مقدمه

خشک سالی ‎های گسترده و متعددی که در سال‎های اخیر در کشور ما اتفاق افتاد، نشان داد که گونه ‎های گیاهی موجود در طبیعت باید از تنوع ژنتیکی زیادی برخوردار باشند تا بتوانند در مقابل این تغییرات گسترده شرایط اقلیمی از جمله میزان رطوبت دریافتی، پایداری لازم را از خود نشان دهند. شناخت این تنوع در گونه‎ های گیاهی ارزشمندی نظیر گونه‎ های مختلف جنس نپتا که روز به روز بر ارزش داروئی آن‌ها افزوده می‎شود، اهمیت زیادی دارد تا ضمن استفاده از توانمندی‎های موجود در آن‌ها، در پی رفع نقائص احتمالی آن‌ها هم بود. تنوع ژنتیکی موجود در جمعیت‎ های گیاهان مختلف از جمله گیاهان دارویی، می‎تواند یکی از منابع اصلی تنوع در متابولیت ‎های ثانویه آن‌ها باشد. به‎ عبارت دیگر، این تنوع به‎ میزان زیادی مقدار و نوع مواد مؤثره را بین تک ‎بوته‎ های یک گونه گیاهی تعیین می‎کند (Poulev et al., 2003). تنوع ژنتیکی درون جمعیتی در توده‎های وحشی گونه‎ های گیاهی، تعیین‎ کننده توانمندی این گونه ‎ها در مقابله با شرایط مختلف محیطی و اکولوژیکی است که ممکن است طی دوره‎های مختلف بر این گونه‎ ها در شرایط طبیعی اتفاق افتد. شناخت عوامل مؤثر بر فرسایش ژنتیکی و در معرض خطر قرار گرفتن گونه‎ های گیاهی ارزشمند از جمله گونه‎ های داروئی، از جمله اهداف مورد نظر محققین در ارزیابی تنوع و ساختار ژنتیکی گونه ‎های گیاهی است.

صفات مورفولوژیک، به‌طور وسیع برای تعیین میزان تنوع ژنتیکی در گیاهان مورد استفاده قرار می‌گیرند. درک عوامل شباهت بین خویشاوندان، اساس مطالعه صفات کمی و کاربرد آن در اصلاح گیاه را تشکیل ‌می‌دهد. درجه این شباهت را می‌توان با اندازه‌گیری‌های تقریبا ساده تعیین کرد و از آن برای برآورد مقدار واریانس افزایشی استفاده نمود. نسبت واریانس افزایشی به واریانس کل (وراثت‌پذیری)، عاملی است که برای تعیین بهترین روش اصلاحی در گیاهان مورد استفاده قرار می‌گیرد (Falconer & MacKay, 1996). درجه شباهت بین خویشاوندان، متکی بر تجزیه واریانس فنوتیپی بر اساس گروه‌بندی افراد به صورت خانواده (تنی یا ناتنی) است. برادر-خواهران ناتنی، یک والد مشترک و یک والد متفاوت دارند؛ بنابراین خواهر-برادران ناتنی، نتاج فردی هستند که به‌طور تصادفی با چند فرد دیگر آمیزش می‌یابد (Falconer & MacKay, 1996). با استفاده از این روش می‎توان ضمن ارزیابی توانمندی ژنتیکی جمعیت‌های مختلف از یک یا چند گونه گیاهی در راستای به‎کارگیری آن‌ها در برنامه‎های اصلاحی، آن‌ها را از نظر این قابلیت‎ها با همدیگر مقایسه کرد و اثرات احتمالی محیط و ابعاد جمعیتی را بر توانمندی این جمعیت‎ها مطالعه کرد (Sebbenn, 2003).

جنس نپتا یا نعنای گربه (Nepeta) در بخش‎های وسیعی از اروپا، آسیا و بخش‎هایی از آفریقا توزیع شده‎ است (Karaman & Comlekciogolu, 2007). این جنس در ایران 80 گونه دارد که 43 گونه آن انحصاری هستند. از بین گونه‌های موجود در کشور، 12 گونه با نام پونه‌سا شناخته می‌شوند (Jamzad, 2012). پونه‌سای خوشه‌ای با نام علمی‌ Nepeta racemosa دارای پراکنش جهانی است که در کشور ما در مناطقی از شمال، شمال غرب و مرکز کشور رویش دارد. این گونه، فرم رویشی علفی دارد و دائمی است و تا ارتفاع 75 سانتی‌متر هم رشد می‎کند. گونه‌های جنس نپتا در طب سنتی مورد استفاده قرار می‌گیرند و دارای خواص متعددی از جمله ضد التهابی، ضد باکتریایی، ضد قارچی، ضد ویروسی و آنتی اکسیدانی بالا هستند (Narimani et al,. 2017). وجود ترکیبات دارویی با ارزشی چون انواع ایزومرهای نپتالاکتون و 8،1- سینئول در پونه‌سای خوشه‌ای گزارش شده است (Dabiri & Sefidkon, 2003). از بین گونه‌های نپتای موجود در ایران (Jamzad, 2012; Narimani et al., 2017)، برخی به‎عنوان ادویه استفاده می‎شوند، ولی عمده‎ترین کاربری بیشتر گونه‎های آن داروئی است (Rustaiyan et al., 2000). به دلیل دارا بودن ترکیبات با ارزش دارویی، مطالعات مختلفی بر روی کمیت و کیفیت اسانس گونه‌های مختلف این جنس و عوامل تأثیرگذار بر روی این ویژگی‌ها از جمله خشکی صورت گرفت است (Baser et al., 1993; Asgharpanah et al., 2013; Hadi, et al., 2016). عمده مطالعات جمعیتی که بر روی گونه‌های این جنس انجام شده است، در رابطه با تنوع فیتوشیمیایی بوده است و مطالعات معدودی نیز درخصوص بررسی تنوع ژنتیکی براساس ویژگی‌های مورفولوژیک و مولکولی بر روی گونه‌‌های جنس نپتا صورت گرفته است. از جمله، جمعیت‌های مختلف سه گونهN. racemosa ، N. menthoides Boiss. & Buhse وN. cataria L.  ازنظر برخی از ویژگی‌های مورفولوژیک، درصد و بازده اسانس مورد مقایسه قرار گرفته‌اند (Bahrami, et al., 2018). در تحقیقی دیگر، 15 جمعیت مختلف از گونه N. cataria با استفاده از نشانگرهای RAPD و فیتوشیمیایی ارزیابی شدند که براساس دسته‌بندی خوشه‌ای انجام شده بر روی داده‌ها، جمعیت‌ها در چند گروه قرار گرفتند (Baghizadeh, et al., 2018). تنوع درون و بین جمعیتی 21 جمعیت از گونه N. kotschy نیز با استفاده از نشانگر RAPD مورد ارزیابی قرار گرفته است که نتایج نشان داد که 32 درصد از تنوع مشاهده شده درون جمعیتی و 68 درصد از تنوع بین جمعیتی بوده است (Hadi, et al., 2020).

با توجه به این‌که مدیریت موفق در نگهداری گونه‎ها و جمعیت‎های گیاهی نادر یا در معرض خطر فرسایش و انقراض، به‎ درک و شناخت صحیح آن گونه به‎ویژه ویژگی‎های جمعیتی و تنوع ژنتیکی آن بستگی دارد (Arzate-Fernandez et al., 2005)، باید برنامه مدونی برای تقویت و حفاظت از رویشگاه‎های آن‌ها تدوین و به مورد اجرا گذاشته شود. مشاهدات نشان داد که در برخی از مناطق‌، تغییر کاربری اراضی طبیعی و چرای دام، منجر به حذف بوته‌‌ها در رویشگاه‌های آن‌ها شده است. به همین دلیل و با توجه به نبود اطلاعات درخصوص ساختار ژنتیکی گونه‌های مختلف جنس نعناع گربه از جمله N. racemosa در بررسی منابع، مطالعه تنوع درون جمعیتی و درون‎گونه‎ای در این گونه ارزشمند در دستور کار قرار گرفت. این تحقیق در طول سال‎های 1396 و 1397 بر روی فامیل‌های متعددی از دو جمعیت از گونه مذکور صورت گرفت تا هم ساختار تنوع ژنتیکی هر یک از جمعیت‎ها بر‌اساس ویژگی‎های مورفولوژیک بررسی شود و هم میزان تفاوت دو جمعیت از این گونه مشخص شود تا بتوان بر ‌اساس ویژگی‌های مورد مطالعه، امکان اصلاح و بهره‌برداری از افراد برتر را مورد ارزیابی قرار داد.

مواد و روش‌ها

در طول سال 1396 و در پایان فصل رویش و در زمان تکمیل دوره زایشی، از دو جمعیت آزادگرده افشان (که‌ به‌طور کامل از یکدیگر مجزا بودند) در استان البرز از دو منطقه، 1- بالای تونل کندوان با ارتفاع 2874 با مختصات جغرافیایی 36 درجه و نه دقیقه و چهار ثانیه شمالی و 51 درجه و 17 دقیقه و 3/24 ثانیه شرقی شرقی و 2- منطقه پیست اسکی دیزین با ارتفاع 3293 متری و با مختصات 36 درجه و یک دقیقه و 8.59 ثانیه شمالی و 51 درجه و 25 دقیقه و 1/52 ثانیه شرقی، بذر 30 تک گیاه به‌صورت جداگانه و تصادفی جمع‎آوری شد. در جمعیت‌های آزادگرده‌افشان، به دلیل این‌که بذرهای هر بوته حاصل تلاقی تصادفی گل‌های بوته مادری با گرده‌ گل‌های سایر بوته‌ها در جمعیت هستند و تنها در یکی از والدین مشترک می‌باشند، افراد حاصل از آن بوته، به‎عنوان خواهر-برادر ناتنی (Half-sib) در نظر گرفته می‌شوند.

جوانه‌زنی بذر و تولید نشا

برای بررسی جوانه‌زنی، بذرهای هر خانواده ناتنی به‎صورت جداگانه با قارچ‎کش کاربوکسین‌تیرام دو در هزار به مدت 4 دقیقه ضد عفونی و در پتری‎دیش و بر روی کاغذ صافی مرطوب قرار داده شدند. با توجه به کافی نبودن بذر‌ها برای انجام آزمایشات مربوط به جوانه‌زنی در قالب طرح‌های آماری، پس از بررسی منابع، از تیمارهای گفته شده برای شکستن خواب بذر از جمله سرمادهی، استفاده شد. به دلیل مؤثر نبودن دستورالعمل‌های ذکر شده، برای شناسایی و انتخاب بذرهای دارای قوه نامیه بالا جهت کاشت در سینی‌های نشا، از روش غوطه‌ورسازی بذرها در آب استفاده شد. بذرهای دارای قوه نامیه بالا به دلیل پر بودن دانه و سنگین‌تر بودنشان، به زیر آب رفتند و سه تا چهار روز بعد از کشت در پتری‌دیش، تا 100 درصد جوانه زدند، ولی بذرهایی که روی سطح آب قرار گرفتند، با وجود ظاهری درشت و سالم، درصد جوانه‌زنی بسیار کمی نشان دادند. بذرها در دمای 25 درجه سانتی‎گراد و در شرایط محیط آزمایشگاه قرار داده شدند تا جوانه زنند. بذر تعدادی از تک‎بوته‎ها یا به‎عبارت دیگر بذر برخی از فامیل‎های ناتنی، تندش کافی نداشتند و به ‎ناچار از آزمایش حذف شدند. بذر خانواده‎هایی که به مقدار کافی جوانه ‎زده بودند، به‎صورت جداگانه در سینی کشت که با مخلوط پیت ماس و پرلیت به‎نسبت شش به یک به‎عنوان بستر کاشت پر شده بود، به‌صورت سطحی کاشته شدند. سینی‌های کشت در گلخانه با شرایط دمائی تقریبی 20 و 24 درجه سانتی‎گراد در شب و روز قرار داده شدند و آبیاری روزانه نیز به‌صورت مه‌پاش انجام شد.

انتقال به مزرعه

پس از 10 هفته رویش گیاهان در شرایط گلخانه، گیاهان باقیمانده در بهار سال 1397 در قالب آزمایش بلوک‎های کامل تصادفی با سه تکرار به مزرعه‎ای‎ واقع در ایستگاه تحقیقاتی البرز واقع در کرج (با ارتفاع 1321 متر از سطح دریا) منتقل شدند. هر بلوک شامل 20 پلات و هر پلات شامل یک ردیف با هفت بوته با فواصل 50 و 45 سانتی‎متر به‎ترتیب بین بوته‎ها در روی ردیف‌ و بین ردیف‌ها بود. با وجود این‌که درصد بالایی از بذرهای تک بوته‌ها فاقد قوه نامیه بودند و با توجه به تغییر رویشگاه گیاهان مورد مطالعه، تعداد 277 تک‎گیاه از مجموع 20 فامیل در مزرعه‎ سازگار شدند و پس از استقرار به بلوغ کامل رسیدند. گیاهان تولید شده از نظر ویژگی‎های مورفولوژیکی مانند ارتفاع بلندترین شاخه (سانتی‌متر)، قطر تاج پوشش (سانتی‌متر)، طول گل آذین (سانتی‌متر)، قطر گل آذین (میلی‌متر)، طول و عرض برگ (میلی‌متر)، تعداد شاخه فرعی (تا ارتفاع پنج سانتی‌متری از سطح خاک) و عملکرد خشک تک بوته (گرم) مطالعه شدند تا با تخمین اجزای بیومتریکی واریانس (واریانس فنوتیپی) موجود در دو جمعیت مورد مطالعه، اجزای ژنتیکی واریانس هم محاسبه شوند و براساس این اجزا، وراثت‎پذیری تنوع موجود در صفات مورد مطالعه نیز تخمین زده شود. با توجه به این‌که افراد هر فامیل ناتنی با افراد سایر فامیل‎ها در هر جمعیت متفاوت بودند، از مدل آشیانه‎ای (Nested) با مدل آماری زیر برای تجزیه داده‎ها استفاده شد (رابطه 1):

Y_ijl = µ + a_i +b_j + r_l(i) + e _ijl               رابطه 1

در این مدل، Y_ijl: ارزش فنوتیپی صفت مورد تجزیه بر روی نتاج lام از فامیل ناتنی iام در تکرار jام، µ: میانگین عمومی صفت، a_i: اثر فامیل iام، b_j: اثر تکرار jام، r_l(i): اثر lامین نتاج آشیانه شده در iامین والد مادری و در نهایت e _ijl: اثر باقیمانده یا خطای مدل است. باید اشاره کرد که برای محاسبه وراثت‌پذیری در استفاده از این طرح و مدل آماری، بر مبنای فرضیات این طرح، بوته‌هایی که به عنوان والدین استفاده می‌شوند باید از یک مبدأ ژنتیکی باشند؛ از این رو پایه‌ها و تک بوته‎های مورد مطالعه از هر جمعیت به‌صورت مستقل مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند (Mirzaie-Nodoushan et al., 2012).

تجزیه واریانس داده‎ها با استفاده از فرمان GLM از نرم افزار SAS صورت گرفت (SAS Institute Inc., 1989) که در آن همه اثرات موجود در مدل، تصادفی قلمداد شدند و با توجه به آشیانه‎ای بودن مدل آماری مورد استفاده، از اثر نتاج به‎عنوان خطای آزمایشی برای سنجش و ارزیابی اثر والدین مادری (یا اثر فامیل) استفاده شد و سایر اثرات موجود در جدول تجزیه واریانس با استفاده از خطای آزمایشی ارزیابی شدند (Mirzaei-Nodoushan et al., 2012). میانگین صفات مورد مطالعه در هر جمعیت به‎صورت جداگانه و با استفاده از روش دانکن دسته‎بندی شدند. برای محاسبه وراثت‌پذیری بر اساس میانگین خانواده و تک بوته، اجزای واریانس فنوتیپی با استفاده از امید ریاضی میانگین مربعات (جدول 1) به اجزای ژنتیکی واریانس تفکیک شدند.

جدول 1– امید ریاضی میانگین مربعات حاصل از تجزیه واریانس صفات مربوط به k والد مادری با n نتاج در هر یک از r تکرار در یک طرح آزمایشی بلوک کامل تصادفی بر پایه مدل آشیانه‌‌ای

Table 1. Expected mean square (EMS) resulting from analysis of variance of k female parents, each with n progenies, studied based on an experimental design with r replications, and analyzed by a nested model

پس از محاسبه اجزای واریانس ژنتیکی فامیل‌های ناتنی و نتاج درون فامیل‌ها، طبق روابط زیر، وراثت‎پذیری خصوصی صفات مورد مطالعه بر مبنای میانگین خانواده و تک بوته تخمین زده شد (رابطه 2، Sebbenn et al., 2003؛ رابطه 3، Fehr, 1991; Sebbenn et al., 2003):

h²_f = s²_f/(s²_f+s²_p/nb+s²_e/b)             رابطه 2

h²_i =3s²_f/(3s²_f+s²_b +s²_p +s²_e)         رابطه 3

در این روابط، s²_f: جزء واریانس فامیل یا خانواده‎های ناتنی است که برابر با واریانس ژنتیکی می‌باشد، s²_b: جزء واریانس بلوک، s²_p: جزء واریانس درون فامیل‎ها و s²_e: واریانس خطای آزمایشی، k: تعداد فامیل،n : تعداد نتاج در هر فامیل و b: تعداد بلوک است (Sebbenn et al., 2003). از رابطه 3 زمانی استفاده می‌شود که عملکرد بوته‌های داخل یک بلوک با توجه به عملکرد سایر بوته‌ها در بلوک‌های دیگر مورد بررسی قرار می‌گیرد (Fehr, 1987; Sebbenn et al., 2003).

با توجه به این‌که واریانس ژنتیکی بین خانواده‌‌های ناتنی با کواریانس درون خانواده‌های ناتنی برابر است، در تخمین برآورد واریانس ژنتیکی افزایشی (σ²_A) مورد استفاده قرار می‌گیرد (Falconer & MacKay, 1996). در محاسبه وراثت‌پذیری خصوصی بر مبنای تک بوته، با توجه به این‌که فامیل‎های مورد مطالعه ناتنی هستند، باید جزء s²_f در چهار ضرب شود σ²_f=4σ²_A (Sebbenn et al., 2003)، ولی به دلایلی همچون وجود تنوع در میزان بذر تولیدی از طریق خودگشنی بین بوته‌‌ها در این گونه (بررسی‎های منتشر نشده نویسندگان)، تکثیر بوته‌ها از طریق ساقه زیرزمینی تا شعاع حدود یک ونیم متری (مشاهده شده) و تراکم کم بوته‎ها در رویشگاه‎های مورد مطالعه و احتمال تلاقی بوته‎‌ها با یکدیگر، احتمال زیادی وجود داشت که تعدادی از بذرهای حاصل از یک بوته، خواهر و برادر تنی ‌باشند. در این حالت، واریانس بین فامیل‌ها، ₂/¹ واریانس افزایشی خواهد بود (σ²_f=2σ²_A) (Falconer & MacKay, 1996). از این رو در این رابطه، جزء فامیل در عدد سه ضرب شد تا خانواده‎های مورد مطالعه حد واسط تنی و ناتنی قلمداد شوند (Mirzaei-Nodoushan et al., 2018).

برای تعیین تنوع بین و درون جمعیت‌‌ها و شاخص‌های سهیم در تنوع، از روش تجزیه به مؤلفه‌های اصلی (PCA) بر مبنای همبستگی استفاده شد. همچنین گروه‌بندی جمعیت‌‌ها نیز به‌وسیله تجزیه خوشه‌ای به روش ‌Ward و با استفاده از نرم‌افزارJMP  (13.2.0) انجام شد.

نتایج و بحث

مشخص شد که بسیاری از بذرهای تولیدی در این گونه، به دلیل ریزش زودهنگام قبل از پر شدن دانه، فاقد قوه نامیه هستند که با توجه به شرایط موجود در طبیعت از قبیل خشکی‎های دوره‎ای و عدم بارش و تأمین رطوبت کافی در زمان پر شدن دانه قابل توجیه می‌باشد. در تحقیقی برای شکستن خواب بذرهای نپتا، اثر یک تا دو ماه تیمار سرمادهی بر جوانه‌زنی بذر 10 گونه از این جنس مطالعه و تأثیر مثبت آن گزارش شده است. (Asgari et al., 2015). در مطالعه‌ای دیگر، اثر بستر کاشت، تیمارهای سرمادهی، گرمادهی و طول دوره روشنایی در جوانه‌زنی بذر چهار گونه از نپتا مطالعه شد که درصد پایین جوانه‌زنی در گونه‌های مورد مطالعه گزارش شده است (Padure, 2006)، ولی بررسی حاضر، مغایر با یافته‌های قبلی بود و نشان داد که بذر این گونه فاقد خواب است.

نتایج تجزیه واریانس نشان داد که اثر فامیل در هر دو جمعیت برای صفات طول برگ، قطر تاج پوشش و عملکرد تک بوته در سطح یک‎درصد معنی‎دار بود (جدول 2)، درحالی‌که در هر دو جمعیت، فامیل‎های مورد مطالعه از نظر قطر گل‎آذین با هم اختلاف معنی‎داری نداشتند. اختلاف بین فامیل‎ها در درون هر جمعیت در جدول 3 به‎خوبی نمایان است. در جمعیت اول در صفت ارتفاع گیاه، میانگین فامیل‌ها بین 5/31 تا 5/63 سانتی‎متر قرار داشت. در این جمعیت، با وحود این‌که اختلاف طول گل‎آذین بین فامیل‎ها از نظر آماری معنی‎دار نشد، ولی دامنه میانگین‎ها بین 6/9 تا 7/15 سانتی‎متر بود. لازم به‎ذکر است که این اعداد، میانگین همه بوته‎های هر فامیل در هر سه تکرار آزمایش است. به‎عبارت دیگر در سطح تک‎بوته، اختلاف بین تک‎بوته‎ها در درون فامیل‎ها، بیشتر از اختلاف بین فامیل‎هاست که با توجه به نحوه گرده‌افشانی و دگرگشن بودن این گونه قابل توجیه می‌باشد. به‎عنوان مثال، ارتفاع گیاه بین تک‎بوته‎ها در جمعیت اول بین 19 و 79 سانتی‎متر (اطلاعات تک‎بوته‎ها ارائه نشده است) و طول گل‎آذین در همان جمعیت بین 5/5 تا 7/19 سانتی‎متر متغیر بود. از نظر تعداد شاخه جانبی، بین فامیل‌های جمعیت اول اختلافی در سطح یک درصد مشاهده شد، درحالی‌که در جمعیت دوم، بین فامیل‌ها از نظر این صفت اختلافی مشاهده نشد. فامیل‌های جمعیت دوم هیچ اختلاف معنی‌داری با یکدیگر نداشتند، درحالی‌که بین نتاج فامیل‌های جمعیت اول از نظر ارتفاع گیاه اختلاف معنی‌دار یک درصد مشاهده شد.

جدول 2- میانگین مربعات حاصل از تجزیه واریانس داده‎های مربوط به‎ مطالعه ویژگی‎های مورفولوژیک تعدادی از خانواده‎های ناتنی از دو جمعیت طبیعی گونه‎ای از پونه‌سای خوشه‌ای (N. racemosa) بر مبنای مدل آشیانه‌ای

Table 2. Mean squares of nested model analysis of variance of the morphological characteristic data of several half-sib families of two natural populations of N. racemosa.

*، ** و ns:  به ترتیب معنی‎دار در سطح پنج و یک درصد و غیر معنی‌‎دار.

**, * and ns: Significant at 1% and 5% of probability levels and non-significant, respectively.

اختلاف بین میانگین فامیل‎ها در هر دو جمعیت به ‎میزانی بود که دسته‎بندی به‎روش دانکن، آن‌ها را در دسته‎جات مختلفی قرار داد که با توجه به‎دامنه تنوع در صفات مطالعه شده و نیز میزان خطای آزمایشی حاصل از تجزیه واریانس، تعداد دسته‎ها و مقدار همپوشانی این دسته‎ها متفاوت بود (جدول 3). در صفاتی نظیر ارتفاع، قطر تاج پوشش، عملکرد خشک و تعداد شاخه جانبی، فامیل R113 به‎تنهائی در یک دسته (a) قرار گرفت و سایر فامیل‎ها همگی در دسته‌های بعدی قرار گرفتند. به‌طور کلی برترین فامیل‌ جمعیت اول از نظر صفات مهمی چون عملکرد خشک و تعداد شاخه جانبی، فامیل‌‌ R113 و در جمعیت دوم، فامیل R24 بود. البته فامیل‌های R113 و R24 از نظر بیشتر صفات، برتری خاصی نسبت به‎سایر فامیل‎ها از خود نشان دادند. در مطالعه‌ای که بر روی سه جمعیت از گونه N. racemosa واقع در استان قزوین انجام شد، گیاهان مورد مطالعه در صفاتی چون ارتفاع، قطر تاج پوشش و تعداد گل در بوته تنوع بالایی نشان دادند (Bahrami, et al., 2018).

جدول 3- دسته‎بندی میانگین‎ ویژگی‎های مورفولوژیک تعدادی از خانواده‎های ناتنی از دو جمعیت طبیعی گونه‎ای از پونه‌سای خوشه‌ای (N. racemosa)

Table 3. Means classification of morphological characteristics of several half-sib families of two natural populations of N. racemosa

میانگین‎های دارای حروف مشابه هر ستون،  از نظر آماری در سطح پنج درصد با هم اختلافی ندارند.

Means with the same letter(s) in the same column are not significantly different at 5% of probability level.

تفاوت معنی‎دار بین پایه‎های مادری مورد مطالعه، حکایت از وجود تنوع زیاد در هر دو جمعیت داشت و ضرورت تجزیه و تحلیل نتایج بیومتریکی تجزیه واریانس به اجزای ژنتیکی را مشخص می‎کرد. بدیهی است که بخشی از این تنوع ژنتیکی است و می‎توان از آن در برنامه‎های اصلاح نژادی گونه مورد نظر از جمله تشکیل مخازن ژنی با غنای ژنتیکی کافی استفاده کرد. با تفکیک اجزای واریانس فنوتیپی به اجزای ژنتیکی، کم و کیف منابع تغییرات درون جمعیتی مشخص شد (جدول 4). در جمعیت اول در بیشتر صفات مورد مطالعه، جزء فامیل در مقایسه با جزء نتاج در فامیل، نقش بیشتری در تنوع داشت. از نظر صفات عملکرد خشک، ارتفاع گیاه و قطر تاج پوشش، جزء فامیل به‌ترتیب 44، 41 و 31 درصد سهم داشت. به‎جز قطر گل‎آذین که جزء نتاج در فامیل نقش بیشتری در تنوع داشت تا جزء فامیل (13 درصد در مقابل چهار درصد)، درصد واریانس فامیل در بقیه موارد، چندین برابر درصد واریانس نتاج درون فامیل بود. خطای آزمایشی هم بخش قابل توجهی از واریانس موجود در داده‎ها را تشکیل می‎داد که به‎دلیل دگرگشن بودن این گونه گیاهی و تفاوت تمامی تک‎بوته‎های موجود در یک فامیل با یکدیگر، این موضوع قابل تبیین است. در جمعیت دوم هم تقریبا همین ترکیب از اجزای واریانس حاکم بود، با این تفاوت که مقدار واریانس نتاج در فامیل در برخی صفات مورد مطالعه از جمله ابعاد گل‎آذین، تعداد شاخه‎های جانبی و عملکرد زیست‎توده، یا بسیار ناچیز یا منفی بود که در هر دو صورت، صفر منظور شد (جدول 4). وجود واریانس منفی می‌تواند دلایل متعددی داشته باشد؛ از جمله می‌تواند ناشی از عدم کفایت مدل آماری و ژنتیکی، عدم کفایت نمونه‌برداری از جمعیت مرجع، خطای نمونه‌برداری در برآوردها و ضعف طرح آزمایشی باشد (Ismaili, 2005). ولی یکی از دلایل اصلی در مطالعه گیاهان دگرگشن، وجود تفاوت‌های ژنتیکی بین بوته‌های مختلفی است که در یک پلات قرار دارند. این تفاوت‌ها، قابل تفکیک از خطای آزمایشی نیستند و به ناچار به عنوان خطای آزمایشی قلمداد می‌شوند و در سایر اجزای منابع تغییر در جدول تجزیه واریانس هم ادغام شده اند.

جدول 4- اجزای واریانس و وراثت‎پذیری خصوصی ویژگی‎های مورفولوژیک حاصل از تجزیه واریانس داده‎های مبتنی برخانواده‎های ناتنی از دو جمعیت طبیعی گونه‎ای از پونه‌سای خوشه‌ای (N. racemosa).

Table 4. Variance components and narrow sense heritability resulted from analysis of variance of the morphological characteristic data of half-sib families of two natural populations of N. racemosa

اعداد داخل پرانتز، درصد جزء واریانس مربوطه نسبت به‎کل واریانس است.

Numbers in the parenthesis are percentage of the variance components.

بر اساس نتایج تجزیه به مؤلفه‌های اصلی، دو مؤلفه اول حدود 75 درصد از تنوع بین خانواده‌های دو جمعیت را توجیه کردند. براساس مقادیر بردار ویژه، بیشترین سهم تنوع مربوط به مؤلفه اول (4/54 درصد) بود که شامل صفات ارتفاع بلندترین شاخه، قطر تاج پوشش، طول گل‌آذین و عملکرد بود. پس از آن، مؤلفه دوم با 7/20 درصد، در تنوع موجود سهیم بود که در برگیرنده صفات طول و عرض برگ بود و دو صفت تعداد شاخه فرعی و قطر گل‌آذین، نقشی در تنوع نداشتند. در نمودار پراکنش خانواده‌ها نیز بجز خانواده R22، سایر خانواده‌های جمعیت دوم در فاصله کمی از خانواده‌های جمعیت اول قرار گرفتند. همچنین خانواده R113 به تنهایی و دور از سایر خانواده‌های هر دو جمعیت قرار گرفت که نشان‌دهنده تنوع درون و بین جمعیت‌های گونه مورد مطالعه بود (شکل 1). بررسی فاصله ژنتیکی موجود بین خانواده‌ها بر اساس صفات مورفولوژیک، با استفاده از تجریه خوشه‌ای انجام شد. نتایج تجزیه خوشه‌ای بر اساس خط برش پیشنهادی، چهار گروه فنوتیپی را نشان داد که در آن‌ها خانواده‌های دو جمعیت به‌طور نسبی از یکدیگر جدا شده‌اند. به این‌صورت که در گروه اول، 11 خانواده قرار گرفتند که تنها یکی از آن‌ها مربوط به جمعیت دوم با کد R22 بود. در گروه دوم، پنج خانواده قرار گرفتند که به غیز از خانواده R112، بقیه به جمعیت دوم تعلق داشتند. در گروه سوم، سه خانواده قرار گرفتند و در گروه چهارم نیز تنها خانواده R113 که از نظر کلیه صفات مورد نظر دارای بیشترین مقدار بود، قرار گرفت (شکل 2) که نشان‌دهنده تطابق نتایج تجزیه‌ای خوشه‌ای با نمودار پراکنش خانواده‌ها براساس تجزیه به مؤلفه‌های اصلی است.

شکل 1- پراکندگی فامیل‌های ناتنی دو جمعیت‌ مورد مطالعه بر اساس دو مؤلفه اول حاصل از تجزیه به مؤلفه‌های اصلی

Figure 1. Scatter plot of half-sib families of two populations based on the first two principal components

از آن‌جا که وراثت‌پذیری، تحت تأثیر عوامل مختلفی ازجمله ابعاد جمعیت، تعداد والدین، تنوع ژنتیکی صفات بین والدین و مقدار خودگرده‌افشانی
(Fehr, 1991) قرار می‌گیرد، در این مطالعه نیز مشخص شد که به‌ترتیب در جمعیت اول، صفات ارتفاع بلندترین شاخه، عملکرد و قطر تاج پوشش و در جمعیت دوم، طول برگ، قطر تاج پوشش و عملکرد، بالاترین میزان وراثت‌پذیری را داشتند. وراثت پذیری بالای این صفات به معنی توانمندی بالای این جمعیت‌ها در پاسخ به برنامه‌های اصلاحی از نظر صفات مورد مطالعه است؛ همچنین ظرفیت مناسب جمعیت‌های مورد مطالعه را نشان می‌دهد که با وجود ابعاد کوچک جمعیتی و تخریب آن‌ها، قابل توجه می‎باشد. در گونه‎های دگرگشنی چون N. racemosa انتظار تنوع ژنتیکی زیاد وجود دارد، ولی با توجه به کاهش دامنه جغرافیائی حضور این گونه و کم‎شدن تراکم بوته‎ ها در رویشگاه‎ های مورد مطالعه، کم بودن اثرات فامیل (جدول 4) در برخی از صفات که به کاهش وراثت ‎پذیری آن‌ها منجر شده است نیز قابل توجیه است. نظر به این‌که وراثت‎پذیری خصوصی، حاصل نسبت واریانس افزایشی جامعه به واریانس کل می‎باشد، زیاد بودن آن به این مفهوم است که بیشتر تنوع موجود در آن جامعه از نوع افزایشی است و در صورتی که هدف از برنامه‎ های اصلاحی بر روی گونه، ارتقای میزان آن صفت باشد، روش‎های مبتنی بر گزینش می‎توانند به‎ خوبی پاسخگو باشند. همچنین با توجه به این‌که وراثت‌پذیری خصوصی محاسبه شده بر اساس میانگین خانواده‌ها، بالاتر از وراثت‌پذیری بر مبنای تک بوته برآورد شد، نشان می‌دهد که در برنامه‌های اصلاحی، گزینش بر اساس میانگین خانواده‌ها، مؤثرتر از گزینش توده‌ای است
(Sebbenn et al., 2003). به ‎عبارت دیگر، گزینش پایه‎ها و فامیل‌های برتر نظیر فامیل R113 و R24 و ایجاد مخازن ژنی و جمعیت‎های حاصل از تعداد مناسب این فامیل‎ها می‎تواند راهگشا باشد. پائین بودن وراثت‎پذیری صفاتی چون ابعاد گل‎آذین در هر دو جمعیت می‎تواند به ‎دلیل حساسیت زیاد این صفات به‎عوامل محیطی و ایجاد خطای آزمایشی زیاد باشد. وراثت‎ پذیری بیشتر صفات در جمعیت دوم از جمعیت اول کمتر بود و دلیل آن تخریب بیشتر جمعیت مورد مطالعه بود که هم از نظر وسعت رویشگاه و هم از نظر تراکم بوته در جامعه وضعیت نامطلوبی داشت.

معنی‎ دار نشدن اثرات نتاج در بیشتر صفات مورد مطالعه در هر دو جمعیت، همیشه به دلیل نبود تنوع درون‎ خانواده‎ای نیست. همانطور که گفته شد، بوته‌های تکرارهای سه‌گانه یک فامیل با یکدیگر متفاوت بودند. می‌توان گفت که خطای آزمایشی که در ارزیابی نتاج مورد استفاده قرار می‎گیرد، گاهی به ‎دلیل تفاوت ژنتیکی بوته‎ های درون یک فامیل که در تکرارهای سه­ گانه مقایسه می‎شوند، افزایش می‎یابد. به‎ عبارت دیگر، بخشی از خطای آزمایش به ‎دلیل خطای نمونه‎ گیری نیست، بلکه به‎دلیل تنوع ژنتیکی غیر قابل تفکیک در بین افراد تکرار‎های مختلف است؛ این تنوع ناشی از درصد بالای دگرگشنی در این گونه می‌باشد. تنوع ژنتیکی موجود در گونه ‎های مختلف گیاهی دارویی، بیشتر با استفاده از نشانگرهای ملکولی بررسی شده است (Youssef & Mahgoub, 2015) که در ارزیابی این تنوع، اثرات خطای آزمایشی برخی از منابع تغییر که در آزمایش مزرعه‎ای وجود دارد، در این نوع مطالعات اختلالی ایجاد نمی‎کند. از این رو در بیشتر مطالعاتی که بر مبنای نشانگرهای ملکولی تنوع ژنتیکی موجود در درون و بین جمعیت‎های مختلف گیاهی گونه‎ های گیاهی از جمله گیاهان داروئی که در معرض فرسایش ژنتیکی هم بوده‎اند مطالعه شده است، تنوع در سطح گسترده گزارش شده است
(Sahana et al., 2019).

شکل 2- دسته‌بندی فامیل‌های ناتنی دو جمعیت‌ مورد مطالعه با استفاده از تجزیه‌خوشه‌ای به روش Ward بر مبنای تمام متغیر‌های مورد مطالعه

Figure 2. Cluster analysis of half-sib families of two populations based on morphological traits by Ward method

نتیجه ‎گیری کلی

مطالعه حاضر نشان داد که بین اکثر صفات مورد مطالعه در هر دو جمعیت، تنوع کافی وجود دارد. وجود تنوع ژنتیکی معنی‎ دار در یک جمعیت گیاهی به‎ ویژه جمعیتی که دارای فرسایش ژنتیکی است و ابعاد جمعیتی آن به ‎شدت کاهش یافته است، از این جهت نوید بخش است که هم می‎تواند در برنامه‎ های اصلاحی آن گونه مورد استفاده قرار گیرد و هم نشان دهنده قدرت بافری بالای آن گونه در مقابله با تنش‎های ناخواسته محیطی طی دوره‎ های طولانی است. ایجاد مخازن ژنتیک مصنوعی با استفاده از فامیل‎هایی که برتری خاصی از خود نشان دادند، می‎تواند دو منظوره باشد تا هم مخازن ژنتیکی غنی ایجاد شود و هم از توانمندی آن‌ها در ایجاد توده‎های برتر استفاده شود. در خصوص این دو جمعیت از گونه N. racemosa، اگرچه تنوع مناسبی در بیشتر صفات مشاهده شد، ولی کم بودن وراثت‎پذیری در برخی صفات که نشان‎دهنده اثر بالای محیط در تظاهر آن‌ها می‌باشد، به‎ویژه در جمعیت دوم، ضرورت بازنگری در شیوه مدیریت این جوامع طبیعی را نشان می‎دهد. گزینش افراد برتر در جمعیت‌های طبیعی با توجه به صفاتی چون ارتفاع گیاه و قطر تاج پوشش که وراثت‌پذیری بالایی نشان دادند، می‌تواند در ایجاد مخازن ژنتیکی مؤثر واقع شود. لازم به‎توضیح است که در طبیعت و در رویشگاهای طبیعی این گونه‎، گیاهان هم در معرض تنش‎های محیطی از جمله خشکی هستند و هم در معرض تخریب توسط دام و عوامل انسانی که سبب شده است که زادآوری از طریق بذر و استقرار بوته‎ های جدید بذری، به‎ ندرت صورت گیرد؛ از این رو قرق‎کردن رویشگاه‎های طبیعی و همچنین ایجاد مخازن ژنتیکی می‎تواند بسیار راهگشا باشد.

REFERENCES

1. Arzate-Fernandez, A. M., Miwa, M., Shimada, T. & Yonekura, T. (2005). Genetic diversity of miyama-sukashi-yuri (Lilium maculatum var. Bukosanense), an endemic endangered species at Mount Buko, Saitama, Japan. Plant Species Biology, 20, 57-65.
2. Asgari, M., Nasiri, M., Jafari, A. A. & Flah Hoseini L. (2015). Investigation of chilling effects on characteristics of seed germination, vigor and seedling growth of Nepeta Journal of Rangeland Science, 5(4), 313-324.
3. Asgharpanah, J., Sarabian, S. & Ziarati, P. (2013). Essential oil of Nepeta genus (Lamiaceae) from Iran: a review. Journal of Essential Oil Research, 26(1), 1-12.
4. Baghizadeh, A., Mashayekhi, Z. & Ebrahimi, M. A. (2018) Investigation of genetic and phytochemical diversity of some catnip (Nepeta cataria) populations by RAPD molecular marker and GC/MS method. Iranian Journal of Medicinal and Aromatic Plants, 34(5) , 836-848. (In Persian)
5. Bahrami, M., Alizadeh, M. A. & Nasiri, M. (2018). Evaluation of morphological traits, shoot yields and essential oil yield of some populations of three species of Nepeta. Iranian Journal of Medicinal and Aromatic Plants, 34(2), 206-217 (In Persian)
6. Baser, K. H. C., Ozek, T., Akgul, A. & Tumen, G. (1993). Composition of the essential oil of Nepeta racemosa Journal of Essential Oil Research, 5, 215-217.
7. Dabiri, M. & Sefidkon, F. (2003). Chemical composition of the essential oil of Nepeta racemosa from Iran. Flavour and Fragrance Journal, 18, 157-158.
8. Falconer, D. S. & Mackay T. F. C. (1996). Introduction to Quantitative Genetics. Longman.
9. Fehr, W. (1991). Principles of cultivar development. Macmillian Publishing Company.
10. Hadi, N., Sefidkon, F., Shojaeiyan, A. & Jafari, A. A. (2016). Essential oil diversity of 21 populations from Iranian endemic species Nepeta kotschyi Iranian Journal of Medicinal and Aromatic Plants, 32, 189-202. (In Persian)
11. Hadi, N., Shojaeiyan, A., Sefidkon, F., Jafari, A. A, Misic, D., Banjanac, T. & Siler, B. (2020). Assessment of intfraspecific genetic diversity in Nepeta kotschyi, a native Iranian medicinal plant. JAST, 22(5), 1327-1334.
12. Ismaili, A., Dehghani, H., Khavari Khorasani, S. & Nodoushan, H. (2005). Estimation of combinability and gene effects in early-mature maize inbred lines using line× tester analysis. Iranian Journal of Agriculture Science, 36(4), 917-929. (In Persian)
13. Jamzad, Z. (2012). Flora of Iran, Lamiaceae. Research Institute of Forests and Rangelands. (In Persian)
14. Karaman, S. & Comlekciogolu, N. (2007). Essential oil composition of Nepeta cilicia Apud Bent and Phlomis viscose Poiret from Turkey. International Journal of Botany, 3, 122-124.
15. Mirzaie-Nodoushan, H., Keneshloo, H., Asadi-Corom, F., Hassani, M. & Achak, M. U. (2012). Genetic architecture of Moringa peregrina populations at early growth stage. Iranian Journal of Rangelands and Forests Plant Breeding and Genetic Research, 20, 25-38. (In Persian)
16. Mirzaie-Nodoushan, H., Hosseinzadeh, J., Mehrpur, S., Panahi, P. & Mehdifar, D. (2018). Genetic architecture of a Persian oak plant population based on progenies seedling characteristics. Iranian Journal of Rangelands and Forests Plant Breeding and Genetic Research, 26(1), 32-43. (In Persian)
17. Narimani, R., Moghaddam, M., Ghasemi Pirbalouti, A. & Mojarab, S. (2017). Essential oil composition of seven populations belonging to two Nepeta species from Northwestern Iran. International Journal of Food Properties. 20(S2), S2272-S2279.
18. Padure, I. M. (2006). Seed germination and morpho-anatomical studies of the seedlings in genus Nepeta (lamiaceae, nepetoideae) in Romania. Acta Horti Botanici Bucurestiensis, 33, 63-70.
19. Poulev, A., Neal, J. M. O., Logendra, S., Pouleva, R. B., Timeva, V., Gar-vey, A. S., Gleba, D., Jenkins, I. S. B. T., Halpern, Kneer, R., Cragg G. M. & Raskin, I. (2003). Elicitation, a new window into plant chemodiversity and phytochemical drug discovery. Journal of Medicinal Chemistry, 5, 2542-2547.
20. Rustaiyan, A., Khosravi, M., Larijany, K. & Masoudi, S. (2000). Composition of the essential oil of Nepeta racemosa from Iran. Journal of Essential Oil Research, 12, 151-152.
21. Sahana, K. S., Gnanam, R., Rajesh, S. & Rajamani, K. (2019). Evaluation of genetic diversity in Gloriosa superb an endangered medicinal plant using molecular marker. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences, 8, 2125-2134.
22. SAS Institute Inc. 1989. SAS user’s guide: statistics. 5th edition. SAS Institute. USA.
23. Sebbenn, A. M., Pontinha, A. A. S. Giannotti, E. & Kageyama, P. Y. (2003). Genetic variation in provenance-progeny test of Araucari angustifolia (Bert.) O. Ktze. In Sao Paulo, Brazil. Silvae Genetica, 52, 181–184.
24. Youssef, M. A. H. & Mahgoub, H. A. M. (2015). Phytochemical and molecular analysis of some medicinal plants of Labiatae family growing at different altitudes on Saint Katherine Mountain, South Sinai, Egypt. Egyptian Journal of Genetics and Cytology, 44, 331-356.