The Expression enhancement of some genes involved in th diosgenin biosynthesis pathway in fenugreek treated with different levels of melatonin under salinity stress

مقدمه

شنبلیله با نام علمیTrigonella foenum-graceum L. گیاهی متعلق به خانواده بقولات، راسته گلسرخ و جنس Trigonella است (Mozafarin, 1995). شنبلیله سرشار از مواد مغذی از جمله کربوهیدرات، پروتئین، فیبر، ویتامین­­ها و مواد معدنی می­باشد و. بذرهای این گیاه، حاوی موادی از قبیل آلکالوئید(Alkaloid) ، تریگونلین (Trigonelline)، کولین (Choline) و ساپوجنین­های استروئیدی با اثرات دارویی ویژه­ای است (Vasanthi et al., 2017). اهمیت این گیاه به دلیل تولید دایوسجنین است که جزء ساپوجنین­های استروئیدی محسوب می‌شود (Joanna et al., 2015). این متابولیت ارزشمند برای اولین بار در سال 1936 از گیاه Dioscorea tokoro جداسازی شد (Fujii and Matsukawa, 1936). از دایوسجنین در درمان بیماری‌های متابولیکی مانند چاقی، دیابت، کلسترول و چربی خون بالا، التهاب و سرطان استفاده می­شود (Upadhyay et al., 2014). در حال حاضر، ابهامات زیادی در مورد مسیر بیوسنتزی دایوسجنین وجود دارد و بیشترین اطلاعات موجود در مورد این مسیر بیوسنتزی، متعلق به سایر گیاهان مانند یام(Dioscorea villosa)  و خانواده سولاناسه (Solanaceae) است (Mandegari, 2012). نیاز مبرم به مواد موثره این گیاه به­عنوان مواد اولیه در صنایع داروسازی، آرایشی و بهداشتی، باعث شده است تا شنبلیله بیش از پیش از ارزش و اهمیت خاصی برخوردار شود (Dini, 2006).

دایوسجنین از طریق مسیر بیوسنتز ایزوپرنوئیدها[1] تولید می­شود؛ این مسیر با پیش­ماده­ی استیل کوآنزیم‌آ­ به ایزوپنتیل پیروفسفات[2] می­رسد. برای تولید دایوسجنین، مسیر لانوسترول (Lanosterol) و کلسترول (Cholesterol) و مسیر سیکلوآرتنول (Cycloartenol) و حدواسط سیتواسترول (Cytosterol) پیشنهاد شده است. سیکلوآرتنول سنتاز (Cycloartenol synthase) و لانوسترول سنتاز  ،(Lanosterol synthase) دو آنزیم کلیدی متعلق به خانواده­ی اکسیدواسکوالن سیکلازها (Oxidosqualene cyclase) هستند و در این مسیر دخالت دارند (Chaudhary et al., 2015). شناسایی مسیر بیوسنتزی دایوسجنین و ژن­های مهم این مسیر، در مهندسی این متابولیت حیاتی به­نظر می‌رسد؛ مسیر بیوسنتز دایوسجنین دارای پیچیدگی‌های زیادی است (شکل 1) (et al., 2019 Zhou).

کاربرد گیاهان به­عنوان دارو، از گذشته­های دور رایج بوده ­است. تمایل انسان به استفاده از گیاهان دارویی به­دلیل عوارض کمتر آن نسبت به داروهای شیمیایی، امری اجتناب­ناپذیر محسوب می‌شود. با توجه به نیاز روزافزون صنایع دارویی، غذایی، آرایشی و بهداشتی به گیاهان دارویی به‌عنوان مواد اولیه تولیدات صنایع مذکور، کشت گیاهان دارویی در دنیا در حال گسترش است  (Kooti et al., 20017). با توجه به این‌که گیاهان قادر به جابجایی نیستند، بنابراین توانایی تطابق با محیط و سازگاری به خوبی در آن­ها نهادینه شده است. توانایی سنتز انواعی از ترکیبات شیمیایی تحت عنوان متابولیت­های ثانویه، از جمله پاسخ­های تطبیقی گیاهان به تنش­های محیطی محسوب می شود. این ترکیبات بخشی از ساختمان مولکولی پایه سلول محسوب نمی­شوند و در مقادیر بسیار اندکی در بافت­ها، اندام­های خاص یا در مراحل خاصی از رشد تولید می­شوند (Chaudhary et al., 2018). بیشتر متابولیت‌های ثانویه­ از اهمیت دارویی برخوردار هستند، زیرا سنتز شیمیایی آن‌ها از لحاظ اقتصادی مقرون به صرفه نیست (Oksman and Inze, 2004). این ترکیبات همچنین از گیاهان در برابر آسیب جانوران (مانند حشرات) جلوگیری می­کنند و یا ممکن است منجر به بروز اختلالات باروری در جانور تغذیه کننده شوند. متابویت­های ثانویه، کمتر از یک درصد وزن خشک گیاه را تشکیل می­دهند و تولید آن­ها به میزان قابل توجهی به مراحل رشدی و فیزیولوژیک گیاه وابسته استOksman et al., 2004) ). گیاهان دارویی با انتقال از محیط زندگی خود (محیط بومی) به محیط زراعی، تحت تاثیر قرار می­گیرند و میزان متابولیت ثانویه در آن­ها کاهش می‌یابد (Bourgaud et al., 2001). امروزه روش­های مختلفی برای افزایش کیفیت و کمیت متابولیت­های ثانویه در گیاهان عالی مورد استفاده قرار می­گیرد. کاربرد محرک­هایی از قبیل انواع تنش­های غیرزیستی، هورمون­ها، اشعه، پلاسمای سرد و نانوذرات، از جمله مهم‌ترین این موارد محسوب می­شوندSheikhi et al., 2019; Babaei et al., 2020; Ebrahimibasabi et al., 2020) ).

شکل 1- تصویر شماتیک از مسیر بیوسنتز دایوسجنین و برخی از ژن­های دخیل در این مسیر (Zhou et al., 2019)

Figure 1. Schematic image of the diosgen biosynthesis pathway and some genes involved in this pathway

ملاتونین (N-استیل-5-متوکسی تریپتامین) یک آنتی­اکسیدان طبیعی است، که در همه­ موجودات زنده از باکتری تا گیاهان و حیوانات یافت می­شود. ملاتونین گیاهی برای اولین بار در سال 1995 در گونه­های مختلف گیاهی و در اندام­های مختلف مانند ریشه، ساقه، برگ، میوه­ها و دانه­ها شناسایی شد (Dubbels et al., 1995). اثرات مثبت ملاتونین در کاهش استرس­های غیرزیستی و تنظیم­ رشد در گیاهان به اثبات رسیده است. ملاتونین در گیاهان به­صورت گسترده در تنظیم گلدهی، جوانه­زنی بذر، رشد و نمو، فتوسنتز و تحریک پاسخ دفاع آنتی­اکسیدانی نقش دارد. ظرفیت آنتی­اکسیدانی بالاتر ملاتونین نسبت به سایر آنتی­اکسیدان­های غیرآنزیمی از قبیل آسکوربات (Ascorbate) و توکوفرول­ها (Tocopherol)، احتمالا با توانایی ملاتونین برای انتقال کارآمد از طریق محفظه­های مختلف سلول مرتبط است (Martinez et al., 2018).

در یک پژوهش، اثر ملاتونین بر افزایش مقاومت خیار تحت تاثیر تنش شوری بررسی شد. نتایج آن­ها نشان داد که ملاتونین منجر به افزایش فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانی و مهار گونه­های فعال اکسیژن می‌شود. در ضمن، ملاتونین، محتوای مالون دی­آلدئید و نشت الکترولیت در گیاهان تیمار شده با تنش شوری را کاهش داد. همچنین کابرد ملاتونین منجر به افزایش قابل توجه تظاهر ژن آنزیم­های آنتی­اکسیدانی، ژن­های پروتئین کیناز (MAPK, MAPK 3, MAPK4 , MAPK 6[3]) و ژن­های SOS[4] (SOS1 , SOS2 , SOS3) شد.  (Zhang et al., 2020)

با توجه به اهمیت دایوسجنین در شنبلیله به­عنوان یک متابولیت ارزشمند، استفاده از محرک‌های مختلف به­منظور افزایش تظاهر ژن‌های مسیر بیوسنتز دایوسجنین و متعاقبا محتوی دایوسجنین ارزشمند به­نظر می‌رسد؛ بنابراین این تحقیق با هدف بررسی اثرات ملاتونین و تنش شوری (به­عنوان دو محرک عملکردی) بر افزایش تظاهر برخی از ژن­های دخیل در مسیر بیوسنتز دایوسجنین انجام شد. نتایج حاصل از این تحقیق می­تواند در برنامه­های به­نژادی و مهندسی مسیر دایوسجنین در بیوتکنوژی و اصلاح نباتات مورد استفاده قرار گیرد.

مواد و روش­ها

شرایط کشت و اعمال تیمار

بذرهای شنبلیله توده بومی بوشرویه از سازمان جهاد کشاورزی استان اصفهان تهیه شد. با توجه به مطالعات قبلی، این توده دارای بالاترین محتوی دایوسجنین در بین نه توده دیگر بود؛ بنابراین به عنوان یک کاندید مناسب برای این پژوهش انتخاب شد. تیمارهای این آزمایش شامل سطوح مختلف شوری (صفر، 150 و 300 میلی­مولار) و هورمون ملاتونین (صفر، 30، 60 و 90(ppm  بود. در ضمن گیاهان شاهد نیز با آب فاقد ملاتونین و نمک آبیاری ­شدند. ملاتونین مورد استفاده در این پژوهش از شرکت سیگما (EC number: 200-797-7, CAS number: 73-31-4) خریداری شد. ملاتونین ابتدا با غلظت ppm 1000 به عنوان محلول ذخیره مادری آماده و در دمای چهار درجه سانتی­گراد نگهداری شد. سایر غلطت­های مورد نظر با استفاده از محلول مادری تهیه شدند. 

با توجه به ماهیت تیمارهای آزمایش، این پژوهش به­صورت فاکتوریل و در قالب طرح کاملا تصادفی با سه تکرار انجام شد. برای این منظور، ابتدا بذرهای گیاه شنبلیله ضدعفونی و در گلدان­های 20^×25^×30 سانتی­متری با ترکیب پیت ماس، پرلیت و شن با نسبت برابر، در اتاقک رشد با دمای 23 درجه سانتی‌گراد و دوره نوری 16 ساعت روشنایی و هشت ساعت تاریکی و رطوبت 55 درصد کشت شدند. پس از اطمینان از استقرار گیاهچه­ها در مرحله سه برگی (هفت روزه­گی)، ملاتونین به­ مدت دو هفته با غلظت­های مختلف، همراه با آب آبیاری به گلدان­ها اضافه شد و سپس تیمار شوری در مرحله شش برگی (سه هفتگی) و به مدت دو هفته اعمال شد. در نهایت در مرحله آغاز گلدهی (پنج هفتگی)، نمونه­های برگی جمع­آوری و به­منظور بررسی تظاهر ژن در فریزر 80- درجه سانتی­گراد ذخیره شدند .(Varghese et al., 2019; ElSayed et al., 2020) کلرید سدیم مورد استفاده در این تحقیق، از شرکت مرک (CAS number: 7647-14-5; EC number: 231-598-3) خریداری شد.

استخراج RNA و ساخت cDNA

استخراج RNA با استفاده از کیت RNX Plus (شرکت سیناکلون) و با توجه به دستورالعمل شرکت سازنده انجام شد. به­منظور حذف آلودگی­های DNA، یک میکروگرم از RNA استخراج شده با I DNAse (شرکت  (Thermo Fisherتیمار شد. در ضمن کیفیت و کمیت RNA با استفاده از ژل آگارز یک درصد و دستگاه نانودراپ تعیین شد. به­منظور ساخت cDNA، از آغازگر Oligo (dT) برای اتصال به دم پلی­آدنین mRNA استفاده شد. ساخت  cDNAدر حجم 20 میکرولیتر و با استفاده از  کیت HyperScript Reverse transcriptase (GeneALL) بر طبق به دستورالعمل شرکت سازنده انجام شد.

طراحی آغازگرها

آغازگرها (جدول 1) با استفاده از برنامه آنلاین Primer 3 Plus طراحی شدند و به­منظور کنترل صحت آن­ها، از برنامه Analyzer v.3.1 (http://eu.idtdna.com/calc/analyzer) Oligo استفاده شد. در این برنامه (Oligo Analyzer)، پارامترهایی شامل دمای اتصال، درصد بازهای C/G،  احتمال تشکیل ساختارهای سنجاق سر و دایمر و همچنین امکان تشابه با سایر ژن­های نزدیک بررسی شد؛ این ژن­ها با توجه به تحقیقات گذشته محققین این پژوهش انتخاب شدند. در مطالعات گذشته محققین این پژوهش، برخی از ژن­های مسیر بیوسنتز دایوسجنین با روش طراحی آغازگرهای دژنره[5] شناسایی و جداسازی شدند و رابطه بین میزان تظاهر این ژن­ها و محتوای دایوسجنین در نه توده بومی شنبلیله با محتوای دایوسجنین متفاوت بررسی شد و شمایی کلی از مسیر بیوسنتز دایوسجنین در شنبلیله ارایه شد (Mohammadi et al., 2019). در ضمن در مطالعات گذشته محققین این پژوهش، عکس­العمل این ژن­ها نسبت به تنش گرما، براسینواستروئید، دی­اکسیدتیتانیوم و پلاسمای سرد ارزیابی شد؛ بنابراین با توجه به نتایج این پژوهش­ها، ژن­های کاندید برای این تحقیق انتخاب شدند Sheikhi et al., 2019; Ebrahimibasabi et al., 2020; Babaei et al., 2020)).

واکنش  PCR زمان واقعی

برای واکنش PCR زمان واقعی، از مستر شرکت SYBR®Green PCR Master Mix 2X (Ampliqon) استفاده شد. واکنش­ها در حجم 10 میکرولیتر و با سه تکرار بیولوژیکی انجام شدند. واکنش PCR زمان واقعی، با استفاده از دستگاه ABI Step one و مطابق با ترکیبات جدول 2 انجام شد. در ضمن به­منظور اطمینان از عدم آلودگی نمونه­ها، از کنترل منفی در تمامی مراحل آزمایش استفاده شد.

جدول 1- آغازگرهای مورد استفاده در این تحقیق و مشخصات آن­ها

Table 1. The primers used in this study and their characteristics

این واکنش با شرایط دمایی و زمانی 10 دقیقه در دمای 95 درجه سانتی‌گراد و 35 تکرار با چرخه‌های20 ثانیه­ای در دمای 95 درجه سانتی‌گراد و 20 ثانیه در دمای 60 درجه سانتی‌گراد انجام شد.

تجزیه داده­های PCR زمان واقعی

قبل از آنالیز داده­های تظاهر ژن­های مورد نظر در این تحقیق، از آنالیز منحنی ذوب و تکثیر به‌منظور تایید صحت داده­ها استفاده شد. به­منظور تجزیه داده­های  PCRزمان واقعی، تظاهر نسبی هر ژن بر اساس روش منحنی استاندارد نسبی[6] بر پایه فرمول 2^-ΔΔCt  (Livak and Schmittgen, 2001) محاسبه شد که مطابق آن، میزان ژن (cDNA حاصل از رونوشت)، برابر با دو به توان منفی تفاوت آستانه سیکل ژن هدف تحت تنش و ژن مرجع متناظر آن منهای تفاوت میانگین­های آستانه سیکل ژن هدف بدون تنش و ژن مرجع متناظر آن است. مقایسه میانگین­ها با استفاده از برنامه R به روش روش دانکن و در سطح احتمال یک درصد انجام شد.

نتایج و بحث

تظاهر ژن (CAS)  Cycloartenol synthase

اثرات اصلی سطوح مختلف تنش شوری، ملاتونین و اثرات متقابل آن­ها بر تظاهر همه ژن­های بررسی شده در این تحقیق معنی­دار بود (جدول 3، 4). به‌منظور مقایسه اثرات متقابل سطوح مختلف تنش شوری و ملاتونین، از مقایسه میانگین با روش دانکن در سطح احتمال یک درصد استفاده شد. تظاهر ژن CAS تحت تاثیر سطح 150میلی­مولار شوری (بدون کاربرد ملاتونین)، اختلاف معنی­داری با شرایط شاهد (بدون اعمال تنش شوری و ملاتونین) نداشت، درحالی­که در سطح 300 میلی­مولار، به‌‌صورت معنی­دار افزایش یافت. افزایش میزان تظاهر این ژن تحت تاثیر سطوح مختلف ملاتونین در تیمار شاهد کاملا افزایشی بود، به­طوری­که تظاهر این ژن در تیمار ppm90 ملاتونین نسبت به شاهد و بدون کاربرد ملاتونین، به‌صورت معنی­داری (سه برابر) افزایش یافت.

جدول 2- ترکیبات مورد استفاده در واکنش PCR زمان واقعی

Table 2. The compounds used in real-time PCR reaction

تحت شرایط تنش شوری 150 میلی­مولار و ترکیب با ملاتونین 60 ppm، میزان تظاهر این ژن نسبت به تیمار شاهد هفت برابر افزایش یافت. تظاهر ژن CAS در تیمار300 میلی­مولار و ترکیب با سطوح مختلف ملاتونین نسبت به تیمار 150 میلی­مولار، به­صورت معنی­داری کاهش یافت (شکل A1). تظاهر این ژن در تیمار شوری 150 میلی­مولار و ترکیب با سطوح ppm60 و 30 ملاتونین نسبت به سایر تیمارها بیشتر بود؛ بنابراین به نظر می­رسد که این تیمار دارای پتانسیل مناسبی جهت افزایش تظاهر این ژن است.

جدول 3- تجزیه واریانس اثرات سطوح مختلف شوری و ملاتونین بر تظاهر ژن­های بررسی شده در این تحقیق

Table 3 .Variance analysis of the effects of different levels of salinity and melatonin on the expression of the genes investigaed in this study

جدول 4- مقایسه میانگین اثرات اصلی سطوح مختلف شوری و ملاتونین بر تظاهر ژن­های بررسی شده در این تحقق

Table 4. Mean comparison of the main effects of different levels of salinity and melatonin on the expression of the genes investigated in this study

*میانگین های دارای حروف مشابه در هر ستون­ها، دارای اختلاف معنی داری با یکدیگر نیستند.

*Means with the same letters in the same columns are not significantly different.

تظاهر ژن C22‐hydroxylase

در مجموع میزان تظاهر این ژن در همه تیمارهای آزمایشی پایین بود. در حقیقت کاربرد سطوح مختلف شوری و ترکیب با ملاتونین در تمامی تیمارهای آزمایشی منجر به کاهش تظاهر این ژن نسبت به تیمار شاهد شد. تظاهر ژن C22‐hydroxylase فقط در تیمار شوری 150 میلی­مولار و ترکیب با ppm60 ملاتونین نسبت به تیمار شاهد افزایش یافت (شکل B1). تظاهر این ژن در تیمار شوری 300 میلی­مولار و ترکیب با ppm30 ملاتونین به پایین­ترین میزان خورد رسید، در حالی­که این ژن بیشترین تظاهر را در تیمار شوری 150 میلی­مولار و ترکیب با ppm30 ملاتونین به خود اختصاص داد.

تظاهر ژن Δ7- reductase

تظاهر این ژن نیز مشابه ژن C22‐hydroxylase تحت تاثیر تیمارهای آزمایشی کم بود. در حقیقت تمامی تیمارهای آزمایشی منجر به کاهش تظاهر این ژن نسبت به شرایط شاهد شدند. تظاهر C22‐hydroxylase، تحت تاثیر تنش شوری (هر دو سطح) و بدون کاربرد ملاتونین نسبت به شرایط شاهد کاهش یافت. بالاترین میزان تظاهر این ژن در تیمار شوری 300 میلی­مولار و ملاتونین ppm 90 به میزان 13/1 برابر تیمار شاهد ثبت شد (شکل A2). پایین­ترین میزان تظاهر ژن مذکور در تیمار شوری 150 میلی­مولار و ترکیب با ملاتونین ppm 30 مشاهده شد.

تظاهر ژن(BGL)   26-o-Beta glucosidase

تظاهر ژن (BGL) تحت تاثیر تنش شوری و بدون کاربرد ملاتونین نسبت به شرایط شاهد به­صورت معنی­داری افزایش یافت. همچنین تظاهر این ژن در شرایط شاهد (بدون تنش شوری) و صرفا با کاربرد سطوح مختلف ملاتونین به میزان 5/4 برابر (در سطح  ppm60 ملاتونین) افزایش یافت. بیشترین تظاهر این ژن در تیمار تنش شوری 150 میلی­مولار و ترکیب با سطح  ppm60  ملاتونین به میزان پنج برابر نسبت به شرایط شاهد ثبت شد. کاربرد سطوح مختلف ملاتونین همراه با تنش شوری 300 میلی­مولار نیز به­صورت معنی­داری منجر به افزایش تظاهر این ژن نسبت به شرایط شاهد شد (شکل B2(. نتایج نشان داد که اثرات متقابل تنش شوری همراه با سطوح مختلف ملاتونین، به‌عنوان یک محرک مناسب تظاهر این ژن را افزایش می­دهد. با افزایش شدت تنش شوری از 150 به 300 میلی­مولار (در غلظت ppm60)، میزان تظاهر این ژن کاهش یافت. در حقیقت افزایش تنش شوری (از 150 به 300 میلی­مولار) و افزایش غلظت ملاتونین (از ppm60 به ppm90)، منجر به کاهش تظاهر این ژن نسبت به تنش شوری 150 میلی­مولار شد.

تظاهر ژن C4‐demethylase

اثرات متقابل سطوح مختلف تنش شوری و ملاتونین منجر به افزایش معنی­داری در میزان تظاهر این ژن نسبت به تیمار شاهد شد و تظاهر این ژن در شرایط بدون تنش شوری همراه با سطوح مختلف ملاتونین، به­صورت معنی­داری افزایش یافت. همچنین میزان تظاهر این ژن در سطوح 150 و 300 میلی­مولار تنش شوری و ترکیب با سطح ppm60 از ملاتونین نسبت به تیمار شاهد به‌ترتیب چهار و 2/5 برابر افزایش یافت (شکل C2). بالاترین میزان تظاهر این ژن در تنش شوری 300 میلی­مولار (همرا با ملاتونین ppm60) ثبت شد. افزایش شدت تنش شوری از 150 به 300 میلی­مولار (همراه با ملاتوینن ppm60) به‌صورت معنی­داری منجر به افزایش تظاهر این ژن شد.  در حقیقت تظاهر این ژن نسبت به شاهد، تحت تاثیر تمامی تیمارهای آزمایشی به‌صورت معنی­داری افزایش یافت.

در این پژوهش پروفایل تظاهر برخی از ژن­های دخیل در مسیر بیوسنتز دایوسجنین تحت شرایط تنش شوری در گیاهان تیمار شده با سطوح مختلف ملاتونین بررسی شد. در تحقیق حاضر، تظاهر ژن CAS تحت شرایط تنش شوری 150 میلی­مولار و همرا با ملاتونین ppm60 نسبت به تیمار شاهد، هفت برابر افزایش یافت (شکل A1). از آن‌جا که ضرورت فعالیت این ژن در این مسیر بیوسنتزی به خوبی اثبات شده است، پاسخ افزایشی آن نسبت به اثرات متقابل تنش شوری و ملاتونین، نوید­بخش شناسایی یک محرک کاربردی مناسب برای افزایش محتوی دایوسجنین در شنبلیله است. با توجه به ابهامات این مسیر بیوسنتزی مهم، شناسایی آن و ژن­های مهم این مسیر در مهندسی دایوسجنین به­عنوان یک متابولیت بسیار ارزشمند حیاتی به­نظر می‌رسد. در یک بررسی، برخی از ژن­های مسیر بیوسنتز دایوسجنین شناسایی و جداسازی شدند و رابطه بین میزان تظاهر این ژن­ها و محتوی دایوسجنین در نه توده شنبلیله با محتوی دایوسجنین متفاوت بررسی شد و شمایی کلی از مسیر بیوسنتز دایوسجنین در شنبلیله ارائه شد (Mohammadi et al., 2019).

سه مرحله اکسیداسیون در موقعیت کربن­های شماره  C22، C16 و C26 در ساختار کلسترول به­منظور تبدیل کلسترول به ترکیبات پایین­دستی ضروری می‌باشد. ژن‌هایC22-hydroxylase  و C26-hydroxylase به­ترتیب طی مراحل مختلفی منجر به اکسیداسیون (اضافه شدن گروه OH) کلسترول می‌شوند (Eich, 2008). به عبارت دیگر، برای سنتز دایوسجنین، کلسترول به­عنوان ماده حد واسط، ابتدا توسط ژن‌های خانواده [7]CYP72A هیدروکسیله می‌شود که این هیدروکسیله شدن، ابتدا در موقعیت کربن 22 و سپس کربن 26، مسیر را به سمت سنتز دایوسجنین هدایت می­کند. در این تحقیق، تظاهر این ژن تنها در تیمار شوری 150 میلی­مولار و ppm60 ملاتونین نسبت به تیمار شاهد افزایش یافت (شکل B1). نتایج یک پژوهش نشان داد که خاموش شدن C22-hydroxylase در سیب­زمینی، منجر به کاهش قابل توجهی در میزان ترکیبات پایین­دستی و تجمع کلسترول خواهد شد، در­حالی­که خاموش کردن C26-hydroxylase در تجمع کلسترول موثر نبود (Umemoto et al., 2016). در یک پژوهش، ژن‌های C22-hydroxylase و C26-hydroxylase در گوجه‌فرنگی و سیب‌زمینی شناسایی و همچنین نقش C16-hydroxylase در آن­ها بررسی و مشخص شد که هر سه ژن در بیوسنتز استرول گلیکوآلکالوئیدها (Glycoalkaloid) ضروری هستند (McAdam et al., 2017). بررسی تظاهر ژن‌های دخیل در مسیر بیوسنتز دایوسجنین تحت تاثیر کلسترول، اسکوالن و متیل جاسمونات نشان داد که تظاهر ژن‌های  C22- hydroxylase و C26-hydroxylase نسبت به تیمار کلسترول، به­صورت معنی­داری افزایش می­یابد که احتمالا بیانگر نقش این ژن­ها در مسیر بیوسنتزی دایوسجنین از طریق کلسترول می­باشد (Ciura et al., 2017; Ciura et al., 2018).

نقش ژن‌های C4-demethylase و ∆7-reductase با استفاده از داده‌های حاصل از RNA-seq در مسیر بیوسنتز کلسترول که حد واسط سنتز دایوسجنین است، به اثبات رسیده است. آنزیم 7-reductase∆ با شکستن یک پیوند دوگانه در موقعیت D-7، منجر به تشکیل کلسترول می‌شود (Ciura et al., 2017). در حقیقت این ژن با شکستن پیوند دوگانه در موقعیت کربن شماره هفت، آخرین مرحله از بیوسنتز کلسترول را کاتالیز می‌کند. نتایج تحقیق حاضر نشان داد که تظاهر ژن ∆7-reductase تحت تاثیر سطوح مختلف تنش شوری و ملاتونین اندک بود (شکل A2). در یک تحقیقet al.  Ciura (2017) تظاهر این ژن را تحت تاثیر کلسترول، اسکوالن و متیل جاسمونات (Methyl jasmonate) در شنبلیله بررسی کردند. نتایج آن­ها نشان داد که تظاهر این ژن نسبت به تیمار کلسترول، بیشترین افزایش را به خود اختصاص داد که احتمالا نشان­دهنده نقش این ژن در مسیر بیوسنتز کلسترول می­باشد. نتایج این محققان با نتایج حاصل از این تحقیق هم­خوانی ندارد که این عدم تطابق احتمالا به­علت تفاوت در پاسخ­دهی ژن­ها نسبت به تیمارهای (محرک) مختلف است. این عدم هم­خوانی، ضرورت انجام تحقیقات بیشتر را با هدف شناسایی بهترین تیمار و مناسب­ترین غلظت یا سطح از آن را به اثبات می­­رساند.

ژن 26-o-Beta glucosidase (BGL) با حذف گلوکز در موقعیت کربن 26 در مرحله پایانی تبدیل کلسترول به دایوسجنین، باعث سنتز دایوسجنین می‌شود. در یک تحقیق، تظاهر ژن 26-o-beta glucosidase تحت تاثیر سه تیمار کلسترول، اسکوالن و متیل جاسمونات بررسی شد. در این پژوهش تظاهر ژن 26-o-beta glucosidase در پاسخ  به تیمار کلسترول نسبت به سایر تیمارها به‌صورت معنی­داری افزایش یافت (Ciura et al., 2017; Ciura et al., 2018). نتایج تحقیق حاضر نشان داد که تظاهر این ژن، صرفا با کاربرد سطوح مختلف ملاتونین نسبت به شرایط شاهد به میزان 5/4 برابر (در سطح ppm 60 ملاتونین) افزایش یافت و کاربرد سطوح مختلف ملاتونین همراه با تنش شوری 300 میلی­مولار نیز به­صورت معنی­داری منجر به افزایش تظاهر این ژن نسبت به شرایط شاهد شد  (شکل B2).

آنزیم C4 demethylase منجر به حذف گروه متیل از کربن شماره چهار در حلقه استرول می‌شود. تحقیقات بسیار اندکی بر روی این آنزیم در گیاهان انجام شده است (Lepesheva and Waterman, 2007)، درحالی­که این ژن یکی از ژن­های مهم مسیر بیوسنتز دایوسجنین محسوب می‌شود. نتایج این پژوهش نشان داد که تظاهر این ژن در سطوح 150 و 300 میلی­مولار تنش شوری و سطح ppm60 از ملاتونین نسبت به تیمار شاهد به‌ترتیب چهار و 2/5 برابر افزایش یافت. با توجه به نقش مهم این آنزیم در هدایت این مسیر به سمت تولید دایوسجنین و پاسخ مناسب این ژن به محرک­های مورد استفاده در این تحقیق، به­نظر می­رسد که این ژن، کاندید مناسبی برای مهندسی کردن مسیر بیوسنتز دایوسجنین باشد (شکل C2(.

نتایج تحقیق حاضر نشان داد که ملاتونین و تنش شوری به­عنوان تحریک­کننده­های عملکردی، تظاهر ژن­های دخیل در مسیر دایوسجنین را افزایش می­دهند. ملاتونین بر ترکیب اسیدهای آمینه و کربوهیدرات­های گیاهان در شرایط شوری تاثیر می­گذارد و با افزایش مقدار قند قابل احیا، سبب افزایش سنتز ترکیبات ثانویه و مقاومت گیاه در برابر تنش شوری می­شود (Tavarini et al., 2008; Thomas, 2013). ترکیبات ایندولی از جمله ملاتونین، با تاثیر بر فرآیندهایی مانند فتوسنتز، تنفس، جذب یون، نفوذپذیری غشا، فعالیت آنزیم­ها و هورمون­ها و میزان رشد را تحت تأثیر قرار می­دهند (Zheng et al., 2013). در حقیقت، ملاتونین به­عنوان یکی از اولین سدهای دفاعی از گیاه در برابر شرایط نامساعد محیطی، به­عنوان یک آنتی­اکسیدان قوی محافظت می­کند و از این طریق سبب حفظ محتوی کلروفیل و کاروتنوئیدها می­شود (Dole and Wilkins, 1999). ملاتونین از طریق افزایش سنتز درونی پلی­آمین­های اسپرمیدین (Spermidine) و اسپرمین (Spermine) از طریق تحریک تظاهر ژن­های سنتزکننده آرژنین دکربوکسیلاز (Arginine Decarboxylase) و اورنیتین دکربوکسیلاز (Ornitine Decarboxylase) و تجمع بیشتر _γ بوتیریک اسید (γ-butyric acid) به واسطه تحریک تظاهر ژن­های سنتزکننده گلوتامات دکربوکسیلاز (Gelotamate Decarboxylase) و پلی­آمین اکسیداز (Polyamine oxidase) و افزایش تجمع بیشتر پرولین از طریق افزایش تظاهر ژن­های سنتزکننده پرولین - 5-کربوکسیلات سینتاز (Proline - 5-carboxylate synthase) و اورنیتین آمینوترانسفراز (Ornithine aminotransferase) و کاهش تظاهر ژن سنتزکننده پرولین دهیدروژناز (Proline Dehydrogenase)، منجر به افزایش مقاومت نسبت به تنش شوری می‌شود (Cao et al., 2016).

شکل 1- مقایسه میانگین اثرات دوگانه ‌تنش شوری و غلظت­های مختلف ملاتونین بر تظاهر ژن­های A)CAS  و B) C22‐hydroxylase. ستون­های دارای حروف مشابه، اختلاف معنی­داری با روش دانکن و در سطح احتمال یک درصد با یکدیگر ندارند. تظاهر تمامی تیمارها با توجه به روش 2^-ΔΔCT نسبت به تیمار شاهد نرمال شده­اند.

Figure 1. Mean comparison of the reciprocal effectsof salinity and melatonin concentration on A) CAS and B) C22‐hydroxylase expression. Columns with the same letters are not significantly different based on Duncan test at 1% of probability level. Expression of all treatments was normalized compared to control based on 2^-ΔΔCT formula.

شکل 2- مقایسه میانگین اثرات دوگانه ‌تنش شوری و غلظت­های مختلف ملاتونین بر تظاهر ژن­های A(A Δ7- reductase، (B BGL  و C) C4‐demethylase. ستون­های دارای حروف مشابه، اختلاف معنی­داری با روش دانکن و در سطح احتمال یک درصد با یکدیگر ندارند. تظاهر تمامی تیمارها با توجه به روش 2^-ΔΔCT نسبت به تیمار شاهد نرمال شده­اند.

Figure 2. Mean comparison of the reciprocal effectsof salinity and melatonin concentration on A) Δ7- reductase, B) BGL and C) C4‐demethylase. Columns with the same letters are not significantly different based on Duncan test at 1% of probability level. Expression of all treatments was normalized compared to control based on 2^-ΔΔCT formula.

در این پژوهش، کاربرد سطوح مختلف ملاتونین به­صورت معنی­داری منجر به افزایش تظاهر برخی از ژن­های دخیل در مسیر بیوسنتز دایوسجنین در گیاهان تیمار نشده و تیمار شده با سطوح مختلف تنش شوری شد. با توجه به نقش دفاعی متابولیت­های ثانویه در تنش­های زیستی و غیرزیستی، این افزایش تظاهر که با هدف افزایش محتوی متابولیت ثانویه به­منظور افزایش تحمل گیاه صورت گرفته است، منطقی به­نظر می­رسد. متابولیت­های ثانویه در پاسخ به محرک­­ها، پس از مجموعه­ای از واکنش­های فسفوریلاسیون و دفسفوریلاسیون پروتئین­های غشای سلول، شکل­گیری جریان­ کلسیمی، فعال شدن پروتئین کینازها و  NADPH اکسیدازها، تولید گونه­های فعال اکسیژن و در نهایت تظاهر ژن­های دفاعی در سلول­های گیاهی کنترل می­شود
 .(Jacobo-Velázquez el al., 2015)

ژن­های بررسی شده در این تحقیق، با توجه به پروفایل تظاهرشان، به سه گروه مختلف تقسیم می­شوند؛ گروه اول شامل ژن­های C22‐hydroxylase و Δ7- reductase، که عکس­العمل اندکی نسبت به تیمارهای آزمایش از خود نشان دادند (تظاهر آن­ها در برخی از تیمارها نسبت به شرایط شاهد کاهش یافت)، گروه دوم شامل ژن­ها BGL و CAS، که تظاهرشان در تیمار شوری 150 میلی­مولار (تنش ملایم) و ترکیب با ppm60 (غلظت متوسط) به‌صورت کاملا معنی­داری نسبت به سایر تیمارها افزایش یافت و در گروه سوم، ژن C4‐demethylase قرار دارد، زیرا تظاهر این ژن در تنش شوری 300 میلی­مولار و ترکیب با ppm60 ملاتونین به‌صورت کاملا معنی­داری نسبت به سایر تیمارها افزایش یافت.

نتیجه­گیری کلی

نتایج متناقضی در مورد استفاده از محرک­های مختلف و تغییرات محتوی متابولیت­های ثانویه وجود دارد؛ این بدین معنی است که گیاهان مختلف پاسخ­های متفاوتی نسبت به محرک­ها از خود نشان می­دهند. پاسخ گیاهان با توجه به مدت زمان در معرض بودن محرک، مرحله رشدی و غلظت­های مختلف محرک­ها بسیار متفاوت است؛ بنابراین شناسایی بهترین محرک، حساس­ترین مرحله رشدی گیاه و مناسب­ترین غلظت محرک­ها، از فاکتورهای موثر در افزایش کمیت و کیفیت متابولیت­های ثانویه گیاهی محسوب می­شوند. نتایج این پژوهش نشان داد که کاربرد ملاتونین، تیمار شوری و یا اثرات متقابل آن­ها به­صورت موثری منجر به افزایش تظاهر برخی از ژن­های دخیل در مسیر بیوسنتز دایوسجنین می‌شود. نتایج حاصل از این تحقیق در مهندسی مسیر بیوسنتز دایوسجنین به­منظور دست­ورزی ژن­ها و افزایش تظاهر آن­ها با هدف تولید بیشتر این متابولیت ارزشمند موثر خواهد بود.

REFERENCES

1. Babaei, M. J., Heidari, P. & Ebragimi, A. (2020). The effects of TiO2 nanoparticles on physiological and molecular properties of fenugreek (Trigonella foenum-graecum L.) under cold stress. M.sc. Thesis. Faculty of Agriculture. Shahrood University of Technology, Iran.
2. Bourgaud, F., Gravot, A., Milesi, S. & Gontier, E. (2001). Production of plant secondary metabolites: a historical perspective. Plant Science, 161, 839-851.
3. Cao, S., Song, C., Shao, J., Bian, , Chen, W. & Yang, Z. (2016). Exogenous melatonin treatment increases chilling tolerance and induces defence response in harvested peach fruit during cold storage. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 64(25), 5222-5215.
4. Chaudhary, S., Chaudhary, P. S., Chikara, S. K., Sharma, M. C. & Iriti, M. (2018). Review on fenugreek (Trigonella foenum-graecum) and its important secondary metabolite diosgenin. Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj-Napoca,46(1), 22-31.
5. Chaudhary, S., Chikara, S. K., Sharma, M. C., Chaudhary, A., Alam Syed, B., Chaudhary, P. S., Mehta, A., Patel, M., Ghosh, A. & Iriti, M. (2015). Elicitation of diosgenin production in Trigonella foenum-graecum (fenugreek) seedlings by methyl jasmonate. International Journal of Molecular Sciences, 16(12), 29889-29899.
6. Ciura, J., Bocian, A., Kononiuk, A., Szeliga, M., Jaromin, M. & Tyrka, M. (2017). Proteomic signature of fenugreek treated by methyl jasmonate and cholesterol. Acta Physiologiae Plantarum, 39(5), 112.
7. Ciura, J., Szeliga, M., Grzesik, M. & Tyrka, M. (2018). Changes in fenugreek transcriptome induced by methyl jasmonate and steroid precursors revealed by RNA-Seq. Genomics, 110(4), 267-276.
8. Dini, M. (2006). Scientific Name of Medicinal Plants Used in Traditional Medicine. (pp. 299-300.) Forest and Rangeland Research Institute Publication.
9. Dole, J. M. & Wilkins, F. H. (1999). Floriculture: Principles and Species. (pp. 356–360.) Prentice Hall, Upper Saddle River, New Jersey.
10. Dubbels, R., Reiter, R. J. & Klenke, E. (1995). Melatonin in edible plants identified by radio immunoassay and by high performance liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Pineal Research, 18, 28–31.
11. Ebrahimibasabi, E., Ebrahimi, A., Momeni, M. & Reza Amerian, M. (2020). Elevated expression of diosgenin-related genes and stimulation of the defense system in Trigonella foenum-graecum (fenugreek) by cold plasma treatment. Scientia Horticulturae, 271, 109494.
12. Eich, E. 2008. Solanaceae and Convolvulaceae: Secondary metabolites: Biosynthesis, chemotaxonomy, biological and economic significance (a handbook). Springer Science & Business Media.
13. ElSayed, A. I., Boulila, M., Rafudeen, M. S., Mohamed, A. H., Sengupta, S., Rady, M. & Omar, A. A. (2020). Melatonin regulatory mechanisms and phylogenetic analyses of melatonin biosynthesis related genes extracted from peanut under salinity stress. Plants, 9(7), 854.
14. Farhoudi, R., Modhej, A. & Afrouz, A. (2015). Effect of salt stress on physiological and morpholparameters of rapeseed cultivars. Journal of Scientific Research and Development, 2 (5), 111-117.
15. Feng, Z. T., Deng, Y. Q., Zhang, S. C., Liang, X., Yuan, F., Hao, J. L., Zhang, J. C., Sun, S. F. & Wang, B. S. (2015). K(⁺) accumulation in the cytoplasm and nucleus of the salt gland cells of Limonium bicolor accompanies increased rates of salt secretion under NaCl treatment using NanoSIMS. Plant Science, 238, 286–296.
16. Guo, J. R., Li, Y. D., Han, G., Song, J. & Wang, B.S. (2018). NaCl markedly improved the reproductive capacity of the euhalophyte Suaeda salsa. Functional Plant Biology, 45, 350–361.
17. Hasanuzzaman, M., Nahar, K. & Fujita, M. (2013). Plant Response to Salt Stress and Role of Exogenous Protectants to Mitigate Salt-Induced Damages. In: Ahmad P, Azooz MM, Prasad MNV (eds.). New York, USA, Springer.
18. Hawrylak-Nowak, B. (2009). Beneficial effects of exogenous selenium in cucumber seedlings subjected to salt stress. Biological Trace Element Research, 132, 259-269.
19. Jacobo-Velázquez, D. A., González-Agüero, M. & Cisneros-Zevallos, L. (2015). Cross-talk between signaling pathways: the link between plant secondary metabolite production and wounding stress response. Scientific Reports, 5, 8608.
20. Kooti, W., Servatyari, K., Behzadifar, M., Asadi-Samani, M., Sadeghi, F., Nouri, B. & Zare Marzouni, H. (2017). Effective medicinal plant in cancer treatment, part 2: review study. Journal of Evidence-Based Complementary & Alternative Medicine, 22(4), 982-995.
21. Lepesheva, G. I. & Waterman, M. R. (2007). Sterol 14α-demethylase cytochrome P450 (CYP51), a P450 in all biological kingdoms. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects, 1770(3), 467-477.
22. Liu, Q. Q., Liu, R. R., Ma, Y. C. & Song, J. (2018). Physiological and molecular evidence for Na⁺ and Cl^- exclusion in the roots of two Suaeda salsa populations. Aquatic Botany, 146, 1–7.
23. Livak, K. J. & Schmittgen, T. D. (2001). Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2^{− ΔΔCT} Methods, 25(4), 402-408.
24. Mandegari, A., Pournamdari, M., Sharififar, F., Pournourmohammadi, S., Fardiar, R. & Sholi, S. (2012). Alkaloid and flavonoid rich fractions of fenugreek seeds (Trigonellafoenum-graecum L.) with antinociceptive and anti- inflammatory effects. Food and Chemical Toxicology, 50, 2503-2507.
25. Martinez, V., Nieves-cordones, M., Lopez-delacalle, M., Rodenas, R., Mestre, T. C., Garcia-sanchez, F., Rubio, F., Nortes, P. A., Mittler, R. & Rivero, R. M. (2018). Tolerance to stress combination in tomato plants: New insights in the protective role of melatonin. Molecules, 23, 535.
26. McAdam, S. A., Eléouët, M. P., Best, M., Brodribb, T. J., Carins, M., Murphy, S. D., Dalmais, M., Dimitriou, T., Gélinas-Marion, A. & Warwick, M. (2017). Linking auxin with photosynthetic rate via leaf venation. Plant Physiology, 175 (1), 351-360.
27. Mohammadi, M., Mashayekh, T., Rashidi‐Monfared, S., Ebrahimi, A. & Abe, D. (2019). New insights into diosgenin biosynthesis pathway and its regulation in Trigonella foenum‐graecum Phytochemical Analysis, 31 (2), 1-13.
28. Mozafarian, V. (1995). Plants Names Dictionary of Iran. (pp.558) Farhang Moaser Publication.
29. Nxele, X., Klein, A. & Ndimba, B. K. (2017). Drought and salinity stress alters ROS accumulation, water retention, and osmolyte content in sorghum plants. South African Journal of Botany, 108, 261–266.
30. Oksman Caldentey, K. M. & Inzé, D. (2004). Plant cell factories in the post-genomic era: new ways to produce designer secondary metabolites. Trends in Plant Science, 9(9), 433-440.
31. Shaha, S., Ebrahimi, A., Heidari, P. & Amerian, M. R. (2019). The study of brassinosteroeid effect on diosgenin biosynthesis in trigonella foenum-graecum L. under high temprature codition. M.sc. Thesis. Faculty of Agriculture. Shahrood university of Technology. Iran.
32. Talaat, N. B., Ghoniem, A. E., Abdelhamid, M. T. & Shawky, B. T. (2015). Effective microorganisms improve growth performance, alter nutrients acquisition and induce compatible solutes accumulation in common bean (Phaseolus vulgaris L.) plants subjected to salinity stress. Plant Growth Regulation, 75, 281–295.
33. Tavarini, S., Innocenti, E. D., Remorini, D., Massai, R. & Guidi, L. (2008). Antioxidant capacity, ascorbic acid, total phenols and carotenoids changes during harvest and after storage of Hayward kiwifruit. Food Chemistry, 107, 282–288.
34. Thomas, H. (2013). Senescence, ageing and death of the whole plant. New Phytologist,197, 696–711.
35. Umemoto, N., Nakayasu, M., Ohyama, K., Yotsu-Yamashita, M., Mizutani, M., Seki, H., Saito, K. & Muranaka, T. 2016. Two cytochrome P450 monooxygenases catalyze early hydroxylation steps in the potato steroid glycoalkaloid biosynthetic pathway. Plant Physiology, 171(4), 2458-2467.
36. Varghese, N., Alyammahi, O., Nasreddine, S., Alhassani, A. & Gururani, M. A. (2019). Melatonin positively influences the photosynthetic machinery and antioxidant system of Avena sativa during salinity stress. Plants, 8(12), 610.
37. Vasanthi, R., Greeshma, G., Sowmya, K., Akhila, K., Saikumar, M., Shaistha, Rao K. N. V., Rajeswardutt K. & Ramana, H. (2017). A comparative study on phytochemical and in vitro antioxidant activity of Trigonella foenum graecum Pharma Chemica, 9(16), 22-24.
38. Zhang, J., Wang, L., Xie, W., Hu, S., Zhou, H., Zhu, P. & Zhu, H. (2020). Melatonin attenuates ER stress and mitochondrial damage in septic cardiomyopathy: A new mechanism involving BAP31 upregulation and MAPK‐ERK pathway. Journal of Cellular Physiology, 235(3), 2847-2856.
39. Zheng, X. L., Tian, S. P., Meng, X. H., & Li, B. Q. (2013). Physiological and biochemical responses in peach fruit to oxalic acid treatment during storage at room temperature. Food Chemistry, 104, 156–162.
40. Zhou, C., Li, X., Zhou, Z., Li, C., & Zhang, Y. (2019). Comparative transcriptome analysis identifies genes involved in diosgenin biosynthesis in Trigonella foenum-graecum L. Molecules, 24(1), 140.

[1]- Isoprenoids

[2] -Isopentyl pyrophosphate

[3]- Mitogen-activated protein kinase 

[4]- Salt overly sensitive

[5]- Degenerate

[6]- Relative standard curve method

[7] Cytochrome P450 monooxygenase 72