., Mondani, F., & Saeidi, M. (2020). Evaluation of growth phytohormones and different concentrations of plant derived smoke applications on growth characteristics and biological yield of medicinal plants lemon balm and basil. Journal of Crops Improvement, 22(1), 89-102. (In Farsi)
31. Oliveira Neto, C. F. D., Lobato, A. K. D. S., Gonçalves-Vidigal, M. C., Costa, R. C. L. D., Santos Filho, B. G. D., Alves, G. A. R., Maia, W. J. M. S., Cruz, F. J. R., Neves, H. K. B. & Lopes, M. S. (2009). Carbon compounds and chlorophyll contents in sorghum submitted to water deficit during three growth stages. Journal of Food, Agriculture and Environment, 7, 588-593.
32. Rademacher, W. (2015). Plant growth regulators: Backgrounds and uses in plant production. Journal of Plant Growth Regulation, 34(4), 845-872.
33. Ritchie, S.W., Nguyen, H. T. & Holaday, A. S. (1990). Leaf water content and gas-exchange parameters of two wheat genotypes differing in drought resistance. Crop Science, 30, 105-111.
34. Sayd, S. S., Taie, H. A., & Taha, L. S. (2010). Micropagation, antioxidant activity, total phenolics and flavonoids content of Gardenia jasinoides Ellis as affected by growth regulators. International Journal of Academic Research, 2(3), 184-191.
35. Schwachtje, J. & Baldwin, I. T. (2004). Smoke exposure alters endogenous gibberellin and abscisic acid pools and gibberellin sensitivity while eliciting germination in the post-fire annual, Nicotiana attenuata. Seed Science Research, 14, 51-60.
36. Shaddad, M., Hm, A. E. S. & Mostafa, D. (2013). Role of gibberellic acid (GA3) in improving salt stress tolerance of two wheat cultivars. International Journal of Plant Physiology and Biochemistry, 5, 50-57.
37. Sheligl, H. Q. (1986). Die verwertung orgngischer souren durch chlorella lincht. Planta Journal, 47-51.
38. Sinha, A. K. (1972). Colorimetric assay of catalase. Analytical Biochemistry, 47(2), 389-394.
39. Sosnowski, J., Malinowska, E., Jankowski, K., Król, J. & Redzik, P. (2017). An estimation of the effects of synthetic auxin and cytokinin and the time of their application on some morphological and physiological characteristics of Medicago x varia Martyn. Saudi Journal of Biological Sciences, 26(1), 66-73.
40. Taiz, L. & Zeiger, E. (2012). Plant Physiology. Sunderland, Massachusetts U.S.A.
41. Tavormina, P., De Coninck, B., Nikonorova, N., De Smet, I., & Cammue, B. P. (2015). The plant peptidome: An expanding repertoire of structural features and biological functions. The Plant Cell, 27(8), 2095-2118.
42. Tian, S. F., Wang, Y., Du, G., & Li, Y. X. (2011). Changes in contents and antioxidant activity of phenolic compounds during gibberellin-induced development in Vitis vinifera‘Muscat’. Acta Physiologiae Plantarum, 33(6), 2467-2475.
43. Van Staden, J., Jäger, A. K., Light, M. E., Burger, B. V., Brown, N. C. & Thomas, T. H. (2004). Isolation of the major germination cue from plant-derived smoke. South African Journal of Botany, 70(4), 654-659.
44. Vats, S., Tiwari, R., Alam, A., Behera, K. K. & Pareek, R. (2012). Evaluation of Phytochemicals, antioxidant and antimicrobial activity of in vitro culture of Vigna unguiculata Walp. Researcher, 4(11), 70-74.
45. Werner, T. & Schmülling, T. (2009). Cytokinin action in plant development. Current Opinion in Plant Biology, 12, 527-538.
46. Wingler, A., Von Schaewen, A., Leegood, R. C., Lea, P. J. & Quick, W. P. (1998). Regulation of leaf senescence by cytokinin, sugars, and light: Effects on NADH-dependent hydroxypyruvate reductase. Plant Physiology, 116, 329-335.
47. Yaronskaya, E., Vershilovskaya, I., Poers, Y., Alawady, A. E., Averina, N. & Grimm, B. (2006). Cytokinin effects on tetrapyrrole biosynthesis and photosynthetic activity in barley seedlings. Planta, 224, 700-709.

مقدمه

فیتوهورمون‌ها در مقادیر بسیار کم فرآیندهای بیوشیمیایی، فیزیولوژیک و مورفولوژیک گیاهان را تنظیم می‌کنند (Rademacher, 2015). حداقل نُه گروه از فیتوهورمون‌ها مورد مطالعه وسیع قرار گرفته‌اند. در این میان اکسین‌ها، سیتوکینین‌ها، براسینواستروئیدها، جیبرلین‌ها و استریگولاکتون‌ها نقش مهمی در رشد و توسعه نرمال گیاهان، آبسیزیک­اسید و اتیلن واسطه پاسخ به تنش‌های غیر زیستی، جاسمونیک­اسید دارای نقش در پاسخ‌های دفاعی در مقابل گیاهخواران و سالیسیلیک­اسید در مقابل پاتوژن‌ها هستند. به­علاوه طیف وسیعی از ترکیبات شیمیایی و بسیاری از پپتیدهای ترشحی به‌عنوان مولکول‌های سیگنالی، با فعالیت‌های شبه فیتوهورمونی شناخته شده‌اند (Tavormina et al., 2015). در سال‌های اخیر، نقش محرک دود حاصل از گیاهان نشان داده است که ترکیباتی بیواکتیو در آن وجود دارد. سه دسته از ترکیبات کلیدی دود شامل اکسیدهای نیتروژن، کاریکین‌ها و سیانوهیدرین‌ها مورد بررسی قرار گرفته‌اند که علی‌رغم پاسخ چند گونه گیاهی به اکسیدهای نیتروژن و سیانوهیدرین‌ها به نظر نمی‌رسد که این دسته از ترکیبات بتوانند مسئول پاسخ‌های فیزیولوژیک گیاهان تحت تیمار دود باشند (Flematti et al., 2011). کشف کاریکین‌ها دستاوردی مهم در بیوشیمی و فیزیولوژی گیاهی بود و مطالعات بعدی نشان داد که کاریکین‌ها جنبه‌های فیزیولوژیک مختلفی از چرخه زندگی گیاهان را تحت تاثیر قرار می‌دهند و وقتی در غلظت‌های کم استفاده می‌شوند دارای فعالیت‌های شبه­فیتوهورمونی هستند (Jain et al., 2008). مطالعه روی اثرات ژنوتوکسیک و سیتوتوکسیک دودآب هیچ نوع ژنوتوکسیتی و آسیب به DNA را برای دودآب و کاریکین‌های حاصل از آن نشان نداده است. بنابراین دودآب نهاده‌ای ایمن است که می‌توان از محرک‌های زیستی آن در جهت افزایش عملکرد محصولات زراعی و باغبانی استفاده کرد. آگروکمیکال‌های موجود در دود، ترکیباتی فرار، پایدار در برابر حرارت، محلول و مانا در آب هستند؛ لذا عصاره آبی دود یا اصطلاحاً دودآب روشی تسهیل­شده در کاربرد آن می‌باشد
 (Light et al., 2015). مطالعات نشان می‌دهد که فیتوهورمون‌های رشد موجب بهبود وضعیت بیوشیمیایی گیاهان می‌شوند. بهبود پارامترهای فتوسنتزی (Kumar et al., 2001)، افزایش محتوای کلروفیل کل، کاروتنوئیدها (Bose et al., 2013; Kavina et al., 2011) و ترکیبات فنولی
 (Tian et al., 2011; Sayd et al., 2010)، همچنین افزایش محتوای پروتئین‌های‌ محلول و سرعت فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان (Karalija et al., 2017) در گیاهان مختلف تحت کاربرد خارجی هر یک از فیتوهورمون‌های رشد (اکسین، سیتوکینین و اسید­جیبرلیک) گزارش شده است. عصاره‌های آبی دود نیز دارای پاسخ‌های شبه فیتوهورمونی و همچنین برهمکنش با فیتوهورمون‌های درون‌زاد و برون کاربرد گیاهان هستند (Aremu et al., 2016;
Jain et al., 2008). ترکیبات بیواکتیو دود حاصل از گیاهان می‌توانند جایگزین الگوهای درونی فیتوهورمون‌ها در طول جوانه‌زنی شوند
 (Schwachtje & Baldwin, 2004). علاوه­بر­این مشاهده شده است که کاربرد دودآب و کاریکینولید حاصل از آن در غلظت‌های پایین در حد نانومولار موجب افزایش سرعت فتوسنتز و همچنین افزایش محتوای کلروفیل کل، محتوای کاروتنوئیدها و ترکیبات فنولی می‌شوند (Aremu et al., 2012; Abdelgadir et al., 2013).

بادرنجبویه (Melissa officinalis L.) یک گیاه دارویی پایا از تیره نعناعیان است. این گیاه حاوی متابولیت‌های ارزشمندی عمدتاً متعلق به دو گروه شیمیایی شامل ترکیبات ترپنی و فنیل پروپانوئیدی با ظرفیت بالای آنتی‌اکسیدانی، ضد میکروبی و ضد پروتوزوایی می‌باشد (Cunha et al., 2016; Lin et al., 2012). از­آن‌جایی­که عملکرد کمی و کیفی گیاهان دارویی علاوه بر ژنتیک به­شدت تحت تاثیر عوامل محیطی و مدیریت کشت واقع می‌شود؛ بنابراین استفاده از ترکیبات محرک مانند دودآب می‌تواند با بهبود کارایی بیوشیمیایی و افزایش تولید این گیاهان گامی مهم در پیشبرد اهداف ملی اعم از خودکفایی دارویی، ایجاد اشتغال و توسعه اقتصادی باشد. بررسی منابع انجام­شده نشان می‌دهد که اخیراً استفاده از دود حاصل از سوختن گیاهان و ترکیبات بیواکتیو آن به‌عنوان تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی در پژوهش‌های علمی رواج یافته است؛ ولی مطالعات انجام­شده عمدتاً در زمینه تحریک جوانه‌زنی بذر و افزایش قدرت گیاهچه بوده و کمتر به تاثیر این ترکیبات در سطح سلولی و بیوشیمیایی به‌عنوان یک شبه فیتوهورمون پرداخته شده است. لذا این پژوهش به مقایسه پاسخ‌های فیزیولوژیک و بیوشیمیایی گیاه دارویی بادرنجبویه به غلظت‌های مختلف دودآب و فیتوهورمون‌های رشد (سیتوکینین، اکسین و اسید­جیبرلیک) می‌پردازد.

مواد و روش‌ها

این آزمایش در سال 1396 در گلخانه تحقیقاتی پردیس کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه رازی به صورت اسپلیت­پلات در زمان بر پایه طرح بلوک‌های کامل تصادفی با سه تکرار اجرا شد. در این آزمایش هشت سطح محلول‌پاشی برگی گیاه بادرنجبویه (شامل شاهد، دودآب با غلظت‌های 1:5000، 1:1000، 1:500 و 1:100 (v/v) به همراه فیتوهورمون‌های سیتوکینین، اسید­جیبرلیک و اکسین هر یک با غلظت 50 میکرومولار) در پلات‌های اصلی و دو چین برداشت در پلات‌های فرعی قرار گرفت. فیتوهورمون‌های مورد استفاده عبارت از 6-بنزیل آمینوپورین (6-BAP) (سیتوکینین)، اسید­جیبرلیک (GA₃) و 3-ایندول استیک اسید (IAA) (اکسین) ساخت شرکت سیگما آلدریچ بودند. تیمار شاهد شامل محلول‌پاشی با آب مقطر بود. در هر 250 میلی‌لیتر از محلول‌های مورد استفاده که شامل آب مقطر واحدهای آزمایشی شاهد نیز می‌شد از یک قطره توئین 20 به‌عنوان سورفکتانت استفاده شد.

جهت تهیه دودآب بر مبنای روش Van Staden et al. (2004) دستگاهی بهبود­یافته با شماره ثبت اختراع 990019 در سازمان ثبت اسناد و املاک کشور طراحی شد. با استفاده از این دستگاه دود ناشی از سوختن اندام‌های خشک گیاهی، ابتدا از مخزنی حاوی آب مقطر تا زمان سوختن کامل ماده گیاهی عبور داده شد؛ به­طوری­که آب مقطر کاملاً به رنگ تیره و چگال درآمد. محلول حاصل پس از عبور از کاغذ صافی نمره یک واتمن به‌عنوان محلول پایه در نظر گرفته شد (با شماره ثبت اختراع 100737 در سازمان ثبت اسناد و املاک کشور) و سپس با استفاده از آب مقطر در غلظت‌های مورد نظر رقیق و جهت اعمال تیمارها به کار برده شد. در این مطالعه برای تهیه دودآب از اندام‌های هوایی و خشک گیاه شقایق (Papaver rhoeas L.) در مرحله گلدهی استفاده شد. انتخاب این گیاه و غلظت‌های مورد مطالعه تیمار دودآب، بر اساس نتایج حاصل از پیش­آزمون‌های مربوط به تهیه محلول پایه استاندارد از چند گونه گیاهی، فراوانی آن در منطقه مورد مطالعه و پاسخ گیاهان مختلف از جمله بادرنجبویه به تیمارهای اعمال­شده صورت گرفت.

کرت‌های آزمایشی در زمین گلخانه تهیه شد. بستر کاشت شامل خاک مزرعه، کود دامی و ماسه به نسبت 1-1-1 بود. مشخصات فیزیکی و شیمیایی خاک مزرعه مورد استفاده در جدول 1 آمده است. بذر گیاه بادرنجبویه از مرکز ملی ذخایر ژنتیکی و زیستی ایران تهیه شد. بذرها به­طور مستقیم در عمق یک سانتی‌متری خاک کشت شدند. تراکم نهایی کاشت 10 بوته در متر مربع بود. در طول دوره رشد دمای گلخانه بین 22 تا 30 درجه سانتی‌گراد و رطوبت نسبی هوا 60 درصد بود و آبیاری بسته به نیاز گیاه انجام می‌شد.

جدول 1- خصوصیات فیزیکی و شیمیایی خاک محل آزمایش

Table 1. Physical and chemical characteristics of experiment location soil

پس از استقرار کامل بوته‌ها و رسیدن آن‌ها به ارتفاع حدود 15 سانتی‌متر اقدام به اعمال تیمارها شد. برداشت گیاهان در چین اول از ارتفاع 10 سانتی‌متر انجام شد. محلول‌پاشی برای چین دوم پس از رسیدن گیاهان به مرحله رشدی مطابق با چین اول صورت گرفت. در هر یک از چین‌ها، محلول‌پاشی به­مدت چهار هفته و در هر هفته دو روز متوالی بین ساعت‌های 18 تا 20 به وسیله سمپاش دستی انجام شد. سه روز پس از اعمال آخرین تیمار در هر چین، اقدام به ثبت تمامی صفات مورد مطالعه یا نمونه‌برداری جهت اندازه‌گیری‌های آزمایشگاهی شد. این صفات شامل محتوای رنگدانه‌های فتوسنتزی، پارامترهای تبادلات گازی، شاخص‌های فلورسانس کلروفیل، محتوای پروتئین‌ها و کربوهیدرات‌های محلول، سرعت فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان، مقدار نشت الکترولیت‌ها از غشای پلاسمایی، محتوای ترکیبات فنولیک شامل فنول کل و آنتوسیانین‌ها بود. سنجش تمامی صفات مذکور روی آخرین برگ‌های کاملاً توسعه­یافته گیاه انجام شد. اندازه‌گیری محتوای رنگدانه‌های فتوسنتزی به­روش Arnon (1967) در طول موج‌های 663 نانومتر برای کلروفیل a، 645 نانومتر برای کلروفیل b و 470 نانومتر برای کاروتنوئیدها توسط دستگاه الایزا
(مدل BioTek, Powerwave, XS2) اندازه‌گیری و سپس کمی‌سازی شد. شاخص‌های فلورسانس کلروفیل با استفاده از دستگاه فلورومتر (PEA: Plant Efficiency Analyser) (مدل Pocket Pea, Hansatech Instruments Ltd. UK) اندازه‌گیری شد. آخرین برگ توسعه‌یافته گیاه با استفاده از گیره مخصوص دستگاه به مدت 30 دقیقه در تاریکی قرار گرفت و شاخص زنده‌مانی (PI)، حداکثر کارایی فتوشیمیایی فتوسیستم ‌II (Maximum Photochemical Efficiency of PS-II) (Fv/Fm) و کارایی کمپلکس تجزیه‌کننده آب در فتوسیستم ‌II (Fv/F0) در برگ‌های سازگار به تاریکی اندازه‌گیری شد. سرعت فتوسنتز در واحد سطح برگ، هدایت روزنه‌ای، سرعت تعرق، غلظت دی‌اکسید‌کربن اتاقک زیر روزنه و دمای برگ با استفاده از دستگاه فتوسنتزمتر
 (Portable LCi، ساخت شرکت Bio scientific Ltd) اندازه‌گیری شد.

تمامی اندازه‌گیری‌ها در ساعت 10 تا 11 صبح انجام شد. هدایت مزوفیلی از تقسیم سرعت فتوسنتز به غلظت دی‌اکسید‌کربن درون روزنه‌ها به­دست آمد (Fischer et al., 1998). همچنین به­منظور تعیین کارایی مصرف آب فتوسنتزی، سرعت فتوسنتز به هدایت روزنه‌ای تقسیم شد (Ritchie et al., 1990).

جهت اندازه‌گیری پروتئین‌های محلول و سرعت فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان شامل پراکسیداز، سوپر‌اکسید دیسموتاز و کاتالاز، ابتدا اقدام به تهیه بافر استخراج، عصاره گیاهی و بافر فسفات شد. اندازه‌گیری محتوای پروتئین‌های محلول موجود در برگ به­روش
 Bradford (1976) و با استفاده از عصاره گیاهی و معرف بلو انجام شد. برای رسم منحنی استاندارد محلول‌های صفر، 25، 50 و 100 پی‌پی‌ام از آلبومین گاوی در بافر استخراج تهیه شد. مقدار جذب نوری تیمارها و محلول‌های استاندارد در طول موج 595 نانومتر اندازه‌گیری و سپس نمودار پراکنش این دو پارامتر رسم و خط رگرسیون مربوطه برازش داده شد. سرعت فعالیت آنزیم پراکسیداز به روش
 Chance & Maehly (1955) با استفاده از عصاره گیاهی و سوبسترای آنزیم و محاسبه H₂O₂ مصرف­شده در طول موج 470 نانومتر اندازه‌گیری شد. مقدار H₂O₂ موجود در مخلوط واکنش با استفاده از مفهوم قانون بیر-لامبرت و ضریب خاموشی آنزیم پراکسیداز (0266/0 سانتی‌متر بر مول) محاسبه شد. در نهایت سرعت فعالیت این آنزیم به صورت میکرومول H₂O₂ مصرف­شده در دقیقه (تعداد واحدهای آنزیم) در میلی‌گرم پروتئین‌های محلول بیان شد. سرعت فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز به روش
 Beauchamp & Fridovich (1971) از طریق اندازه‌گیری توانایی آن در جلوگیری از احیای نوری نیتروبلوتترازولیوم و با استفاده از طول موج 560 نانومتر محاسبه شد. در نهایت سرعت فعالیت این آنزیم به صورت میکرومول H₂O₂ تولید­شده در دقیقه (تعداد واحدهای آنزیم) در میلی‌گرم پروتئین‌های محلول بیان شد. سرعت فعالیت آنزیم کاتالاز به­روش Sinha (1972) و با استفاده از محاسبه کاهش جذب H₂O₂ در طول موج 570 نانومتر انجام شد. مقدار H₂O₂ موجود در مخلوط واکنش با استفاده از مفهوم قانون بیر-لامبرت و ضریب خاموشی آنزیم کاتالاز (0394/0 سانتی‌متر بر مول) محاسبه شد.

برای سنجش محتوای فنول کل به روش
 Noreen & Ashraf (2009) از معرف فولین سیکالتو و استاندارد گالیک اسید استفاده شد و مقدار جذب نوری محلول واکنش در طول موج 750 نانومتر قرائت شد. جهت رسم منحنی استاندارد محلول گالیک­اسید با غلظت 100 میکروگرم بر میلی‌لیتر تهیه و سپس از این محلول پایه غلظت‌های پنج، ده، 15، 20 و 30 میکروگرم بر میلی‌لیتر آماده شد و سایر مراحل کار همانند نمونه‌های اصلی انجام گرفت. در نهایت مقدار کل ترکیبات فنولی نمونه بر حسب میلی‌گرم گالیک­اسید بر گرم وزن تر محاسبه شد. محتوای آنتوسیانین‌ها به روش Nadernejad et al. (2013) و با عصاره‌گیری مواد گیاهی در متانول اسیدی (متانول خالص و اسید­کلریدریک خالص به نسبت حجمی 99 به یک) سنجش و جذب نوری آن در طول موج 550 نانومتر اندازه‌گیری شد. کمی‌سازی این ترکیبات با استفاده از مفهوم قانون بیر-لامبرت و در­نظر­گرفتن ضریب خاموشی 33000 سانتی‌متر بر مول محاسبه شد. اندازه‌گیری محتوای کربوهیدرات‌های محلول به روش فنل-اسیدسولفوریک انجام شد (Sheligl, 1986) و مقدار جذب نوری محلول واکنش در طول موج 488 نانومتر قرائت شد. جهت تهیه استانداردها ابتدا محلول‌های 20، 40، 60 و 80 پی‌پی‌ام گلوکز تهیه و سایر مراحل کار همانند نمونه‌های اصلی انجام شد. سپس با توجه به مقادیر جذب نوری منحنی استاندارد رسم شده و مقدار این ترکیبات برحسب میلی‌گرم کربوهیدرات محلول در گرم وزن خشک برگ به­دست آمد. اندازه‌گیری پایداری غشای سلولی به روش
 Lutts et al. (1996) انجام گرفت. به­این­منظور 5/0 گرم دیسک برگی در فالکون‌های حاوی 20 میلی‌لیتر آب مقطر در دمای 25 درجه سانتی‌گراد به مدت 24 ساعت قرار داده شد. سپس هدایت الکتریکی آن‌ها توسط هدایت‌سنج الکتریکی (مدل ExStik®II, EC500) اندازه‌گیری شد (EC1). سپس نمونه‌ها به مدت 20 دقیقه در بن‌ماری با دمای 100 درجه سانتی‌گراد قرار داده شدند و پس از رسیدن دمای آن‌ها به دمای اتاق هدایت الکتریکی آن‌ها مجدداً اندازه‌گیری شد (EC2). پایداری غشای سلولی از نسبت EC1 به EC2 و به صورت درصد به­دست آمد. در نهایت داده‌های حاصل پس از بررسی نرمال­بودن با نرم‌افزار SAS نسخه 4/9 آنالیز و با استفاده از آزمون حداقل اختلاف معنی‌دار (LSD) در سطح پنج درصد مقایسه میانگین شدند.

نتایج و بحث

محتوای رنگدانه‌های فتوسنتزی

نتایج تجزیه واریانس نشان داد که مقدار کلروفیل a، b و کلروفیل کل و محتوای کاروتنوئیدها به‌طور معنی‌داری تحت تاثیر سطوح محلول‌پاشی قرار گرفتند (جدول 2). بیشترین محتوای کلروفیل a (29/1 میلی‌گرم بر گرم وزن تر برگ) مربوط به دودآب‌های 1:500 و 1:100 (v/v) و کمترین مقدار آن (93/0 میلی‌گرم بر گرم وزن تر برگ) مربوط به تیمار شاهد بود. بیشترین مقدار کلروفیل b (75/0 میلی‌گرم در گرم وزن تر برگ) مربوط به دودآب 1:100 (v/v) بدون تفاوت معنی‌دار با دودآب 1:500 (v/v) و سیتوکینین و کمترین مقدار آن (41/0 میلی‌گرم در گرم وزن تر برگ) مربوط به تیمار شاهد بود. بیشترین مقدار کلروفیل کل (04/2 میلی‌گرم بر گرم وزن تر برگ) از دودآب 1:100 (v/v) بدون اختلاف معنی‌دار با دودآب 1:500 (v/v) و سیتوکینین و کمترین مقدار آن (35/1 میلی‌گرم بر گرم وزن تر برگ) از تیمار شاهد حاصل شد (جدول 3).

نسبت کلروفیل a به کلروفیل b تحت تاثیر معنی‌دار سطوح محلول‌پاشی و چین‌های برداشت قرار نگرفت (جدول 2). بیشترین محتوای کاروتنوئیدها (54/0 میلی‌گرم در گرم وزن تر برگ) مربوط به دودآب 1:500 (v/v) بدون تفاوت معنی دار با دودآب 1:100 (v/v) و کمترین مقدار آن (38/0 میلی‌گرم در گرم وزن تر برگ) مربوط به تیمار شاهد بود (جدول 3). نسبت محتوای کلروفیلی به محتوای کاروتنوئیدی به­طور معنی‌داری تحت تاثیر سطوح محلول‌پاشی قرار گرفت (جدول 2). بیشترین مقدار این نسبت مربوط به دودآب 1:100 (v/v) (19/1) بدون اختلاف معنی‌دار با دودآب 1:500 (v/v) و سیتوکینین بود؛ در­حالی­که سایر تیمارها تفاوت معنی‌داری با هم و با تیمار شاهد (59/0) نداشتند (جدول 3). مشاهده شده است که سیگنال‌دهی سیتوکینین و نور در سطح ژن ARR4
(Arabidopsis Responsse Regulator4) و فیتوکروم B همگرا است؛ لذا می‌توان گفت که سیتوکینین می‌تواند بیان بسیاری از ژن‌های هسته‌ای و کلروپلاستی را تنظیم کند (Yaronskaya et al., 2006). تنظیم این ژن‌ها می‌تواند در جهت افزایش بیوسنتز 5-آمینولِوولینیک اسید (5-Aminolevulinic acid)، افزایش بیان ژن‌های کد­کننده آنزیم‌های NADPH-پروتوکلروفیلید اکسیدوردوکتاز (NADPH-protochlorophyllide oxidoreductase)، منیزیم پروتوپورفیرین IX کلاتاز (Mg protoporphyrin IX chelatase) و منیزیم پروتوپورفیرین IX متیل ترانسفراز (Mg protoporphyrin IX methyltransferase) یا کاهش بیان ژن‌های کد­کننده آنزیم‌های کلروفیلاز (Chlorophyllase) و منیزیم کلاتاز (Mg chelatase) باشد (Costa et al., 2005 Yaronskaya et al., 2006,). دودآب در غلظت‌های 1:100 و 1:500 (v/v) بدون اختلاف معنی‌دار با سیتوکینین، محتوای کلروفیل را افزایش داد. با توجه به این مورد می‌توان گفت که احتمالاً مکانیسم اثر دودآب نیز همانند سیتوکینین و وابسته به افزایش بیوسنتز پیش ماده‌ها، افزایش بیان ژن‌های کد­کننده آنزیم‌های درگیر در مسیر بیوسنتز یا کاهش بیان ژن‌های کد­کننده آنزیم‌های تخریب کلروفیل باشد. این نتایج با نتایج Ghebrehiwot et al. (2013) که مشاهده کردند دود در تمامی شکل‌های کاربردی مانند دود آئروسل، دودآب و همچنین کاریکینولید حاصل از آن موجب افزایش سطح کلروفیل a، b و کلروفیل کل شد مطابقت دارد.

جدول 2- تجزیه واریانس رنگدانه‌های فتوسنتزی برگ‌های بادرنجبویه تحت تاثیر سطوح مختلف محلول‌پاشی و چین‌های برداشت

Table 2. Analysis of variance for photosynthetic pigments of lemon balm leaves as affected by different levels of foliar application and harvesting stages

ns، * و ** به­ترتیب عدم وجود تفاوت معنی‌دار، معنی‌دار­بودن در سطح یک درصد و پنج درصد را نشان می‌دهد.

ns, * and ** are non-significant, significant at 1% and 5% level of probability, respectively.

جدول 3- اثر سطوح مختلف محلول‌پاشی روی رنگدانه‌های فتوسنتزی برگ‌های بادرنجبویه

Table 3. Effect of different levels of foliar application on photosynthetic pigments of lemon balm leaves

Ctrl: شاهد، SW: دودآب، Ck: سیتوکینین، GA: اسید­جیبرلیک و IAA: اکسین.

Ctrl: control, SW: Smoke-Water, CK: Cytokinin, GA: Gibberellic acid and IAA: Auxin

نتایج حاصل از این پژوهش نشان داد که دودآب‌های با غلظت بیشتر موجب افزایش محتوای کاروتنوئیدی شدند که با نتایج Ghebrehiwot et al. (2013) مطابقت نداشت. فیتوهورمون‌های استفاده­شده نیز نتیجه بینابینی و وابسته به غلظت در مقدار ترکیبات کاروتنوئیدی ایفا کردند و محتوای این ترکیبات در آن‌ها حد واسط بین دودآب‌های رقیق‌تر یعنی 1:5000، 1:1000 (v/v) و دودآب‌های غلیظ‌تر یعنی 1:100، 1:500 (v/v) بود. فیتوهورمون‌ها می‌توانند با تاثیر بر ژن‌های کد­کننده مسیر بیوسنتز ژرانیل پیروفسفات سنتز کاروتنوئیدها را تحت تاثیر قرار دهد
 (Shaddad et al., 2013). کاربرد فیتوهورمون‌ها به­ویژه سیتوکینین از طریق افزایش غلظت کاروتنوئیدها، موجب محافظت کلروفیل در برابر اکسیداسیون نوری می‌شود (Candan & Tarhan, 2003)

با­توجه­به اینکه صرف نظر از تغییرات نوری و دمایی گلخانه، گیاه در شرایط نسبتاً مطلوبی بود و تنش قابل توجهی وجود نداشت، پس بیان علت دقیق افزایش کاروتنوئیدها در چین‌های برداشت و سطوح محلول‌پاشی چندان ساده نیست. اما بررسی نسبت مقدار محتوای کلروفیل به محتوای کاروتنوئید شاخص مناسب‌تری به نظر می‌رسد. زیرا محتوای کل کلروفیل نشان‌دهنده ویژگی‌های سرسبزی در گیاهان است (Netto et al., 2005). نتایج حاصل از مطالعه حاضر نشان داد که دودآب 1:100 (v/v) بدون تفاوت معنی‌دار با سیتوکینین و دودآب 1:500 (v/v) موجب حصول نسبت کلروفیل کل به کاروتنوئیدهای بالاتری در مقایسه با شاهد شد که با نتایج پیشین مطابقت داشت (Ghebrehiwot et al., 2013; Sosnowski et al., 2017).

پارامترهای کلروفیل فلورسانس

حداکثر کارایی فتوشیمیایی فتوسیستم II، شاخص زنده‌مانی و کارآیی کمپلکس تجزیه‌کننده آب در فتوسیستم II در چین‌های برداشت اختلاف معنی‌داری داشتند ولی هیچ­یک از پارامترهای فلورسانس کلروفیل تحت تاثیر معنی‌دار سطوح محلول‌پاشی قرار نگرفت (جدول 4). حداکثر کارایی فتوشیمیایی فتوسیستم II در چین‌های اول و دوم به­ترتیب برابر با 81/0 و 82/0 بود. چین‌های اول و دوم به­ترتیب دارای شاخص زنده‌مانی برابر با 05/14 و 44/16 بودند. کارآیی کمپلکس تجزیه‌کننده آب در فتوسیستم II نیز در چین‌های اول و دوم برابر با 49/4 و 65/4 بود (جدول 5). عدم تاثیر معنی‌دار سطوح مختلف محلول‌پاشی بر پارامترهای فلورسانس کلروفیل می‌تواند دلایل متعددی از جمله پاسخ‌دهندگی کمتر به فیتوهورمون‌های برون‌زاد یا آگروکمیکال‌های دود یا بهینه کارایی زنجیره انتقال الکترون در شرایط نرمال در این گیاه باشد که بیش از آن تحت کاربرد مواد مذکور امکان‌پذیر نبوده است.

پارامترهای تبادلات گازی

سرعت فتوسنتز، سرعت تعرق و هدایت روزنه‌ای به­طور معنی‌داری تحت تاثیر سطوح محلول‌پاشی قرار گرفتند (جدول 6). بیشترین سرعت فتوسنتز (42/8 میکرومول دی‌اکسید‌کربن بر متر مربع در ثانیه) مربوط به سیتوکینین بود که تفاوت معنی‌داری با دودآب 1:100 (v/v) و پس از آن با دودآب 1:500 (v/v)، اسید­جیبرلیک و اکسین نداشت. کمترین سرعت فتوسنتز (95/3 میکرومول دی‌اکسید‌کربن بر متر مربع در ثانیه) نیز مربوط به تیمار شاهد بود (جدول 7). بیشترین سرعت تعرق (47/3 میلی‌مول آب بر متر مربع در ثانیه) مربوط به دودآب 1:100 (v/v) بدون تفاوت معنی‌دار با تیمار سیتوکینین و دودآب 1:500 (v/v) و کمترین مقدار آن (37/1 میلی‌مول آب بر متر مربع در ثانیه) مربوط به دودآب 1:5000 (v/v) بود (جدول 7).

بیشترین هدایت روزنه‌ای (12/0 مول بر متر مربع در ثانیه) مربوط به دودآب 1:100 (v/v) بدون تفاوت معنی‌دار با سیتوکینین و کمترین مقدار آن (05/0 مول بر متر مربع در ثانیه) مربوط به دودآب 1:1000 (v/v) بدون تفاوت معنی‌دار با تیمار شاهد و دودآب 1:5000 (v/v) بود (جدول 7).

جدول 4- تجزیه واریانس پارامترهای فلورسانس کلروفیل برگ‌های بادرنجبویه تحت تاثیر سطوح مختلف محلول‌پاشی و چین‌های برداشت

Table 4. Analysis of variance for chlorophyll fluorescence parameters of lemon balm leaves as affected by different levels of foliar application and harvesting stages

ns، * و ** به­ترتیب عدم وجود تفاوت معنی‌دار، معنی‌دار­بودن در سطح یک درصد و پنج درصد را نشان می‌دهد.

ns, * and ** are non-significant, significant at 1% and 5% level of probability, respectively.

جدول 5- اثر چین‌های برداشت روی پارامترهای فلورسانس کلروفیل برگ‌های بادرنجبویه

Table 5. Effect of harvest stages on chlorophyll fluorescence parameters of lemon balm leaves

دمای برگ به­طور معنی‌داری تحت تاثیر چین‌های برداشت قرار گرفت. دمای برگ در چین اول و دوم به­ترتیب برابر با 64/33 و 72/30 درجه سانتی‌گراد بود (جدول 9).

افزایش سرعت فتوسنتز تحت کاربرد سیتوکینین با نتایج Gupta et al. (2000) مطابقت داشت. سیتوکینین‌ها می‌توانند از مسیرهای مختلفی همچون افزایش تمایز کلروپلاست‌ها و یا افزایش رونویسی و ترجمه ژن‌های کد­کننده آنزیم‌های درگیر در مسیر فتوسنتز مانند کربنیک­انیدراز، نیترات ردوکتاز، سرعت و کارایی فتوسنتز را افزایش دهند
 (Taiz & Zeiger, 2012). چرا که کربنیک­انیدراز در بافت‌های فتوسنتزی گیاهان C3 و C4 دسترسی دی‌اکسید‌کربن برای روبیسکو را به­وسیله کاتالیزه­کردن واکنش برگشت‌پذیر هیدراته­شده دی‌اکسید‌کربن، تنظیم می‌کند و نیترات ردوکتاز موجب شروع متابولیسم نیترات و متعاقباً سنتز پروتئین در گیاهان می‌شود. فعالیت نیترات­ردوکتاز بسیار متغیر و وابسته به حضور فیتوهورمون‌ها می‌باشد (Hayat & Ahmad, 2003). بنابراین احتمال می‌رود که کاربرد فیتوهورمون‌های مورد مطالعه خصوصاً سیتوکینین در غروب روزهای اعمال تیمار، موجب افزایش سطح پروتئین‌ها و آنزیم‌های مورد نیاز برای آسمیلاسیون در طی شب و افزایش سرعت فتوسنتز در طول روزهای پیش رو شده باشد. افزایش هدایت روزنه‌ای تحت تیمارهای دودآب و سیتوکینین نیز احتمالاً به­دلیل افزایش فعالیت کامبیومی و تشکیل بافت‌های آوندی می‌باشد (Aldesuquy, 2000). عدم تطابق نتایج این مطالعه با نتایج Gilbert et al. (2002) احتمالاً به خاطر تفاوت در روش اعمال ترکیبات بیواکتیو دود بر گیاهان، دمای مناسب دودآب نسبت به دود آئروسل و عدم آسیب به آنزیم‌های حساس به دما مانند روبیسکو بود. علاوه­بر­این دودآب اثر منفی بسته­شدن روزنه‌ها در اثر غلظت بالای دی‌اکسید‌کربن موجود در دود آئروسل را نیز مرتفع کرد (Gilbert et al., 2002).

محتوای فنول کل و آنتوسیانین‌ها

محتوای فنول کل برگ به طور معنی‌داری تحت تاثیر سطوح محلول‌پاشی قرار گرفت (جدول 6). بیشترین محتوای فنول کل (92/0 میلی‌گرم گالیک­اسید بر گرم وزن تر برگ) مربوط به دودآب 1:500 (v/v) بدون تفاوت معنی‌دار با اکسین و کمترین مقدار آن (57/0 میلی‌گرم گالیک­اسید بر گرم وزن تر برگ) مربوط به تیمار شاهد بود (جدول 7). محتوای آنتوسیانین‌های برگ تحت تاثیر معنی‌دار سطوح محلول‌پاشی و چین‌های برداشت قرار نگرفت (جدول 6). افزایش ترکیبات فنولیک در اثر کاربرد فیتوهورمون‌ها
 (Vats et al., 2012) و دودآب (Aremu et al., 2012) گزارش شده است. فیتوهورمون‌ها و ترکیبات شبه فیتوهورمونی دودآب تغییر در محتوای این ترکیبات را با تاثیر بر بیان ژن‌های کلیدی مسیر بیوشیمیایی فنیل­پروپانوئید و مسیرهای ثانویه متابولیسم کربن موجب می‌شوند. علی‌رغم افزایش مقدار فنول کل، محتوای رنگدانه‌های فلاوونوئیدی آنتوسیانین‌ها تحت تاثیر سطوح محلول‌پاشی قرار نگرفت. احتمالاً عدم تغییر معنی‌دار آنتوسیانین‌ها با وجود افزایش محتوای ترکیبات فنولیک، تولید سایر فنول‌ها باشد. علاوه­بر­این سیستم دفاعی آنتوسیانینی بیشتر در گیاهچه‌ها و ابتدای نمو مشاهده می‌شود (Candan & Tarhan, 2003)، بنابراین متاثر­نشدن این رنگدانه‌ها در مرحله نموی مورد مطالعه امری بدیهی می‌باشد.

محتوای کربوهیدرات‌های محلول

محتوای کربوهیدرات‌های محلول برگ به­طور معنی‌داری تحت تاثیر سطوح محلول‌پاشی و چین‌های برداشت قرار گرفت (جدول 8). بیشترین مقدار کربوهیدارت‌های محلول برگ مربوط به تیمار شاهد (23/378 میلی‌گرم بر گرم وزن خشک برگ) بدون تفاوت معنی‌دار با دودآب‌های 1:5000 و 1:1000 (v/v) و کمترین مقدار آن (38/189 میلی‌گرم بر گرم وزن خشک برگ) مربوط به دودآب 1:100 (v/v) بود (شکل a-1). چین اول دارای 25/280 و چین دوم دارای 10/314 میلی‌گرم کربوهیدرات‌های محلول در گرم وزن خشک برگ بود (جدول 9).

کاهش قابل ملاحظه محتوای کربوهیدرات‌های محلول در گیاهان تیمار­شده با دودآب 1:100 (v/v) همراه با اثرات مثبت سایر پارامترهای فتوسنتزی می‌تواند بهبود عملکرد کمی و کیفی گیاه بادرنجبویه ناشی از کاربرد دودآب را توجیه کند (Noroozi Shahri et al., 2020)؛ زیرا افزایش محتوای گلوکز و فروکتوز موجب کاهش فعالیت آنزیم‌های فتوسنتزی و تنفسی مانند روبیسکو و هیدروکسی­پیرووات­ردوکتاز می‌شود. علاوه­بر­این گلوکز و ساکارز رونویسی ژن‌های فتوسنتزی را مهار می‌کنند. حتی در گیاهان جوان نیز افزایش تجمع کربوهیدرات‌های محلول موجب کاهش کلروفیل، کاهش پروتئین‌های فتوسنتزی، انقطاع فلوئم و حذف مخازن می‌شود. در این شرایط خصوصاً اگر شار فوتونی نیز کم باشد پیری برگ‌ها تسریع می‌شود. مطالعات نشان می‌دهند که کاربرد فیتوهورمون‌ها می‌تواند برخی از پاسخ‌های گیاه ناشی از حضور کربوهیدرات‌های محلول را مهار کند (Wingler et al., 1998).

جدول 6- تجزیه واریانس پارامترهای فتوسنتزی و ترکیبات فنولیک برگ‌های بادرنجبویه تحت تاثیر سطوح مختلف محلول‌پاشی و چین‌های برداشت

Table 6. Analysis of variance for photosynthetic parameters and phenolic compounds of lemon balm leaves as affected by different levels of foliar application and harvesting stages

ns، * و ** به­ترتیب عدم وجود تفاوت معنی‌دار، معنی‌دار­بودن در سطح یک درصد و پنج درصد را نشان می‌دهد.

ns, * and ** are non-significant, significant at 1% and 5% level of probability, respectively.

جدول 7- اثر سطوح مختلف محلول‌پاشی روی پارامترهای فتوسنتزی و محتوای فنول کل برگ‌های بادرنجبویه

Table 7. Effect of different levels of foliar application on photosynthetic parameters and total phenolic content of lemon balm leaves

Ctrl: شاهد، SW: دودآب، Ck: سیتوکینین، GA: اسید­جیبرلیک و IAA: اکسین.

Ctrl: control, SW: Smoke-Water, CK: Cytokinin, GA: Gibberellic acid and IAA: Auxin

مصرف دودآب و سیتوکینین موجب افزایش رشد، افزایش انتقال ساکارز از برگ‌ها به­سوی مخازن، کاهش مقدار ساکارز درون سلول‌های منبع و کاهش محتوای کربوهیدرات‌های محلول این تیمارها نسبت به شاهد می‌شود (Oliveira Neto et al., 2009). این نتایج با مشاهدات Iqbal et al. (2018) مطابقت دارد. معنی‌دار­بودن مقدار کربوهیدرات‌های محلول در دو چین مختلف گیاه نیز در اثر تغییر طول روز و مقدار فوتون دریافتی توجیه می‌شود. زیرا با ورود گیاه به شرایط طول روز کوتاه مقدار فیتوهورمون‌های درونی آن تغییر می‌یابد (Wingler et al., 1998).

محتوای پروتئین‌های محلول و سرعت فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان

محتوای پروتئین‌های محلول برگ از نظر آماری تحت تاثیر سطوح محلول‌پاشی و چین‌های برداشت قرار نگرفت. سرعت فعالیت آنزیم پراکسیداز، سوپراکسید­دیسموتاز و کاتالاز نیز از نظر آماری تحت تاثیر هیچ یک از تیمارهای مختلف محلول‌پاشی قرار نگرفتند. تنها سرعت فعالیت آنزیم کاتالاز تحت تاثیر معنی‌دار چین‌های برداشت واقع شد (جدول 8). سرعت فعالیت آنزیم کاتالاز در چین اول برابر با 86/1346 و در چین دوم برابر با 33/1160 واحد آنزیمی بر میلی‌گرم پروتئین‌های محلول بود (جدول 9).

نشت الکترولیت‌ها از غشای پلاسمایی

درصد نشت الکترولیت‌ها از غشای پلاسمایی سلول‌های برگ به طور معنی‌داری تحت تاثیر سطوح محلول‌پاشی و چین‌های برداشت قرار گرفت (جدول 8). بیشترین مقدار نشت الکترولیت‌ها (92/90 درصد) مربوط به غشای پلاسمایی سلول‌های برگ گیاهان شاهد بدون تفاوت معنی‌دار با دودآب‌های 1:5000 و 1:1000 (v/v) و کمترین مقدار آن (76/71 درصد) مربوط به دودآب 1:100 (v/v) بدون تفاوت معنی‌دار با دودآب 1:500 (v/v) و فیتوهورمون‌های مورد مطالعه بود (شکل b-1). چین اول و چین دوم برداشت به­ترتیب دارای نشت الکترولیت‌ها از غشای پلاسمایی برابر با 05/84 و 49/77 درصد بود (جدول 9). ثبات بیشتر غشاهای سلولی و نشت کمتر الکترولیت‌ها یکی از مهمترین پارامترهای کارایی فعالیت‌های بیوشیمیایی و پایداری عملکرد گیاه است. آگروکمیکال‌های موجود در دودآب همانند فیتوهورمون‌ها با کاهش آسیب رادیکال‌های آزاد موجود در سیستم‌های دریافت نور موجب یکپارچگی غشای سلولی و در نتیجه افزایش کارایی فعالیت‌های بیوشیمیایی شدند (Werner & Schmülling, 2009). این نتایج با گزارش Iqbal et al. (2018) مطابقت داشت.

جدول 8- تجزیه واریانس برخی از پارامترهای بیوشیمیایی برگ‌های بادرنجبویه تحت تاثیر سطوح مختلف محلول‌پاشی و چین‌های برداشت

Table 8. Analysis of variance for some biochemical parameters of lemon balm leaves as affected by different levels of foliar application and harvesting stages

ns، * و ** به­ترتیب عدم وجود تفاوت معنی‌دار، معنی‌دار­بودن در سطح یک درصد و پنج درصد را نشان می‌دهد.

ns, * and ** are non-significant, significant at 1% and 5% level of probability, respectively.

جدول 9- اثر چین‌های برداشت روی برخی از پارامترهای بیوشیمیایی برگ‌های بادرنجبویه

Table 9. Effect of harvest stages on some biochemical parameters of lemon balm leaves

شکل 1- اثر سطوح مختلف محلول‌پاشی بر a: محتوای کربوهیدرات‌های محلول و b: نشت الکترولیت‌های برگ‌های بادرنجبویه. Ctrl: شاهد، SW: دودآب، Ck: سیتوکینین، GA: اسید­جیبرلیک و IAA: اکسین. خطوط بار، نشان‌دهنده خطای استاندارد است.

Figure 1. Effect of different levels of foliar application on a: soluble carbohydrates content and b: electrolyte leakage of lemon balm leaves. Ctrl: control, SW: Smoke-Water, Ck: Cytokinin, GA: Gibberellic acid and IAA: Auxin. Bar lines indicate the standard error.

نتیجه‌گیری کلی

دودآب در غلظت‌های 1:100 و 1:500 (v/v) موجب افزایش محتوای رنگدانه‌های فتوسنتزی، نسبت محتوای کلروفیل کل به کاروتنوئیدها، سرعت فتوسنتز، سرعت تعرق و هدایت روزنه‌ای، محتوای فنول کل و کاهش تجمع کربوهیدرات‌های محلول و درصد نشت الکترولیت‌ها از غشای پلاسمایی سلول‌های برگ نسبت به تیمار شاهد شد. سطوح مذکور در اکثر صفات مورد بررسی تفاوت معنی‌داری با فیتوهورمون‌های رشد نداشتند. برآیند این تغییرات در گیاه موجب بهبود وضعیت بیوشیمیایی، افزایش کارایی فتوسنتزی و تثبیت کربن می‌شود. اگرچه هنوز مکانیسم دقیق ترکیبات محرک دودآب در بهبود ویژگی‌های بیوشیمیایی گیاهان مشخص نیست؛ ولی مطالعات حاضر پاسخ‌های شبه فیتوهورمونی و احتمالاً اثر این ترکیبات را بر پروفیل فیتوهورمون‌های درونی گیاه تأیید می­کنند. بنابراین دودآب می‌تواند به­عنوان یک آگروکمیکال طبیعی با تکنیک نسبتاً ساده و مقرون­به­صرفه، پتانسیل لازم جهت بهبود فرآیندهای بیوشیمیایی گیاه بادرنجبویه را داشته باشد.

REFERENCES

1. Abdelgadir, H. A., Kulkarni, M. G., Aremu, A. O. & Van Staden, J. )2013). Smoke-water and karrikinolide (KAR1) foliar applications promote seedling growth and photosynthetic pigments of the biofuel seed crop. Jatropha curcas Journal of Plant Nutrition and Soil Science, 176, 743-747.
2. Aldesuquy, H. S. (2000). Effect of indol-3-yl acetic acid on photosynthetic characteristics of wheat flag leaf during grain filling. Photosynthetica, 38, 135-141.
3. Aremu, A. O., Bairu, M. W., Finnie J. F. & Van Staden, J. (2012). Stimulatory role of smoke–water and karrikinolide on the photosynthetic pigment and phenolic contents of micropropagated ‘Williams’ bananas. Plant Growth Regulation, 67, 271-279.
4. Aremu, A. O., Plačková, L., Novák, O., Stirk, W. A., Doležal, K., & Van Staden, J. (2016). Cytokinin profiles in ex vitro acclimatized Eucomis autumnalis plants pre-treated with smoke-derived karrikinolide. Plant Cell Reports, 35(1), 227-238.
5. Arnon, A. (1967). Method of extraction of chlorophyll in the plants. Agronomy Journal, 23, 112-121.
6. Beauchamp, C. & Fridovich, I. (1971). Superoxide dismutase: Improved assays and an assay predictable to acrylamide gels. Annals of Biochemistry, 44, 276–287.
7. Bose, S. K., Yadav, R. K., Mishra, S., Rajender, S., Sangwan, A., Singh, K., Mishra, B., Srivastava, A. K. & Sangwan, N. S. (2013). Effect of gibberellic acid and calliterpenone on plant growth attributes, trichomes, essential oil biosynthesis and pathway gene expression in differential manner in Mentha arvensis Plant Physiology and Biochemistry, 66, 150-158.
8. Bradford, M. M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principles of protein dye binding. Analytical Biochemistry, 72, 248-254.
9. Candan, N. & Tarhan, L. (2003). Changes in chlorophyll-carotenoid contents, antioxidant enzyme activities and lipid peroxidation levels in Zn-stressed Mentha pulegium. Turkish Journal of Chemistry, 27, 21-30.
10. Chance, B. & Maehly, A. (1955). Assay of catalases and peroxidases. Methods in Enzymology, 2, 764-775.
11. Costa, M. L., Civello, P. M., Chaves, A. R. & Martínez, G. A. (2005). Effect of ethephon and 6-benzylaminopurine on chlorophyll degrading enzymes and a peroxidase-linked chlorophyll bleaching during post-harvest senescence of broccoli (Brassica oleracea) at 20 C. Postharvest Biology and Technology, 35, 191-199.
12. Cunha, F., Tintino, S. R., Figueredo, F., Barros, L., Duarte, A. E., Vega Gomez, M. C., Coronel, C. C., Rolón, M., Leite, N., Sobral-Souza, C. E. & Brito, S. V. (2016). HPLC-DAD phenolic profile, cytotoxic and anti-kinetoplastidae activity of Melissa officinalis. Pharmaceutical Biology, 54(9), 1664-1670.
13. Fischer, R., Rees, D., Sayre, K., Lu, Z. M., Condon, A. & Saavedra, A. L. (1998). Wheat yield progress associated with higher stomatal conductance and photosynthetic rate, and cooler canopies. Crop Science, 38, 1467-1475.
14. Flematti, G. R., Merritt, D. J., Piggott, M. J., Trengove, R. D., Smith, S. M., Dixon, K. W. & Ghisalberti, E. L. (2011). Burning vegetation produces cyanohydrins that liberate cyanide and stimulate seed germination. Nature Communications, 2(1), 1-6.
15. Ghebrehiwot, H., Kulkarni, M., Bairu, M. & Van Staden, J. (2013). Plant-derived aerosol-smoke and smoke solutions influence agronomic performance of a traditional cereal crop, Tef. Experimental Agriculture, 49, 244-55.
16. Gilbert, M., Ripley, B. & Van Staden, J. (2002). The effect of smoke on the photosynthetic gas exchange of Chrysanthemoides monilifera. South African Journal of Botany, 68, 525-531.
17. Gupta, N., Sunita, G. & Arvind, K. (2000). Exogenous cytokinin application increases cell membrane and chlorophyll stability in wheat (Triticum aestivum). Cereal Research Communications, 28, 287-291.
18. Hayat, S. & Ahmad, A. (2003). Soaking seeds of Lens culinaris with 28‐homobrassinolide increased nitrate reductase activity and grain yield in the field in India. Annals of applied biology, 143 (1), 121-124.
19. Iqbal, M., Asif, S., Ilyas, N., Raja, N. I., Hussain, M., Ejaz, M. & Saira, H. (2018). Smoke produced from plants waste material elicits growth of wheat (Triticum aestivum) by improving morphological, physiological and biochemical activity. Biotechnology Reports, 17, 35-44.
20. Jain, N., Stirk, W. A. & Van Staden, J. (2008). Cytokinin-and auxin-like activity of a butenolide isolated from plant-derived smoke. South African Journal of Botany, 74, 327-331.
21. Karalija, E., Zeljković, S. Ć., Tarkowski, P., Muratović, E. & Parić, A. (2017). The effect of cytokinins on growth, phenolics, antioxidant and antimicrobial potential in liquid agitated shoot cultures of Knautia sarajevensis. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC), 131, 347-57.
22. Kavina, J., Gopi, R. & Panneerselvam, R. (2011). Traditional and non-traditional plant growth regulators alter the growth and photosynthetic pigments in Mentha piperita. International Journal of Environmental Sciences, 11(7), 124-134.
23. Kumar, B., Pandey, D., Goswami, C. & Jain, S. (2001). Effect of growth regulators on photosynthesis, transpiration and related parameters in water stressed cotton. Biologia Plantarum, 44, 475-478.
24. Light, M. E., Anthonissen, R., Maes, A., Verschaeve, L., Pošta, M. & Van Staden, J. (2015). Genotoxicity testing of 3, 4, 5-trimethylfuran-2 (5H)-one, a compound from plant-derived smoke with germination inhibitory activity. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, 778, 1-5.
25. Lin, J. T., Chen, Y. C., Lee, Y. C., Hou, C. W. R., Chen, F. L., & Yang, D. J. (2012). Antioxidant, anti-proliferative and cyclooxygenase-2 inhibitory activities of ethanolic extracts from lemon balm (Melissa officinalis) leaves. LWT-Food Science and Technology, 49(1), 1-7.
26. Lutts, S., Kinet, J. & Bouharmont, J. (1996). NaCl-induced senescence in leaves of rice (Oryza sativa) cultivars differing in salinity resistance. Annals of Botany, 78, 389-98.
27. Nadernejad, N., Ahmadimoghadam, A., Hossyinifard, J., & Poorseyedi, S. (2013). Study of the rootstock and cultivar effect in PAL activity, production of phenolic and flavonoid compounds on flower, leaf and fruit in pistachio (Pistacia vera L.). Iranian Journal of Plant Biology, 5(15), 95-109.
28. Netto, A. T., Campostrini, E., De Oliveira, J. G. & Bressan-Smith, R. E. (2005). Photosynthetic pigments, nitrogen, chlorophyll a fluorescence and SPAD-502 readings in coffee leaves. Scientia horticulturae, 104, 199-209.
29. Noreen, Z. & Ashraf, M. (2009). Assessment of variation in antioxidative defense system in salt-treated pea (Pisum sativum) cultivars and its putative use as salinity tolerance markers. Journal of Plant Physiology, 166, 1764-1774.
30. Noroozi Shahri, F., Jalali Honarmand, S., Mondani, F., & Saeidi, M. (2020). Evaluation of growth phytohormones and different concentrations of plant derived smoke applications on growth characteristics and biological yield of medicinal plants lemon balm and basil. Journal of Crops Improvement, 22(1), 89-102. (In Farsi)
31. Oliveira Neto, C. F. D., Lobato, A. K. D. S., Gonçalves-Vidigal, M. C., Costa, R. C. L. D., Santos Filho, B. G. D., Alves, G. A. R., Maia, W. J. M. S., Cruz, F. J. R., Neves, H. K. B. & Lopes, M. S. (2009). Carbon compounds and chlorophyll contents in sorghum submitted to water deficit during three growth stages. Journal of Food, Agriculture and Environment, 7, 588-593.
32. Rademacher, W. (2015). Plant growth regulators: Backgrounds and uses in plant production. Journal of Plant Growth Regulation, 34(4), 845-872.
33. Ritchie, S.W., Nguyen, H. T. & Holaday, A. S. (1990). Leaf water content and gas-exchange parameters of two wheat genotypes differing in drought resistance. Crop Science, 30, 105-111.
34. Sayd, S. S., Taie, H. A., & Taha, L. S. (2010). Micropagation, antioxidant activity, total phenolics and flavonoids content of Gardenia jasinoides Ellis as affected by growth regulators. International Journal of Academic Research, 2(3), 184-191.
35. Schwachtje, J. & Baldwin, I. T. (2004). Smoke exposure alters endogenous gibberellin and abscisic acid pools and gibberellin sensitivity while eliciting germination in the post-fire annual, Nicotiana attenuata. Seed Science Research, 14, 51-60.
36. Shaddad, M., Hm, A. E. S. & Mostafa, D. (2013). Role of gibberellic acid (GA3) in improving salt stress tolerance of two wheat cultivars. International Journal of Plant Physiology and Biochemistry, 5, 50-57.
37. Sheligl, H. Q. (1986). Die verwertung orgngischer souren durch chlorella lincht. Planta Journal, 47-51.
38. Sinha, A. K. (1972). Colorimetric assay of catalase. Analytical Biochemistry, 47(2), 389-394.
39. Sosnowski, J., Malinowska, E., Jankowski, K., Król, J. & Redzik, P. (2017). An estimation of the effects of synthetic auxin and cytokinin and the time of their application on some morphological and physiological characteristics of Medicago x varia Martyn. Saudi Journal of Biological Sciences, 26(1), 66-73.
40. Taiz, L. & Zeiger, E. (2012). Plant Physiology. Sunderland, Massachusetts U.S.A.
41. Tavormina, P., De Coninck, B., Nikonorova, N., De Smet, I., & Cammue, B. P. (2015). The plant peptidome: An expanding repertoire of structural features and biological functions. The Plant Cell, 27(8), 2095-2118.
42. Tian, S. F., Wang, Y., Du, G., & Li, Y. X. (2011). Changes in contents and antioxidant activity of phenolic compounds during gibberellin-induced development in Vitis vinifera‘Muscat’. Acta Physiologiae Plantarum, 33(6), 2467-2475.
43. Van Staden, J., Jäger, A. K., Light, M. E., Burger, B. V., Brown, N. C. & Thomas, T. H. (2004). Isolation of the major germination cue from plant-derived smoke. South African Journal of Botany, 70(4), 654-659.
44. Vats, S., Tiwari, R., Alam, A., Behera, K. K. & Pareek, R. (2012). Evaluation of Phytochemicals, antioxidant and antimicrobial activity of in vitro culture of Vigna unguiculata Walp. Researcher, 4(11), 70-74.
45. Werner, T. & Schmülling, T. (2009). Cytokinin action in plant development. Current Opinion in Plant Biology, 12, 527-538.
46. Wingler, A., Von Schaewen, A., Leegood, R. C., Lea, P. J. & Quick, W. P. (1998). Regulation of leaf senescence by cytokinin, sugars, and light: Effects on NADH-dependent hydroxypyruvate reductase. Plant Physiology, 116, 329-335.
47. Yaronskaya, E., Vershilovskaya, I., Poers, Y., Alawady, A. E., Averina, N. & Grimm, B. (2006). Cytokinin effects on tetrapyrrole biosynthesis and photosynthetic activity in barley seedlings. Planta, 224, 700-709.