مقدمه

خویشاوندان وحشی گندم از جمله گونه‌ی آژیلوپس تائوشی، منبع بالقوه‌ای از ژن‌های با­ارزش مقاومت به تنش‌های زنده و غیر زنده برای انتقال به گندم هستند (Lagudah & Halloran, 1989). همولوژی کامل ژنوم D آژیلوپس تائوشی با ژنوم D گندم، وضعیت گیاهشناسی مشخص، سازگاری وسیع اکولوژیک، وجود تنوع بسیار بالا در این صفات و سهولت تلاقی با گندم، گونه‌ی Aegilops tauschii را به منبع بسیاری مهمی برای انتقال ژن و اصلاح گندم تبدیل کرده است. در پژوهشی از ژن­های مقاوم به زنگ قهوه ای در آژیلوپس تائوشی برای انتقال به تریتیکاله و تولید واریته های مقاوم استفاده شد
 (Ulaszewski & Tomasz, 2020 ). در تحقیق دیگر بررسی خصوصیات آژیلوپس تایوشی نشان داد که گونه­ی آژیلوپس تائوشی دارای منابع ژنتیکی ارزشمندی برای مقابله با زنگ قهوه ای هستند
(Lee et al., 2020). گندم نان با نام علمی
 Triticum aestivum مهم‌ترین گیاه زراعی یکساله است که در سطح گسترده‌ای از جهان تولید و مورد استفاده قرار می‌گیرد. سه بیماری مهم زنگ یعنی زنگ زرد (Stripe rust)، زنگ قهوه‌ای (Leaf rust) و زنگ سیاه (Stem rust) به‌طور مداوم تولید گندم را تحت تأثیر قرار می‌دهند. تخمین زده‌ شده است که میزان کاهش سالانه ناشی از این بیمارگرها بین 5-3/4 میلیارد دلار می‌باشد (Huerta-Espino et al., 2020). زنگ قهوه‌ای گندم، با عامل
Puccinia recondiata f. sp. tritici Eriksson  که به زنگ برگ نیز معروف می‌باشد، ازنظر گستردگی مهمترین بیماری گندم است (Kolmer, 2013). بیمارگر، پهنک ‌برگ را مورد حمله قرار می‌دهد اگرچه در اپیدمی‌های شدیدتر در ارقام حساس، غلاف ساقه و گلوم‌ها نیز مورد حمله قرار می‌گیرند. تحت شرایط همه‌گیری شدید، این بیماری می‌تواند تا بیش از 40 درصد عملکرد را از طریق کاهش وزن هزار دانه و تعداد دانه در سنبله تحت تأثیر قرار دهد
 (Zhang et al., 2019). زنگ قهوه ای در ایران اولین بار در سال 1948 میلادی گزارش شده است (Esfandiari, 1948). در حال حاضر اهمیت اقتصادی زنگ قهوه‌ای در ایران، بیش‌تر از زنگ سیاه و کمتر از زنگ زرد است ولی گستردگی آن از زنگ زرد بیشتر است. این بیماری در تمام مناطق ایران به‌خصوص نواحی غرب، شمال غرب، خوزستان و قسمت‌هایی از خراسان و گرگان مشاهده و گزارش شده است (Bamdadian, 1993). استفاده از ارقام مقاوم، مؤثرترین، اقتصادی‌ترین و از نظر زیست­‌محیطی ایمن‌ترین روش برای کنترل بیماری زنگ قهوه ای می‌باشد. تاکنون 79 ژن مقاومت به زنگ قهوه‌ای در گندم شناسایی‌ شده است (McIntosh et al., 1995; Qureshi et al., 2018). اکثر این ژن‌ها مقاومت اختصاصی نژاد اعطا می‌کنند اما هشت ژن، یعنی Lr34، Lr46، Lr67، Lr68، Lr74، Lr75، Lr77 و Lr78 باعث مقاومت غیر ‌اختصاصی نژاد می‌شوند (Zhang et al., 2019). مقاومت اختصاصی نژاد معمولاً کیفی بوده و به‌دلیل تکامل نژادهای بیماری‌زای بالقوه، کوتاه‌مدت می‌باشد. در مقابل، سطوح کافی از مقاومت توسط ژن‌های مقاومت غیر اختصاصی که ممکن است اثرات کم یا متوسط ایجاد کنند، وجود دارد. گیاهان حامل چنین ژن‌هایی در مرحله‌ی گیاهچه‌ای حساس و در مراحل بعد از گیاهچه‌ای مقاوم هستند و منجر به کاهش توسعه بیماری زنگ در گیاه می‌شوند
 (Huerta-Espino et al., 2020).

مقاومت به زنگ قهوه‌ای در اغلب ارقام گندم توسط یک یا تعداد کمی ژن مقاومت گیاهچه‌ای ایجاد می‌شود. این ژن‌ها در اکثر مواقع ناپایدارند و توسط نژادهای جدید در جمعیت بیمارگر زنگ قهوه‌ای، شکسته می‌شوند. بنابراین با وجود شناسایی و آرایش تعدادی از ژن‌های مقاومت به زنگ برای حفظ عملکرد گندم، ظهور پاتوتیپ‌های بیمارگر می‌تواند پایداری و استفاده از آن‌ها را محدود کند. در نتیجه، تحقیق مداوم برای شناسایی منابع جدید مقاومت جهت استفاده کامل و مؤثر آن‌ها در برنامه‌های به‌نژادی ضروری است (Pathan & Park, 2006).

ارقام بومی گندم منبعی بالقوه از ژن‌های مقاومت جدید هستند، ولی این ارقام به نسبت کمتری در اصلاح نباتات مدرن استفاده ‌شده اند. تحقیقات نشان داده است که بعضی از ارقام جدید گندمی که با استفاده از ژن‌های منتقل‌شده از ارقام بومی به وجود آمده‌اند، منابع با ارزشی از تنوع ژنتیکی برای مقاومت مؤثر مقابل عامل بیماری زنگ هستند
 (Bonman et al., 2015; Sthapit et al., 2014). منابع برخی از ژن‌های مقاومت به زنگ قهوه‌ای از توده‌های بومی گندم و یا خویشاوندان وحشی بوده‌اند؛ به عنوان مثال ژن Lr79 در یک توده بومی گندم دوروم استرالیایی شناسایی شد
 (Qureshi et al., 2018). همچنین ژن‌های Lr9، Lr19، Lr24 و Lr76 در نمونه‌ها و خویشاندان بومی گندم شناسایی شده‌اند (McIntosh et al., 1995). برای ارزیابی مواد ژنتیکی نسبت به زنگ از شاخص‌های مختلفی مانند تیپ آلودگی
 (Infection type)، درصد آلودگی، دوره نهان آلودگی (Latent period) استفاده کرد. دوره نهان آلودگی به‌صورت تعداد روز از زمان مایه‌زنی تا ظهور اولین جوش‌های زنگ روی برگ‌های گیاه تعریف می‌شود (Van der Plank, 1963). یکی دیگر از شاخص‌های مرتبط با مقاومت، سطح زیر منحنی پیشرفت بیماری (Area under the disease progress curve, AUDPC) می‌باشد .این مقیاس یکی از پارامترهای مهم برای ارزیابی بیماری‌های زنگ در غلات است که تحقیقات فراوانی ارتباط معنادار آن با نوع واکنش به عامل بیماری‌زا و همچنین کاهش عملکرد در گیاه میزبان را تایید کردند و به‌عنوان یکی از بهترین معیارهای بررسی مقاومت در مرحله گیاه کامل و بازتابی از شدت و توسعه بیماری شناخته می‌شود
 (Xu et al., 2005). ژنوتیپ‌های با واکنش مصون دارای مقدار AUPDC صفر بودند. واکنش مصون و بروز حداقل میزان AUPDC احتمالاً به‌دلیل دارا­بودن ژن‌های مقاومت اختصاصی می‌باشد
 (El-Orabey et al., 2019). در آزمایشی برای ارزیابی فنوتیپی مقاومت به بیماری زنگ در برخی ژنوتیپ‌های گندم ایران نیز نتایج مشابه تحقیق حاضر به‌دست آمد. در این پژوهش محققان میزان AUDPC زیر 500 را به‌عنوان مقاومت قابل قبول، 250-150 را نیمه­مقاوم و زیر 150 را به‌عنوان مقاوم در نظر گرفتند
 (Dadrezaei et al., 2015). هدف از این پژوهش ردیابی منابع مقاومت گیاهچه‌ای و مقاومت گیاه کامل در ژنوتیپ‌های آژیلوپس تائوشی به زنگ قهوه‌ای بود تا در صورت داشتن مقاومت مناسب از آن‌ها در برنامه‌های به‌نژادی آینده استفاده شود.

مواد و روش‌ها

تعیین پاتوتیپ جدایه‌ها

برای تعیین پاتوتیپ یا شناسایی ساختار پرآزاری نمونه‌های زنگ قهوه‌ای بر­اساس فرمول پرآزاری/ ناپرآزاری  از 38 لاین ایزوژنیک که هر یک تنها حامل یک ژن مقاومت مشخص (Lr gene) به بیماری زنگ قهوه‌ای هستند، استفاده شد (جدول 2). برای تکثیر پاتوتیپ‌ها ابتدا نمونه‌ها به شکل برگ‌های آلوده به زنگ قهوه‌ای در هوای آزاد در حرارت 20-15 درجه سانتی‌گراد خشک و در یخچال نگه‌داری شدند. برای احیای نمونه‌های جمع‌آوری­شده ابتدا نمونه‌های برگی را در شرایط رطوبت 100 درصد به‌مدت دو ساعت قرار داده تا نمونه‌ها شروع به اسپورزایی نمایند؛ پس از اسپورزایی به روش مالشی روی برگ گیاهچه‌های رقم بولانی مایه‌زنی شدند. بعد از مایه‌زنی، گلدان‌ها ابتدا در شرایط 20-18 درجه سانتی‌گراد، رطوبت اشباع و تاریکی به‌مدت 24 ساعت قرار داده و سپس به گلخانه‌ی زنگ قهوه‌ای با دمای 24-22 درجه سانتی‌گراد منتقل شدند. نمونه‌ها تا زمان اسپوردهی در دمای فوق به‌مدت 16 ساعت نور 16000 لوکس و 8 ساعت تاریکی نگه‌ داشته و سپس بعد از 20-14 روز برای تکثیر اسپور از نمونه‌هایی که تولید اسپور نمودند مجدداً به رقم بولانی مایه‌زنی شدند.

برای تعیین فرمول پرآزاری/ناپرآزاری ایزوله ها، 38 لاین مونوژن (جدول 2) در گلدان‌هایی به قطر 15 سانتی‌متر حاوی خاک با ماسه و پیت‌ماس کاشته شده و سپس گیاهچه‌های 10 روزه لاین ها با مخلوط اسپور زنگ قهوه‌ای و پودر تالک به نسبت 1:4 مایه‌زنی شدند. سپس تمامی گلدان‌ها در تاریک­خانه در شرایط 20-18 درجه سانتی‌گراد و رطوبت اشباع قرار داده و پس از 24 ساعت به گلخانه‌ی زنگ قهوه‌ای با دمای 24-22 درجه سانتی‌گراد منتقل شدند. حدود 10 روز بعد از مایه‌زنی تیپ‌های آلـودگی ایجاد شده روی ژنوتیپ‌های مورد‌ نظر بـر اســــاس روش McIntosh et al. (1995) در مقیاس 4-0 ارزیابی شدند. تیپ‌های آلودگی 3 تا 4 به‌عنوان آلودگی بالا (High) و تیپ‌های 2-0 به‌عنوان تیپ‌های آلودگی پایین (Low) در نظر گرفته شدند. برای تعیین فراوانی فاکتورهای پرآزاری در جدایه‌های زنگ قهوه‌ای، درصد فاکتورهای پرآزار در هر جدایه نسبت به تعداد کل ژن‌های مقاومت محاسبه شد.

ارزیابی‌های گیاهچه‌ای

برای ارزیابی مقاومت به بیماری زنگ قهوه‌ای در مرحله گیاهچه‌ای، ژنوتیپ­های آژیلوپس تائوشی (تهیه­شده از کلکسیون بذر غلات و حبوبات دانشگاه ایلام) در گلخانه‌ی تحقیقاتی مؤسسه تحقیقات اصلاح و تهیه نهال و بذر کرج مورد ارزیابی قرار گرفتند (جدول 1). آزمایش گلخانه‏ای با استفاده از شش جدایه زنگ قهوه‌ای در قالب طرح کاملا تصادفی با دو تکرار انجام و صفات تیپ آلودگی و دوره نهان آلودگی یادداشت­برداری شد. در این آزمایش، ژنوتیپ‌ها در گلدان‏هایی به قطر 15 سانتی‌متر حاوی خاک، ماسه و پیت ماس کاشته شده و سپس گیاهچه‌های دو برگی با استفاده از ترکیب پودر تالک با اسپور عامل بیماری‌زا (به نسبت 4 به 1) مایه‌زنی شدند. بعد از مایه‌زنی، تمامی گلدان‌ها را ابتدا در شرایط محیطی با دمای 20 تا 18 درجه سانتی‌گراد، رطوبت اشباع و تاریکی قرار داده و پس از 24 ساعت به گلخانه‌ی مخصوص زنگ قهوه‌ای با دمای 24 تا 22 درجه سانتی‎گراد و شرایط نوری 16 ساعت نور 16000 لوکس و 8 ساعت تاریکی منتقل شدند. یادداشت­‌برداری تیپ آلودگی حدود 12 تا 14 روز بعد از مایه‌زنی بر اساس روش
McIntosh et al. (1995) انجام گرفت. تیپ‌های آلودگی 2-0 ناپرآزار و 4-3 به‌عنوان پرآزار در نظر گرفته شدند. داده‌های اصلی تیپ آلودگی در مرحله گیاهچه‌ای به مقیاس 9-0 تبدیل شدند
 (Zhang et al., 2019).

برای ثبت دوره نهان آلودگی هر روز به دقت تمامی گیاهچه‌ها مورد بررسی قرار ‌گرفتند و در صورت مشاهده جوش‌ها روی برگ در گیاهان مورد بررسی، آن گیاه با یک حلقه رنگی معین برای همان روز نشان‌دار شد و در زمان یادداشت‌برداری نهایی رنگ هر حلقه مشخص‌کننده تعداد روز مشخص از زمان مایه‌زنی تا ظهور اولین جوش‌ها بود.

آزمایش‌های ارزیابی مقاومت به بیماری زنگ قهوه‌ای در مرحله گیاه کامل

تعداد 100 ژنوتیپ مورد بررسی در این پژوهش (جدول 1) در شرایط همه‌گیری بیماری زنگ قهوه‌ای در مزرعه خزانه زنگ قهوه‌ای، ایستگاه تحقیقاتی کشاورزی و منابع طبیعی عراقی محله ی گرگان مورد آزمایش قرار گرفتند. بذر ژنوتیپ‌ها در اواسط آذر 1398 کاشته شدند. هر ژنوتیپ روی یک خط یک­متری روی یک پشته کشت شد. رقم حساس بولانی به فاصله هر هفت ژنوتیپ روی یک پشته و در اطراف خزانه آزمایشی در یک ردیف به‌عنوان شاهد و شیوع‌دهنده (Spreader) بیماری کشت شد. آزمایش در قالب طرح بلوک­های کامل تصادفی در سه تکرار اجرا شد. برای مایه‌زنی مصنوعی مزرعه آزمایشی از چهارم اسفند ماه 1399 (هر 10 روز یک‌بار) با استفاده از جدایه‌­ی منطقه در هنگام غروب آفتاب و افزایش رطوبت نسبی مزرعه گردپاشی (مخلوط اسپور زنگ و پودر تالک به نسبت یک به 20) صورت گرفت. در این آزمایش یادداشت‌برداری صفت شدت بیماری در مرحله ظهور برگ پرچم و با مشاهده 50 درصد آلودگی روی رقم حساس به‌ صورت هر هفت روز یک‌بار و تا چهار مرحله بر اساس روش اصلاح‌شده کاب انجام شد (Peterson et al., 1948). شدت نهایی آلودگی (Final Disease Severity, FDS) بیان‌کننده اثرات تجمعی همه‌‌ی فاکتورهای مقاومت شامل دوره کمون، تراکم و اندازه جوش در طول فرآیند همه‌گیری می‌باشد، بنابراین صفت مهمی برای قضاوت است (Parlevliet & Van Ommeren, 1975). تعیین تیپ آلودگی به روش .(1992) Roelfs et al در مقیاس صفر تا نه صورت گرفت. ضریب آلودگی
 (Coefficient of Infection) از حاصل‌ ضرب شدت بیماری در ضریب ثابت مربوط به تیپ آلودگی
 (S= 1, MS= 0.8, MR= 0.4, R= 0.2) به‌دست آمد. همچنین سطح زیر منحنی پیشرفت بیماری (AUDPC) با استفاده از فرمول زیر محاسبه شد.

در این فرمول t_i: زمان یادداشت‌برداری، t_i+1: زمان یادداشت‌برداری بعدی، y_i: ضریب آلودگی در زمان یادداشت‌برداری، y_i+1 : ضریب آلودگی در زمان یادداشت‌برداری بعدی و N: تعداد یادداشت‌برداری برای ارزیابی ضریب آلودگی می‌باشد.

به‌منظور گروه‌بندی ارقام مورد بررسی از نظر مقاومت به زنگ قهوه‌ای، از تجزیه خوشه‌ای به روش وارد (Ward) از نرم­افزار SPSS 16.00 استفاده شد. تجزیه همبستگی نیز با استفاده از نرم‌افزار مذکور انجام شد.

جدول 1- منشاء جمع‌آوری ژنوتیپ‌های آژیلوپس تائوشی استفاده‌ شده در آزمایش

Table 1. The origin of Aegilops tauschii genotypes used in the experiment

نتایج و بحث

با توجه به جدول 4، پاتوتیپ LR-G32 دارای کمترین و پاتوتیپ LR-98-15 دارای بیشترین فاکتورهای پرآزاری بود. ژن‌های Lr2c، Lr3، Lr3bg، Lr3ka، Lr10، Lr11، Lr14a، Lr14b، Lr15، Lr16، Lr17، Lr18،Lr24 ، Lr23، Lr25، Lr28، Lr Lr30، Lr32، Lr33، Lr34، Lr35، Lr36 و LrB نسبت به تمام پاتوتیپ‌‌ها حساس و ژن‌های Lr2a، Lr2b، Lr9، Lr19، Lr24 و Lr29 نسبت به تمام پاتوتیپ‌‌ها مقاوم بودند. مقاومت ژن Lr9 و Lr19 نسبت به تمامی پاتوتیپ‌‌ها در سایر مطالعات گزارش شده است
 (Torabi et al., 2001). ژن Lr9 روی کرموزوم 6B مکان­یابی شد (Soliman et al., 1963). این ژن نسبت به تغییرات محیطی از جمله دمای محیط واکنش کم نشان می‌دهد. اکثر منابع دارای منابع ژن Lr9 از آمریکای شمالی منشأ گرفته‌اند. با توجه به اینکه پرآزاری برای این ژن در هیچ‌کدام از پاتوتیپ‌‌های استفاده‌شده گزارش نشد، این ژن به‌عنوان یک ژن مؤثر و قابل ‌استفاده در برنامه‌های به‌نژادی کشور توصیه می‌شود. در ارتباط با ژن Lr19 اظهار شده است که پرآزاری برای این ژن در مقیاس جهانی نادر می‌باشد. با وجود مؤثر­بودن این ژن در اکثر نقاط دنیا کاربرد این ژن به‌‌دلیل لینکاژ با عامل تولید­‌کننده زردی رنگ آرد در سطح بین‌المللی محدود می‌باشد (Winzeler et al., 1995).

واکنش ژنوتیپ‌ها در مرحله‌ گیاهچه‌ای

نتایج تجزیه خوشه‌ای ژنوتیپ‌ها را به دو دسته اصلی تقسیم کرده است (شکل 1). در دسته اول که با حرف A مشخص شده است ژنوتیپ‌های حساس قرار گرفته‌اند که شامل ژنوتیپ‌های کاملاً حساس و نیمه­حساس هستند. ژنوتیپ‌ها در این خوشه به چند زیرجمعیت تقسیم شده‌اند، ژنوتیپ شماره 89 در زیر­جمعیت اول نسبت به سه جدایه LR-G32، LR-98-15 و LR-99-15 مقاوم و نسبت به بقیه­ی جدایه‌ها حساس است و از ژنوتیپ‌های نیمه­حساس (MS) به‌شمار می‌آید. در خوشه بعدی ژنوتیپ‌های شماره (6،4،8،...، 97، 100و 101) قرار دارند که نسبت به تمام جدایه‌ها حساس بودند و حدود 67 درصد جمعیت را تشکیل می‌دهند. خوشه‌های بعدی تشکیل‌دهنده گروه A شامل ژنوتیپ‌هایی هستند که بر اساس خوشه‌ای که در آن قرار گرفته‌اند نسبت به یک تا سه جدایه مقاوم و نسبت به سایر جدایه‌ها حساس بودند و ژنوتیپ‌هایی هستند که واکنش نیمه­حساس (MS) داشتند. به‌عنوان مثال ژنوتیپ‌های شماره (50 و 67) که در زیر­جمعیت بعدی قرار دارند به‌ترتیب نسبت به جدایه‌های LR-97-11 و LR-98-19 مقاوم و نسبت به سایر جدایه‌ها حساسیت نشان دادند. این خوشه‌ها در مجموع حدود 13 درصد جمعیت را تشکیل دادند که ژنوتیپ‌های نیمه­حساس (MS) بودند. گروه اصلی دوم که با حرف B مشخص شده است، شامل ژنوتیپ‌های مقاوم بودند که از چند زیرجمعیت تشکیل شده‌اند. در خوشه اول که ژنوتیپ‌هایی با شماره‌های (98،2،7،22،32،55،66) قرار گرفته‌اند ژنوتیپ‌هایی هستند که به تمامی جدایه‌های زنگ قهوه‌ای در این تحقیق واکنش کاملاً مقاوم (R) نشان داده بودند. این زیرگروه با سهم 7 درصدی از جمعیت مورد مطالعه کمترین تعداد را به خود اختصاص داده است. دیگر خوشه‌های تشکیل‌دهنده این گروه شامل ژنوتیپ‌هایی هستند که به‌ترتیب بر اساس نزدیکی به ژنوتیپ‌های مقاوم نسبت به یک تا سه جدایه حساس و نسبت به سایر جدایه‌ها مقاوم بودند. به‌عنوان مثال ژنوتیپ شماره (26 و 96) که در نزدیک­‌ترین خوشه به ژنوتیپ‌های مقاوم قرار گرفته‌اند تنها به جدایه LR-98-19 حساس و نسبت به سایر جدایه‌ها مقاوم بودند و در مقابل ژنوتیپ شماره (20) که در دورترین فاصله نسبت به ژنوتیپ‌های کاملاً مقاوم قرار داشت نسبت به سه جدایه
 LR-98-15، LR-99-4 و LR-99-15 حساس و نسبت به سایر جدایه‌ها مقاوم بود. این ژنوتیپ‌ها در مجموع حدود 13 درصد جمعیت را تشکیل دادند و ژنوتیپ‌های نیمه­‌مقاوم (MR) را شامل شدند. اطلاعات مربوط به واکنش‌های حساس یا مقاوم هرکدام از آنها در جدول 5 قابل دسترسی می‌باشد.

جدول 2- ارقام افتراقی و واکنش آنها به جدایه‌های مورد استفاده +/-، پرآزار/ ناپرآزار

Table 2. Differential cultivars and their response to the isolates used +/-, virulent / avirulent

شکل 1- درخت‌واره تجزیه خوشه‌ای به روش وارد برای ژنوتیپ‌های آژیلوپس نسبت به جدایه‌های زنگ قهوه‌ای در مرحله گیاهچه

Figure 1. Dendrogram from cluster analysis by Ward method for the reaction of Aegilops tauschi genotypes to brown rust isolates at seedling stage

واکنش ژنوتیپ‌ها در مرحله گیاه کامل

برای جدایه‌ی استفاده­شده در مزرعه در مرحله گیاه کامل بر اساس ارزیابی صفات مزرعه شامل شدت، ضریب آلودگی، تیپ آلودگی و سطح زیر منحنی پیشرفت بیماری در مجموع 37 ژنوتیپ حساس بودند که بر­اساس سطح پرآزاری شامل 30 ژنوتیپ کاملاً حساس (S) و 7 ژنوتیپ نیمه­حساس (MS) بودند. 63 ژنوتیپ مقاوم بودند که بر اساس سطح ناپرآزاری شامل 14 ژنوتیپ کاملاً مقاوم (R) و 49 ژنوتیپ نیمه­مقاوم (MR) بودند. به‌طور کلی در این حالت حدود 63 درصد از ژنوتیپ‌ها مقاوم و 37 درصد حساس بودند که این امر نشان‌دهنده وجود ژن­های مقاومت در گیاه کامل می باشد (شکل 2). با توجه به نتایج جدول 4 بین ژنوتیپ­ها از نظر شاخص AUDPC، تیپ آلودگی، ضریب آلودگی (CI) و شدت نهایی آلودگی (FDS) در سطح معنی­داری یک درصد وجود داشت که بیانگر تنوع موجود بین ژنوتیپ­ها از نظر میزان مقاومت به پاتوژن زنگ قهوه­ای بود.

سطح زیر منحنی پیشرفت بیماری (AUDPC) یک معیار کمی از کل مقاومت بوده که حاصل تمام عواملی مثل تفاوت در شرایط محیطی، ژنوتیپ‌ها و جمعیت بیمارگر است که روی توسعه بیماری اثر دارند؛ بنابراین ژنوتیپ‌هایی که از مقدار AUDPC و درصد میزان نسبی سطح زیر منحنی پیشرفت بیماری (rAUDPC) پایینی برخوردارند احتمال دارد دارای ژن‌های مقاومت غیر اختصاصی (APR) یا مقاومت پایدار باشند. مقدار AUDPC ژنوتیپ‌ها در محدوده صفر تا 1760 (rAUDPC=0-100%) بود (شکل 4).

جدول 3- نتایج واکنش ژنوتیپ‌های آژیلوپس نسبت به پاتوتیپ‌های زنگ قهوه‌ای در شرایط گلخانه و مزرعه

Table 3. Results of reaction of Agileops genotypes to brown rust patotypes in seedling stage under greenhouse and field conditions

جدول 4 - تجزیه واریانس اجزای مقاومت زنگ قهوه‌ای گندم در شرایط مزرعه‌

Table 4. Analysis of variance of resistance components of wheat brown rust in field conditions

ns          : نشان­دهنده غیر معنی­داری و *، ** و به­ترتیب نشان­دهنده معنی­داری در سطح 5 و 1 درصد می­باشند.

شکل 2- درخت‌واره تجزیه خوشه‌ای به روش وارد برای واکنش ژنوتیپ‌های آژیلوپس تائوشی نسبت به جدایه‌های زنگ قهوه‌ای در مرحله گیاه بالغ.

Figure 2. Dendrogram of cluster analysis by Ward method for the reaction of Aegilops tauschi genotypes to brown rust isolates in the adult plant stage.

با­توجه­به مقدار AUDPC ژنوتیپ‌های دارای AUDPC بیشتر از 476 به‌عنوان ژنوتیپ‌های حساس در نظر گرفته شدند (Dadrezaei et al., 2015). این گروه شامل 31 ژنوتیپ (AUDPC=476-1757) بود. مقدار AUDPC رقم حساس بولانی 1757 بود. در چنین ژنوتیپ‌هایی بیماری به‌سرعت گسترش می‌یابد. همچنین AUDPC کمتر از 476 به‌عنوان ژنوتیپ­های مقاوم در نظر گرفته شدند. این گروه 55 ژنوتیپ (AUDPC=42-476) را شامل شد. مقادیر کم AUDPC در این ژنوتیپ‌ها نشان‌دهنده‌ی توانایی این ژنوتیپ‌ها در کند­کردن روند پیشرفت بیماری در مرحله‌ی ابتدایی توسعه است (Slow rusting). با­توجه­به نتایج شکل 4 مشخص شد تمام ارقامی که دارای پاسخ MR و MS هستند در این گروه جای می‌گیرند. در این بین ژنوتیپ‌های دارای AUDPC بین 476-188 به‌عنوان ژنوتیپ‌های نیمه‌حساس (MS) در نظر گرفته شدند، این گروه شامل 6 ژنوتیپ (6 درصد) بود. همچنین AUDPC بین 188-43 به‌عنوان ژنوتیپ‌های نیمه‌مقاوم (MR) در نظر گرفته شدند که شامل 49 ژنوتیپ (حدود 49 درصد) بود. ژنوتیپ‌های دارای  AUDPCکمتر از 43 به‌عنوان ژنوتیپ‌های مقاوم (R) در نظر گرفته شدند که متشکل از 14 ژنوتیپ (حدود 14 درصد) بود. ژنوتیپ‌های نیمه‌حساس (MS) و نیمه‌مقاوم (MR) همانند ارقام حساس در ابتدا آلودگی و تولید اسپور نشان داده، ولی برعکس ارقام حساس به مرور رشد تصاعدی بیماری کندتر شده و آلودگی به تأخیر می‌افتد و در نهایت واکنش میزبان به‌صورت لکه‌های کلروتیک و نکروتیک خواهد بود. سایر محققان در بین ژنوتیپ‌های گندم مختلف برای مقاومت Slow rusting در برابر زنگ قهوه‌ای و سایر زنگ‌ها با استفاده از AUDPC و rAUDPC تنوع مشابهی گزارش کردند
 (Draz et al., 2015; Hei et al., 2017; Safavi et al., 2013). تیپ‌ آلودگی ایجاد­شده در شرایط مزرعه‌ای در شکل 3 نشان داده شده است.

شکل 3- تیپ‌های آلودگی مشاهده بر روی برگ ژنوتیپ­ها در شرایط مزرعه بر اساس روش رولفز و همکاران (1992)

Figure 3. Observed infection types on the leaves of genotypes in field conditions based on Roelfs et al. (1992)

بر اساس واکنش ژنوتیپ‌ها در گلخانه و مزرعه می‌توان ژنوتیپ‌ها را در چهار گروه دسته‌بندی کرد. گروه اول حساس در مرحله‌ی گیاهچه‌ای و مقاوم در مرحله‌ی گیاه‌ کامل: این گروه شامل 45 ژنوتیپ بود. بعضی از ژنوتیپ‌های این گروه در مرحله گیاهچه مقاومت نسبی به یک یا دو جدایه داشتند. این گروه از اهمیت ویژه‌ای برخوردار هستند؛ زیرا ممکن است دارای ژن یا ژن‌های شناخته‌شده یا ناشناخته گیاه کامل باشند. از نشانگرهای مولکولی می­توان در این زمینه کمک گرفت. گروه دوم مقاوم در هر دو مرحله‌ی گیاهچه‌ای و گیاه کامل: این گروه شامل 15 ژنوتیپ بود. البته در این گروه بعضی از ژنوتیپ‌ها نسبت به یک تا دو جدایه حساس بودند. به احتمال زیاد اعضای این گروه دارای ژن‌های اختصاصی وابسته به نژاد هستند. مقاومت در این ارقام از نوع کامل بوده و احتمال شکسته­شدن مقاومت در این ارقام زیاد است. بایستی در نظر داشت این گروه علاوه بر ژن‌های مقاومت اختصاصی نژاد ممکن است دارای ژن‌های مقاومت غیر اختصاصی باشند که توسط اثر ژن‌های مقاومت اختصاصی پوشیده شده است. گروه سوم حساس در هر دو مرحله گیاه کامل و گیاهچه‌ای: این گروه شامل 35 ژنوتیپ بود و فاقد ژن‌های مقاومت اختصاصی نژاد و غیر اختصاصی مؤثر نسبت به پاتوتیپ‌‌های استفاده‌­شده بودند. البته تعداد محدودی از ژنوتیپ‌ها (5 ژنوتیپ) مقاومت نسبی نسبت به یک تا دو جدایه داشتند. رقم حساس بولانی نیز در این گروه جای داشت. گروه چهارم، مقاوم در مرحله‌ی گیاهچه‌ای و حساس در مرحله‌ی گیاه کامل شامل 5 ژنوتیپ بود که نشان‌دهنده‌ی غیر اختصاصی­بودن مقاومت در این ژن‌ها است. البته در چهار ژنوتیپ حساسیت نسبت به یک جدایه در گیاهچه‌ها وجود داشت. دادرضایی و همکاران نیز تقسیم‌بندی مشابهی را به‌کار بردند که با نتایج این تحقیق مطابقت داشت
 (Dadrezaei et al., 2015).

شکل 4-گروه­بندی ژنوتیپ­های آژیلوپس تائوشی بر اساس میزان سطح زیر منحنی پیشرفت بیماری

Figure 4. Grouping the genotypes of Aegilops tauschi based on the level below the disease progression curve

به ‌منظور بررسی همبستگی اجزای مقاومت شامل ضریب آلودگی (CI)، شدت نهایی آلودگی (FDS)، سطح زیر منحنی پیشرفت بیماری (AUDPC) و مقدار نسبی سطح منحنی زیر پیشرفت بیماری (rAUDPC) تجزیه همبستگی صفات انجام شد (جدول 5). نتایج نشان داد که همبستگی مثبت معنی‌داری در سطح احتمال یک درصد بین شدت نهایی آلودگی (FDS) با ضریب آلودگی (CI) و سطح زیر منحنی پیشرفت بیماری (AUDPC) وجود دارد. همچنین همبستگی مثبت معنی‌داری در سطح احتمال 01/0 بین ضریب آلودگی (CI) و سطح زیر منحنی پیشرفت بیماری مشاهده شد. همبستگی بالای این اجزا توسط سایر پژوهشگران گزارش شده است (Hei et al., 2017). از آن‌جایی‌که شدت نهایی آلودگی (FDS)، ضریب آلودگی (CI) و سطح زیر منحنی پیشرفت بیماری (AUDPC) ضرایب مثبت بالا دارند، انتخاب ژنوتیپ‌هایی با شدت نهایی آلودگی کمتر از 40 درصد، ضریب آلودگی بین صفر تا 40 درصد و rAUDPC کمتر از 40 درصد با پاسخ‌های MR و MS معیاری قابل‌قبول برای اهداف کاربردی است. بر­همین­اساس 57 ژنوتیپ (جدول 5) با خصوصیات مورد نظر یعنی شدت نهایی آلودگی 40-5/3، ضریب آلودگی 30-4/1 و rAUDPC، یک تا 32درصد با پاسخ‌های MS و MR برای اصلاح مقاومت شناسایی شدند.

گروه‌بندی ژنوتیپ‌ها بر اساس تجزیه خوشه‌ای

تجزیه خوشه‌ای ژنوتیپ‌های مورد ‌بررسی با استفاده از داده‌های تیپ آلودگی گیاهچه‌ای و گیاه کامل، ضریب آلودگی مرحله‌ی گیاه کامل، شدت نهایی آلودگی، AUDPC و rAUDPC انجام شد. بر اساس نتایج تجزیه خوشه‌ای ژنوتیپ‌های موردنظر در دو خوشه‌ی اصلی قرار گرفتند. هرکدام از این خوشه‌ها از چند زیرگروه تشکیل شده است. در خوشه اول که شامل دو زیرگروه است بر اساس شاخص‌های اندازه‌گیری­شده شامل ژنوتیپ‌های حساس و بسیار حساس است که رقم حساس بولانی (شاهد) هم در این خوشه قرار گرفته است.

خوشه دوم که از چند زیرگروه تشکیل شده است در قسمت اول آن ژنوتیپ‌های نیمه­حساس و نیمه­مقاوم قرار گرفته‌اند که شامل هفت ژنوتیپ نیمه‌حساس و 49 ژنوتیپ نیمه‌مقاوم می‌باشد (شکل 5).

جدول 5- ضرایب همبستگی اجزای مقاومت زنگ قهوه‌ای گندم در شرایط مزرعه‌ در ژنوتیپ‌های آژیلوپس تائوشی

Table 5. Correlation coefficients of resistance components of wheat brown rust in field conditions in Aegilops tauschi genotypes

خوشه اول با تعداد 30 ژنوتیپ (حدود 30 درصد) همراه با شاهد (بولانی) را شامل شد. ژنوتیپ‌های این خوشه دارای بالاترین متوسط AUDPC (1217)، بالاترین مقدار متوسط ضریب آلودگی (CI=80)، بالاترین میزان شدت نهایی آلودگی (80) و بالاترین متوسط تیپ آلودگی (IT=8.43) مرحله‌ی گیاه کامل بودند. خوشه دوم (نیمه‌حساس) با هفت ژنوتیپ (هفت درصد) دارای متوسط تیپ آلودگی هشت (IT=3+)، میزان AUDPC=230.4، شدت نهایی آلودگی 50 و ضریب آلودگی 40S و rAUDPC= 19 % بودند، این خوشه دارای کمترین فراوانی بودند. در مجموع تمام ژنوتیپ‌های این خوشه در مرحله­ی گیاهچه‌ای و گیاه کامل مقاومت نشان دادند و تنها در تعداد نسبتاً محدودی از ژنوتیپ‌های این خوشه حساسیت نسبت به یک جدایه مشاهده شد.

زیرگروه سوم متعلق به ژنوتیپ‌های (نیمه­مقاوم) بود (تعداد 49 ژنوتیپ، 49 درصد) که دارای متوسط تیپ آلودگی 4، AUDPC=89.90 و CI=14S و شدت نهایی آلودگی 51/28 بود، ژنوتیپ‌های این خوشه دارای واکنش MR در مرحله‌ی گیاه کامل بودند. خوشه چهارم (‌مقاوم) با 14 ژنوتیپ (14 درصد) دارای متوسط تیپ آلودگی 65/5 (IT=2)، AUDPC=33 و CI=12.5 و شدت نهایی آلودگی 5/17 و rAUDPC=0/02 بودند.

et al. Ebrahimyan (2019) بر اساس نتایج تجزیه خوشه‌ای 41 ژنوتیپ گندم را تحت اپیدمی زنگ قهوه‌ای در چهار خوشه حساس، مقاوم، نیمه‌مقاوم و نیمه‌حساس گروه‌بندی کردند که با نتایج این تحقیق مطابقت داشت. پژوهشگران دیگر هم از روش تجزیه‌ای خوشه‌ای برای گروه‌بندی ژنوتیپ‌ها استفاده کرده‌اند (Li et al., 2017; Mojerlou et al., 2014;
Zahravi et al., 2019).

شکل 5- درخت‌واره تجزیه خوشه‌ای به روش وارد برای ژنوتیپ‌های آژیلوپس تائوشی در حالت گیاهچه و گیاه کامل بر اساس تیپ آلودگی در گلخانه و شدت آلودگی، تیپ آلودگی (IT)، ضریب آلودگی (CI) و سطح زیر منحنی پیشرفت بیماری

Figure 5. Dendrogram of cluster analysis using Ward method for Ae. tauschii genotypes in seedling and whole plant based on type of infection in greenhouse and severity of infection, type of infection (IT), infection coefficient (CI) and area under disease progression curve.

نتیجه‌گیری کلی

نتایج کلی نشان داد که بیش از 30 درصد ژنوتیپ‌های آژیلوپس تائوشی نسبت به زنگ قهوه‌ای در مرحله‌ی گیاهچه‌ای و گیاه کامل حساس هستند، به بیان دیگر فاقد هر گونه ژن مقاومت گیاهچه‌ای و گیاه کامل نسبت به پاتوتیپ‌های استفاده­شده هستند. به­‌علاوه تعداد 15 ژنوتیپ (حدود 15 درصد) حامل ژن‌های مقاومت در مرحله گیاهچه و گیاه کامل بودند. تعداد 45 ژنوتیپ (حدود 45 درصد) دارای واکنش حساس در مرحله گیاهچه و واکنش کاملاً مقاوم در مرحله گیاه کامل بودند. تعداد پنج ژنوتیپ دارای واکنش مقاوم در حالت گیاهچه‌ای و واکنش حساس در مرحله گیاه کامل بودند. در کل بیش از 50 درصد از ژنوتیپ‌ها دارای (مقاومت غیر اختصاصی نژاد) با واکنش MS و MR بودند. این ژنوتیپ‌ها ممکن است دارای ژن‌های مقاومت ناشناخته گیاه کامل (APR) باشند. بنابراین پیشنهاد می‌شود برای مطالعه بیشتر ژن‌های مقاومت این ژنوتیپ‌ها، از نشانگرهای مولکولی نظیر تفاوت تک­نوکلئوتیدی (SNP) استفاده شود.

REFERENCES

1. Bamdadian, A. (1993). Evaluation of physiological race of rusts of grass and their modification in Iran. Institute of Evaluation Pests and Plant Disease, Evin, Iran, 10p. (In Farsi)
2. Bonman, J.M., Babiker, E.M., Cuesta-Marcos, A., Esvelt-Klos, K., Brown-Guedira, G., Chao, S., See, D., Chen, J., Akhunov, E. & Zhang, J. (2015). Genetic diversity among wheat accessions from the USDA National Small Grains Collection. Crop Science, 55(3), 1243-1253.
3. Dadrezaei, S., Afshari, F. & Patpour, M. (2015). Evaluation of phenotypic resistance to rusts in some Iranian wheat genotypes in greenhouse and field conditions. Seed and Plant Improvement Journal, 31(3), 531-546.
4. Draz, I.S., Abou-Elseoud, M.S., Kamara, A.-E.M., Alaa-Eldein, O.A.-E. & El-Bebany, A.F. (2015). Screening of wheat genotypes for leaf rust resistance along with grain yield. Annals of Agricultural Sciences, 60(1), 29-39.
5. Ebrahimyan, M., Nasrollahnezhad Ghomi, A.A., Null, K. & Ramezanpour, S.S. (2019). Evaluation of resistance to leaf rust at adult stage in some bread wheat cultivars. Journal of Plant Production Research, 26(3), 89-102.
6. El-Orabey, W.M., Hamwieh, A. & Ahmed, S.M. (2019). Molecular markers and phenotypic characterization of adult plant resistance genes Lr 34, Lr 46, Lr 67 and Lr 68 and their association with partial resistance to leaf rust in wheat. Journal of Genetics, 98(3), 1-12.
7. Esfandiari, E. (1948). Troisième liste des fungi ramassés en Iran. Applied Entomology and Phytopathology, 8, 1-15.
8. Hei, N., Shimelis, H.A. & Laing, M. (2017). Appraisal of farmers wheat production constraints and breeding priorities in rust prone agro-ecologies of Ethiopia. African Journal of Agricultural Research, 12(12), 944-952.
9. Huerta-Espino, J., Singh, R., Crespo-Herrera, L.A., Villaseñor-Mir, H.E., Rodriguez-Garcia, M.F., Dreisigacker, S., Barcenas-Santana, D. & Lagudah, E. (2020). Adult plant slow rusting genes confer high levels of resistance to rusts in bread wheat cultivars from Mexico. Frontiers in Plant Science, 11, 824.
10. Kolmer, J. (2013). Leaf rust of wheat: Pathogen biology, variation and host resistance. Forests, 4(1), 70-84.
11. Lagudah, E. & Halloran, G. (1989). Phylogenetic relationships of Triticum tauschii, the D genome donor to hexaploid wheat: 3. Variation in, and the genetics of, seed esterases (Est-5). Theoretical and Applied Genetics, 77(6), 851-856.
12. Lee, A., Trinh, A.C., Lee, W.J., Kim, M., Lee,, Pathiraja, D., Choi, I., Chung, N., Choi, C., Lee, B.C., Lee, H. (2020). Characterization of two leaf rust-resistant Aegilops tauschii accessions for the synthetic wheat development. l. Appl Biol Chem, 63,13.
13. Li, G., Xu, X., Bai, G., Carver, B.F., Hunger, R. & Bonman, J.M. (2017). Novel sources of leaf rust resistance in winter wheat. Crop Science, 57(2), 865-876.
14. McIntosh, R.A., Wellings, C.R. & Park, R.F. (1995). Wheat rusts: An atlas of resistance genes: CSIRO publishing. 200 p.
15. Mojerlou, S.H., Safaei, N., Abbasi_Moghaddam, A. & Shams Bakhsh, M. (2014). Evaluation of some Iranian wheat landraces resistance against stem rust resistance at seeding stage in the greenhouse. Plant Protection Journal, 35(4), 69-82. (In Farsi)
16. Parlevliet, J.t. & Van Ommeren, A. (1975). Partial resistance of barley to leaf rust, Puccinia hordei. II. Relationship between field trials, micro plot tests and latent period. Euphytica, 24(2), 293-303.
17. Pathan, A.K. & Park, R.F. (2006). Evaluation of seedling and adult plant resistance to leaf rust in European wheat cultivars. Euphytica, 149(3), 327-342.
18. Peterson, R.F., Campbell, A. & Hannah, A. (1948). A diagrammatic scale for estimating rust intensity on leaves and stems of cereals. Canadian Journal of Research, 26(5), 496-500.
19. Qureshi, N., Bariana, H., Kumran, V.V., Muruga, S., Forrest, K.L., Hayden, M.J. & Bansal, U. (2018). A new leaf rust resistance gene Lr79 mapped in chromosome 3BL from the durum wheat landrace Aus26582. Theoretical and Applied Genetics, 131(5), 1091-1098.
20. Roelfs, A.P., Singh, R.P. and Saari, E.E. (1992). Rust diseases of wheat: Concepts and methods of disease management. CIMMYT, Mexico, 80 p..
21. Safavi, S.A., Ahari, A.B., Afshari, F. & Arzanlou, M. (2013). Slow rusting resistance in Iranian barley cultivars to Puccinia striiformis sp. hordei. Journal of Plant Protection Research, 53(1), 5-11.
22. Soliman, A.S., Heyne, E. & Johnston, C. (1963). Resistance to leaf rust in wheat derived from Chinese Aegilops umbellulata translocation lines 1. Crop Science, 3(3), 254-256.
23. Sthapit, J., Newcomb, M., Bonman, J.M., Chen, X. & See, D.R. (2014). Genetic diversity for stripe rust resistance in wheat landraces and identification of accessions with resistance to stem rust and stripe rust. Crop Science, 54(5), 2131-2139.
24. Torabi, M., Nazari, K. & Afshari, F. (2001). Genetic of pathogenicicty of Puccinia reconditasp. tritici, the causal agent of leaf rust of wheat. Iranian Journal Agricultral Science, 32(3), 625-635. (In Farsi)
25. Ulaszewski, W., Tomasz, M. (2020). Aegilops Species for the improvement of the leaf and stripe rust resistance in cultivated triticale (×Triticosecale Wittmack). Agronomy, 10,1991.
26. Van der Plank, J. (1963). Plant diseases: Elsevier.
27. Winzeler, M., Winzeler, H. & Keller, B. (1995). Endopeptidase polymorphism and linkage of the Ep‐D1c null allele with the Lrl9 leaf‐rust‐resistance gene in hexaploid wheat. Plant breeding, 114(1), 24-28.
28. Xu, X., Bai, G., Carver, B.F., Shaner, G.E. & Hunger, R.M. (2005). Molecular characterization of slow leaf‐rusting resistance in wheat. Crop Science, 45(2), 758-765.
29. Zahravi, M., Afshari, F. & Ebrahimnejad, S. (2019). Study of genetic diversity of resistance to yellow rust in bread wheat germplasm. Modern Genetics Journal, 14(3), 263-274.
30. Zhang, P., Li, X., Gebrewahid, T.-W., Liu, H., Xia, X., He, Z., Li, Z. & Liu, D. (2019). QTL mapping of adult-plant resistance to leaf and stripe rust in wheat cross SW 8588/Thatcher using the wheat 55K SNP array. Plant Disease, 103(12), 3041-3049.