Some physiological and biochemical responses of wheat cultivar seedlings to cold stress

مقدمه

گندم از مهم­ترین گیا­هان زراعی است که 41 درصد از انرژی مورد نیاز مردم جهان را تامین می­کند و بیشترین میزان سطح زیر کشت را در بین غلات در جهان به خود اختصاص داده است (FAOSTAT, 2018). بخش شایانی از سطح زیر کشت گندم نان کشور در نواحی سردسیر و مرتفع کوهستانی قرار گرفته است. با توجه به این‌که خسارت سرما و یخ­زدگی، منجر به کاهش چشم­گیر عملکرد گندم در این نواحی می­شود، بنابراین شناخت ساز و کارهای مقاومت به سرما و انتخاب ژنوتیپ­های گندم متحمل به سرما، از اهمیت بسزائی برخوردار است (Winfield et al., 2010). طی تنش سرما، دسترسی گیاه به انرژی متابولیکی در جهت رشد کمتر می­شود؛ جذب عناصر غذایی و آب با محدودیت مواجه می‌شود؛ آسیمیلاسیون کاهش می‌یابد و در نهایت رشد کاهش یافته و یا متوقف می­شود (Fowler, 2008). از آن‌جا که تنش سرما در مرحله جوانه­زنی، موجب عدم استقرار مطلوب گیاه می‌شود و ضعف گیاهچه در این مرحله، دست­یابی به عملکرد مناسب را تحت تأثیر قرار می‌دهد، بنابراین عدم پوشش یکنواخت در کشت­های پاییزه گندم، به خسارات فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی ناشی از سرما نسبت داده شده است (Monroy et al., 2007).

تنش سرما، فعالیت بیوسنتزی گیاه را کاهش می‌دهد؛ مانع عملکرد معمول فرآیندهای فیزیولوژیکی می‌شود و می­تواند آسیب­های دائمی در گیاه ایجاد کند و در موارد شدید، مرگ گیاه را به همراه داشته باشد
(Nazari et al., 2012). تقریباً تمام گونه­های گیاهی مناطق معتدل و مرطوب، تنش سرما را در اوایل فصل بهار و یا کل دوران کشت پاییزه تجربه می­کنند. بیشترین میزان خسارت در گیاهان در شرایط تنش، در نتیجه اختلال در زنجیره­های انتقال الکترون و تولید بیش از اندازه گونه­های اکسیژن فعال (ROS[1]) از قبیل رادیکال سوپر اکسید (O₂^-)، پراکسید هیدروژن (H₂O₂) و رادیکال هیدروکسیل (OH^-) در گیاه می­باشد. افزایش بیش از اندازه این ترکیبات سمی سلولی، منجر به اختلال در تعادل ROS و سازوکار دفاعی گیاه می‌شود که در نتیجه، رشد و توانایی فتوسنتزی گیاه را کاهش می­دهد (Choudhury et al., 2017).

ROSها، مولکول‌های اکسیدکننده­ای هستند که در غلظت­های بالا، عامل اصلی خسارت در درون سلول
می­باشند. این ترکیبات، در بخش­های مختلف سلول تولید می‌شوند و سبب خسارت به ماکرومولکول­های حیاتی، غشا­ها و اندامک­های سلولی می‌شوند. در نتیجه، فعالیت­های تنفسی در میتوکندری و توانایی تثبیت CO₂ در کلروپلاست کاهش می‌یابد و نشت الکترولیت­ها از سلول افزایش می­یابد. به علاوه، این ترکیبات، لیپیدهای موجود در غشای سلولی را اکسید می‌کند و منجر به تغییر ساختار غشا و اختلال در یکپارچگی آن می­شود و در نهایت شاخص پایداری غشا (MSI[2]) سلول را کاهش می­دهد. یکی از واکنش­هایی که در حین تجمع  ROSسرعت بیشتری می­یابد، پراکسیداسیون لیپیدهای غشایی است که باعث تولید آلدئیدهایی مانند مالون‌ دی‌آلدئید  (MDA[3]) می­شوند. تاثیر ROS بر لیپیدها و پراکسیداسیون آن‌ها، ناشی از اثر بر پیوندهای دوگانه اسیدهای چرب غیراشباع می­باشد که واکنش­های زنجیره­ای پراکسیداسیون را تحریک کرده و باعث تخریب اسیدهای چرب می­شوند
(Loggini et al., 1999; Maali-Amiri et al., 2010). ترکیبات ROS با اکسیداسیون آمینواسیدها در پروتئین‌ها و همچنین کوفاکتور متصل به آن‌ها، موجب غیرفعال شدن بعضی از آنزیم‌های خاص می­شوند. این ترکیبات همچنین به قندها و بازهای سازنده مولکول DNA خسارت وارد می‌کنند و باعث حذف شدن بازها، ایجاد موتاسیون و اثرات مختلف ژنتیکی می‌شوند
 (Nita & Grzybowski, 2016).

مواد و روش­ها

 در این پژوهش، با توجه به نتایج ارزیابی مزرعه‌ای و همچنین بررسی برخی شاخص‌های مورفوفیزیولوژیکی تحت تنش سرما، از شش رقم گندم دیم شامل پنج رقم پاییزه (سرداری، نورستار، باران، صدرا و آذر۲) و یک رقم بهاره (کریم) تهیه شده از موسسه دیم مراغه استفاده شد (Mohammadi et al., 2012; Rostaii et al., 2015). دو رقم بومی سرداری و آذر ۲، تقریبا حدود ۹۰ درصد سطح زیر کشت گندم دیم کشور را به خود اختصاص داده­اند و ارقام باران و صدرا نیز دو رقم تازه معرفی شده هستند که براساس مطالعات انجام شده، عملکرد و تحمل به سرمای مناسبی نسبت به سایر ارقام نشان داده­اند. جهت ارزیابی دقیق­تر پاسخ به تنش سرما، این ارقام با رقم نورستار که بومی کشور کانادا است و متحمل­ترین رقم به سرما می­باشد، مقایسه شدند (Mahfoozi et al., 2001). رقم بهاره کریم نیز در بررسی­های اولیه مزرعه­ای، تحمل نسبی به تنش سرما مابین ارقام بهاره داشت؛ بنابراین می­تواند در ارزیابی دقیق­تر پاسخ­های سلولی ارقام پاییزه و بهاره به کار گرفته شود.

آزمایش به صورت فاکتوریل و در قالب طرح کاملاً تصادفی و با سه تکرار در اتاقک رشد با شرایط نوری ۲۰۰ میکرو­مول بر انیشتن و ۱۶ ساعت روشنایی و هشت ساعت تاریکی و رطوبت نسبی ۷۵ درصد به مرحله اجرا درآمد. فاکتور اول ارقام در شش سطح و فاکتور دوم تیمارهای دمایی شامل چهار سطح شاهد (۲۳ درجه سانتی­گراد)، سازگاری (چهار درجه سانتی­گراد) به مدت ۱۵ روز در مرحله چهار برگی و تنش سرما در گیاهان سازگار شده (۵- درجه سانتی­گراد) و  تنش سرما در گیاهان سازگار نشده (۵- درجه سانتی­گراد) بود (Nejadsadeghi et al., 2014). هر واحد آزمایشی، در گلدان سه کیلوگرمی با پنج عدد بذر کاملاً سالم که در سه تکرار کاشته شد. نمونه­های برگی در مرحله پنج تا شش برگی از هر پنج بوته مربوط به هر تکرار تهیه شد و پس از پیچیده شدن در داخل فویل،  بلافاصله در نیتروژن مایع به فریزر ۸۰- درجه سانتی­گراد منتقل شدند.

مالون­دی­آلدهید

تجمع مالون دی آلدهید برگ با استفاده از آزمون تیوباربیوتیک اسید تعیین شد (Heath & Packer, 1968). 300 میلی­گرم نمونه برگی در پنج میلی­لیتر بافر استخراج (یک مولار Tris-HCl با 6/7= pH)، هموژنه شد و سه میلی­لیتر از این ترکیب با دو میلی­لیتر محلول تیوباربیوتیک اسید 5/0 درصد حاوی تری کلرو استیک اسید 20 درصد مخلوط شد و در حمام آب جوش به مدت ۳۰ دقیقه قرار داده شد. پس از عبور از صافی، با سانتریفیوژ با سرعت  g× ۵۰۰۰ به مدت ۱۰ دقیقه، چگالی نمونه در طول موج ۵۳۲ نانومتر در دستگاه اسپکتروفتومتر تعیین شد. غلظت مالون دی آلدهید بر اساس رابطه 1 محاسبه شد:

               رابطه 1            C=D/E

 که در آن، D: جذب نمونه و E: ضریب تمایز مولار (مول/سانتی­متر ۱۰^۵×56/1) است
 (Maali-Amiri et al., 2007).

شاخص پایداری غشا سلولی

شاخص پایداری غشا سلولی نیز به روش Sairam & Srivastava  (2001) اندازه­گیری شد. برای تعیین شاخص پایداری غشا سلولی، برگ­های بالایی گیاه جدا شدند و پس از قرار گرفتن در کیسه پلاستیکی، به آزمایشگاه منتقل شدند. یک گرم برگ وزن شد و دو سری نمونه یکسان در دو لوله­ آزمایش حاوی ۱۰ میلی­لیتر آب دو بار تقطیر قرار گرفت. سپس یک سری از نمونه­ها در دستگاه بن­ماری در دمای ۴۰ درجه سانتی­گراد به مدت ۱۰ دقیقه قرار گرفتند و پس از این زمان، هدایت الکتریکی نمونه­ها به کمک دستگاه  EC‌متر اندازه­گیری شد. سری دوم از لوله آزمایش را نیز به مدت نیم ساعت در دمای ۱۰۰ درجه سانتی­گراد قرار داده شدند:

        MSI= 1- (EC₄₀/ EC₁₀₀)        رابطه 2

که در این رابطه، MSI: شاخص پایداری غشا، EC₄₀: هدایت الکتریکی آب ۴۰ درجه سانتی­گراد و EC₁₀₀: هدایت الکتریکی آب ۱۰۰ درجه سانتی­گراد است.

استخراج پروتئین کل و سنجش فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدان

کلیه مراحل استخراج در نمونه­ها بر روی یخ انجام شد. نمونه­ها در­ هاون چینی و به کمک ازت مایع، ساییده و پودر شدند. 5/2 میلی­لیتر بافر استخراج (بافر فسفات ۱۰۰ میلی­مولار با 6/7= pH) به ۲۵/۰ گرم از پودر اضافه شد و ورتکس شد. نمونه­ها به مدت ۱۵ دقیقه با سرعت  g× ۱۳۰۰۰ و در دمای چهار درجه سانتی‌گراد سانتریفیوژ شدند. سپس، مایع رویی (عصاره آنزیمی) برای سنجش کمی آنزیم­ها استفاده شد. غلظت پروتئینی نمونه­ها بر اساس روش برادفورد تعیین شد (Bradford, 1976).

اندازه­گیری فعالیت آنزیم SOD

اندازه­گیری فعالیت سوپر اکسید دیسموتاز طبق روشBeyer & Fridovich  (1987) انجام شد. بافر اصلی واکنش شامل بافر فسفات (6/7= pH) ۱۰۰ میلی­مولار، متیونین ۱۲ میلی­مولار، نیتروبلو تترازولیوم ۷۵ میکرومولار و ترایتون ایکس- ۱۰۰ (۰۲۵/۰ درصد) بود. از بافر اصلی به هر چاهک به میزان ۲۹۰ میکرولیتر اضافه شد. سپس پنج میکرو­لیتر بافر ریبو فلاوین دو میکرومولار به مخلوط واکنش اضافه شد و دستگاه در طول موج nm ۵۶۰ کالیبره شد. برای سنجش هر نمونه، ۱۰ میکرولیتر از عصاره پروتئینی استفاده شد. این واکنش بر اساس میزان احیای نوری نیتروبلو تترازولیوم و توانایی آنزیم SOD در ممانعت از این واکنش بررسی شد. میزان فعالیت آنزیم بر اساس واحد آنزیم در دقیقه در میلی­گرم پروتئین محاسبه شد.

اندازه­گیری فعالیت آنزیم CAT

فعالیت آنزیم کاتالاز در دمای ۲۵ درجه سانتی­گراد با استفاده از اسپکتروفتومتر (Shimadzu UV-160)به روشScebba et al.  (1998) اندازه­گیری شد. مواد استفاده شده شامل ۳۰۰۰ میکرولیتر بافر فسفات پتاسیم (۷=pH) ۵۰ میلی­مولار، پنج میکرولیتر پراکسید­هیدروژن ۴۱/۳ مولار و ۱۰۰ میکرولیتر عصاره آنزیم بود و فعالیت آنزیم بر اساس میکرومول H₂O₂ تجزیه شده در دقیقه در میلی­گرم پروتئین محاسبه شد.

اندازه­گیری فعالیت آنزیم APX

فعالیت آنزیم APX در دمای ۲۵ درجه سانتی­گراد با استفاده از اسپکتروفتومتر به روش Ranieri et al.  (2003) اندازه­گیری شد. مخلوط واکنش حاوی بافر فسفات پتاسیم (۸/۷pH=) ۵۰ میلی­مولار، آسکوربات پنج میلی­مولار، H₂O₂ یک میلی­مولار و عصاره پروتئینی به میزان ۱۰ میکرولیتر بود. بر اساس حداکثر جذب آسکوربات در طول موج nm ۲۹۰، میزان فعالیت آنزیم اندازه­گیری شد و بر اساس میکرومول آسکوربات اکسید شده در دقیقه در میلی­گرم پروتئین گزارش شد.

اندازه­گیری فعالیت آنزیم GPX

فعالیت آنزیم GPX مشابه آنزیم کاتالاز، در دمای ۲۵ درجه سانتی­گراد با استفاده از اسپکتروفتومتر به روش Dionisio-Sese & Tobita  (1998)  اندازه­گیری شد. مخلوط واکنش شامل بافر فسفات (۷pH=) میلی­مولار ۵۰، گایاکول ۱۰ میلی­مولار، H₂O₂ ۱۵ میلی­مولار و ۵۰ میکرولیتر عصاره پروتئینی بود. پس از افزودن عصاره پروتئینی، بلافاصله جذب در طول موج  nm۴۷۰ قرائت شد. میزان فعالیت آنزیم بر اساس میکرومول گایاکول در دقیقه در میلی­گرم پروتئین محاسبه شد.

تجزیه و تحلیل داده­ها

تجزیه واریانس داده­ها با استفاده از نرم افزار SAS، مقایسات میانگین با استفاده از آزمون دانکن در سطح احتمال یک درصد و رسم نمودارها با استفاده از نرم­افزار Excel  انجام شد.

نتایج و بحث

نتایج تجزیه واریانس (جدول ۱) نشان داد که بین میزان MDA در ارقام، سطوح تیماری و اثر متقابل آن‌ها، اختلاف معنی‌داری در سطح احتمال یک درصد وجود داشت.

جدول ۱- نتایج تجزیه واریانس صفات اندازه­گیری شده در پاسخ به سطوح تیماری در ارقام مختلف گندم.

Table 1. Variance analysis of measured traits in response to treatment levels in different wheat cultivars.

nsو ^**: به‌ترتیب عدم اختلاف معنی­دار و معنی­دار در سطح احتمال یک درصد.

ns and **: non-significant and significant differences at 1% of probability level, respectively.

بیشترین میزان تجمع MDA مربوط به ارقام کریم، صدرا و سرداری تحت تنش سرما در گیاهان سازگار نشده و کمترین میزان آن مربوط به رقم نورستار در شرایط شاهد (23 درجه سانتی­گراد) بود. تحت تنش سرما، تیمار سازگاری باعث کاهش میزان MDA شد، به‌طوری­که میزان MDA در ارقام آذر ۲، باران، کریم، نورستار، صدرا و سرداری، به‌ترتیب 7/39، 41، 43.6، 1/51، 6/52 و 8/49 درصد کمتر از شرایط غیر سازگاری در گیاهان بود که دو موضوع را مشخص کرد: الف- تیمار سازگاری موثر بوده است و قادر به تفکیک ارقام از نظر ویژگی‌های فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی بود و ب- به‌طور غیرمستقیم، ظرفیت ارقام را در مقابله با تنش سرما نشان داد. نتایج مقایسه میانگین نشان­داد که با کاهش دما، محتوای MDA در ارقام در اثر اعمال تنش، افزایش یافت (شکل ۱). با کاهش دما در اثر تجمع ترکیبات ROS و متعاقب آن‌ها تخریب غشا، میزان MDA بیشتری در سلول آزاد می­شود (Choudhury et al., 2017). کمترین درصد تغییرات در تمامی سطوح تیماری نسبت به شاهد، به رقم باران اختصاص داشت که در تیمارهای سازگاری، تنش سرما پس از سازگاری و غیر سازگاری، به‌ترتیب 58، 134و 298 درصد بود (اعداد به صورت درصد تغییرات نسبت به شاهد محاسبه شده است). بین ارقام، رقم باران با کمترین میزان درصد تخریب غشا و آسیب‌پذیری، تحمل بیشتری نسبت به سایر ارقام از خود نشان داد. با توجه به این‌که تحت شرایط تنش سرما، رقم باران کمترین میزان تغییرات تخریب غشا را نسبت به سایر ارقام نشان داد، این رقم از نظر این صفت نسبت به بقیه متحمل­تر بود. افزایش MDA در شرایط سازگاری که کمتر از شرایط تنش بود، به نقش سیگنالینگ MDA اشاره دارد که سبب افزایش فعالیت سیستم­های دفاعی در جهت مقابله با تنش سرما می­شود. بنابراین افزایش نسبیROS  در دوره­های سازگاری، به‌عنوان پیش­نیاز فعالیت سیستم­های دفاعی در گیاهان معرفی شده­اند
 (Kazemi Shahandashti et al., 2018).

حفظ یکپارچگی ساختار غشاهای سلولی طی تنش سرما، بیانگر تنظیم فرآیندهای متعدد سلولی است (Maali-Amiri et al., 2010; Hassan et al., 2015). نتایج تجزیه واریانس نشان داد که بین سطوح دمایی و ارقام از نظر شاخص پایداری غشا، اختلاف معنی‌داری در سطح احتمال یک درصد وجود داشت (جدول ۱).

بر اساس نتایج، بیشترین میزان شاخص پایداری غشا در ارقام باران و نورستار مشاهده شد و سایر ارقام از این نظر تفاوت معنی­داری نسبت به هم نداشتند. تحت تنش سرما، پایداری غشا به‌طور معنی­داری نسبت به شرایط شاهد کاهش یافت و بیشترین میزان کاهش مربوط به تیمار تنش سرما در گیاهان سازگار نشده بود که کمترین شاخص پایداری غشا را به خود اختصاص داد (شکل 2). بر اساس نتایج، منطبق بودن MDA و MSI نشان­دهنده ارتباط فیزیولوژیک بین این دو شاخص بود، به نحوی که با کاهش میزان پایداری ساختار غشا، میزان پراکسیداسیون لیپیدها افزایش یافت.

شکل ۱- تغییر میزان مالون دی آلدهید در ارقام گندم تحت تیمارهای مختلف دمایی، از چپ به راست ستون­های هر رقم به‌ترتیب مربوط به گیاهان شاهد، گیاهان سازگار شده (دمای چهار درجه سانتی­گراد)، گیاهان سازگار شده تحت تنش سرما (دمای 5- درجه سانتی­گراد ) و گیاهان سازگار نشده تحت تنش سرما (دمای 5- درجه سانتی­گراد) می­باشد. حروف متفاوت، نشان دهنده اختلاف معنی­دار بین میانگین­ها بر اساس آزمون دانکن در سطح یک درصد می‌باشد.

Figure 1. Malondialdehyde content changes in wheat cultivars under cold treatments [from left to right, columns of each cultivar are control plants, acclimated plants (4ºC), acclimated plants under cold stress
(-5ºC), and non-acclimated plants under cold stress (-5ºC), respectively]. Different letters indicate a significant difference among the means based on Duncan’s multiple range test (P < 0.01).

در نتیجه، می‌توان شاخص MSI  نیز به‌عنوان معیاری در شناسایی میزان تحمل به تنش سرما در نظر گرفت، به‌طوری‌که هرچه مقدار این شاخص در ارقام بیشتر باشد، پایداری ساختار غشا بیشتر می‌شود و گیاه حساسیت کمتری به شرایط تنش دارد. بر این اساس، کاهش معنی­دار MSI در ارقام کریم، صدرا، آذر۲ و سرداری، نشان­دهنده پایداری کمتر ساختار غشا نسبت به دو رقم نورستار و باران بود که این مساله احتمالا در نتیجه تجمع ROS به دنبال کاهش دما می­باشد که در ادامه در مورد آن بحث خواهد شد. نکته جالب آن است که رقم کریم که یک رقم بهاره متحمل به سرما است، شاخص پایداری غشا کمتری در مقایسه با ارقام باران و نورستار داشت. در مطالعات مزرعه­ای، این رقم در غربال اولیه ارقام بهاره، تحمل بیشتری به سرما نشان داد. با این وجود و تحت شرایط کنترل شده، اختلاف معنی­داری با ارقامی همچون صدرا، آذر ۲ و سرداری نداشت. بنابراین به‌نظر می­رسد که به موازات مطالعات مزرعه­ای که گیاهان در معرض انواع متفاوتی از شرایط محیطی قرار می­گیرند، مطالعات تحت شرایط گلخانه می­تواند ارزیابی دقیق­تری از نظرتحمل به یک تنش نشان دهد. نتایج MDA نیز تایید کننده حساسیت بیشتر این رقم در مقایسه با باران و نورستار و برخی ارقام دیگر مانند صدرا و سرداری بود. بنابراین تیمارهای سرمایی اعمال شده در این آزمایش، قادر به تفکیک ارقام مختلف از نظر تحمل به تنش سرما شد؛ نتایجی که می­تواند با مقایسه داده­های MDA و پایداری غشا تایید شود.

از تغییرات عمده بیوشیمیایی سلول­های گیاهی، تغییر غلظت پروتئین‌ کل در اثر تخریب و یا مهار سنتز برخی از پروتئین‌ها و به‌کارگیری انرژی سلول در ساخت پروتئین‌های مخصوص مقابله با تنش است (Heidarvand & Maali-Amiri, 2013). بر اساس نتایج تجزیه واریانس، بین محتوی پروتئین کل  درارقام، تیمارهای دمایی و اثر متقابل رقم در تیمار ، اختلاف معنی‌داری در سطح احتمال یک درصد وجود داشت (جدول ۱). با کاهش دما، میزان پروتئین کل در دمای سازگاری و همچنین در شرایط تنش در گیاهان سازگار شده در تمامی ارقام به­جز رقم کریم افزایش و در تمامی ارقام در گیاهان سازگار نشده تحت تنش کاهش یافت (شکل 3).

شکل ۲- تغییر شاخص پایداری غشا در ارقام مختلف گندم (A) و تیمارهای دمایی (B). حروف متفاوت نشان دهنده اختلاف معنی­دار بین میانگین­ها بر اساس آزمون دانکن در سطح یک درصد می‌باشند.

Figure 2. Membrane stability index Changes in wheat cultivars (a) and cold treatments (b). Different letters indicate a significant difference among means based on Duncan’s multiple range test (P < 0.01).

این موضوع بیانگر نقش فرآیند سازگاری در القا پاسخ­های سلولی تحت تنش سرما می­باشد. افزایش میزان پروتئین کل، نشان دهنده سنتز پروتئین­های سلولی به‌خصوص پروتئین­های دخیل در دفاع سلولی است که از آن جمله می‌توان به پروتئین­های خانواده ژنی WCS 120، دهیدرین­ها، فاکتورهای رونویسی متعدد و همچنین ژن­های سنتز کننده آنزیم­های آنتی اکسیدان اشاره کرد (Kazemi Shahandashti et al., 2018). بیشترین میزان پروتئین کل، به رقم باران تحت تنش سرما در گیاهان سازگار شده و کم­ترین مقدار پروتئین، به رقم سرداری و آذر ۲ در گیاهان سازگار نشده تحت تنش سرما تعلق داشت. کم­ترین درصد تغییرات در افزایش میزان پروتئین کل در رقم کریم مشاهده شد که در سازگاری و همچنین تحت شرایط تنش در گیاهان سازگار شده، به‌ترتیب ۱۲ و ۱۴ درصد نسبت به شاهد افزایش نشان داد. این موضوع نشان­دهنده ظرفیت بالقوه ژنتیکی کم این رقم در مقایسه با ارقام دیگر می­باشد. بخشی از داده­های MDA و شاخص پایداری نیز نشان­دهنده تحمل کمتر این رقم در مقایسه با دیگر ارقام می­باشند. به‌نظر می­رسد که راهکار تدافعی سلول با افزایش ترکیبات ROS، افزایش میزان ترکیبات دفاعی از جمله آنزیم­های آنتی اکسیدان است که افزایش میزان پروتئین، احتمالا نشان­دهنده آن می­باشد. در شرایط تنش سرما در گیاهان سازگار نشده، میزان پروتئین کل در تمامی ارقام در مقایسه با شاهد کاهش یافت. مطالعات نشان داده است که کاهش پروتئین‌ محلول برگ به‌عنوان یک عامل غیر روزنه­ای محدودکننده فتوسنتز محسوب می­شود، به‌طوری‌که در این حالت، تنش بر گیاه اثرگذار است و خسارت ایجاد می‎شود. با طولانی­تر شدن مدت زمان قرارگیری گیاه در شرایط تنش، میزان خسارت، سبب کاهش سنتز یا افزایش تخریب پروتئین‌ها می­شود (Laino et al., 2010). بیشتر بودن میزان پروتئین‌ کل تحت تنش سرما پس سازگاری و غیر سازگاری در رقم باران در مقایسه با ارقام دیگر، احتمالا فعالیت بیشتر مکانیسم­های دفاعی این گیاه را در مقابله با خسارت اکسیداتیو (نتایج MDA و شاخص پایداری غشا) نشان می­دهد.

شکل 3- تغییر میزان پروتئین کل در ارقام گندم، از چپ به راست ستون­های هر رقم به‌ترتیب مربوط به گیاهان شاهد، گیاهان سازگار شده (دمای چهار درجه سانتی­گراد)، گیاهان سازگار شده تحت تنش سرما (دمای 5- درجه سانتی­گراد ) و گیاهان سازگار نشده تحت تنش سرما (دمای 5- درجه سانتی­گراد) می­باشد. حروف متفاوت، نشان دهنده اختلاف معنی­دار بین میانگین­ها بر اساس آزمون دانکن در سطح یک درصد می‌باشد.

Figure 3. Total protein content change in wheat cultivars [from left to right, columns represent: control, acclimated plants (4ºC), acclimated plants under cold stress (-5ºC), and non-acclimated plants under cold stress (-5ºC), respectively]. Different letters indicate a significant difference among means based on Duncan’s multiple range test (P < 0.01).

میزان فعالیت آنزیم SOD

تغییر میزان پروتئین کل، احتمالا با تغییر در فعالیت سیستم­های دفاعی سلول ازجمله آنزیم­های آنتی اکسیدانی همراه می­شود که بر تحمل گیاه به تنش سرما تاثیر گذار است؛ بنابراین در ادامه تغییر، فعالیت برخی از این آنزیم­ها بررسی شد. بر اساس نتایج تجزیه واریانس، بین ارقام، سطوح تیماری و اثر متقابل آن‌ها از نظر میزان فعالیت آنزیم SOD اختلاف معنی‌داری در سطح احتمال یک درصد وجود داشت (جدول ۱). نتایج مقایسه میانگین­ها نشان داد که با کاهش دما، میزان فعالیت آنزیم SOD در شرایط سازگاری و همچنین در شرایط تنش در گیاهان سازگار شده در تمامی ارقام افزایش یافت. کمترین میزان فعالیت در شرایط تنش در گیاهان سازگار نشده در ارقام باران، آذر ۲ و کریم مشاهده شد که تفاوت معنی­داری نسبت به یکدیگر نشان ندادند. بیشترین میزان فعالیت این آنزیم تحت تنش در گیاهان سازگار شده، در رقم سرداری مشاهده شد، درحالی‌که بیشترین تغییر فعالیت این آنزیم نسبت به شاهد، در دو رقم آذر ۲ (۱۵/۱ برابر) و نورستار (۰۹/۱ برابر) مشاهده شد. این نتایج مطابقت بسیار زیادی با نتایج مربوط به میزان MDA این ارقام داشت، به­طوری­که این دو رقم، کمترین میزان MDA را به همراه رقم باران به خود اختصاص دادند (شکل 4). در شرایط تنش، کاهش میزان فعالیت آنزیم در گیاهان سازگار نشده در مقایسه با گیاهان سازگار شده، به نقش مهم فرآیند سازگاری در القا فعالیت سیستم­های دفاعی اشاره دارد. عدم وجود دوره­های سازگاری، سبب القا تنش­های شدیدتر سرما در ارقام شد که احتمالا به دلیل افزایش فعالیت

شکل 4- تغییر میزان فعالیت آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز در ارقام گندم، از چپ به راست ستون­های هر رقم به‌ترتیب مربوط به گیاهان شاهد، گیاهان سازگار شده (دمای چهار درجه سانتی­گراد)، گیاهان سازگار شده تحت تنش سرما (دمای 5- درجه
 سانتی­گراد ) و گیاهان سازگار نشده تحت تنش سرما (دمای 5- درجه سانتی­گراد) می­باشد. حروف متفاوت، نشان دهنده اختلاف معنی­دار بین میانگین­ها بر اساس آزمون دانکن در سطح یک درصد می‌باشد.

Figure 4. Superoxide dismutase (SOD) enzyme activity changes in wheat cultivars [from left to right, columns represent: control, acclimated plants (4ºC), acclimated plants under cold stress (-5ºC), and non-acclimated plants under cold stress (-5ºC), respectively]. Different letters indicate a significant difference among the means based on Duncan’s multiple range test (P < 0.01).

سازوکار­های تخریب پروتئینی و کاهش فرآیندهای بیوسنتز پروتئین، فعالیت آنزیم کاهش یافت (شکل 4). با افزایش فعالیت CAT در گیاهان تحت تنش، میزان H₂O₂ حاصل از متابولیسم سلولی کاهش می‌یابد و از آسیب بافت­ها جلوگیری می­شود
 (Gill & Tuteja, 2010). بر اساس نتایج تجزیه واریانس، بین ارقام، سطوح تیماری و اثر متقابل آن‌ها از نظر میزان فعالیت آنزیم CAT، اختلاف معنی‌داری در سطح احتمال یک درصد وجود داشت (جدول ۱). نتایج مقایسه میانگین­ها نشان داد که بیشترین میزان فعالیت این آنزیم تحت تنش در گیاهان سازگار شده، در رقم باران مشاهده شد که بیشترین میزان شاخص پایداری غشا را نیز به خود اختصاص داد. کمترین میزان فعالیت CAT در شرایط تنش در گیاهان سازگار نشده، در ارقام صدرا، سرداری و کریم مشاهده شد که تفاوت معنی­داری نسبت به یکدیگر نشان ندادند و این ارقام از نظر پایداری غشا نیز کمترین میزان پایداری را داشتند. این امر، منطبق بودن نتایج فعالیت آنزیم CAT با میزان MSI را نشان می­دهد (شکل 5).

در شرایط تنش در گیاهان سازگار نشده، کاهش میزان فعالیت آنزیم در ارقام مختلف نسبت به گیاهان در شرایط سازگار شده مشاهده شد که احتمالا افزایش فعالیت سازوکار­های تخریب پروتئینی و کاهش فعالیت سازوکار­های سنتز پروتئینی از دلایل آن می­باشد. آنزیم کاتالاز به دلیل ساختار چند قسمتی آن، فعالیت آن تحت تنش­های شدید مختل شده است، بنابراین کاهش فعالیت آن به درستی نقش شدید تنش سرما تحت شرایط سازگار نشده گیاهان را در مقایسه با شرایط سازگاری نشان می­دهد. نکته جالب، میزان فعالیت کمتر آنزیم در رقم نورستار در مقایسه با رقم باران تحت شرایط تنش پس از سازگاری بود. به‌نظر می­رسد که در رقم نورستار به دلیل نیاز به دوره­های سازگاری طولانی­تر در مقایسه با بقیه ارقام، میزان فعالیت آنزیم هنوز به ماکزیمم فعالیت نرسیده است. با این وجود و به دلیل هماهنگی در فعالیت سیستم­های دفاعی و هم تنظیمی آن‌ها، میزان خسارت این رقم تحت تنش پس از سازگاری در مقایسه با رقم باران به‌طور معنی­داری کمتر بود. بیان این نکته مهم است که دوره سازگاری در گندم نورستار به‌عنوان یکی از ارقام متحمل به سرما در جهان، حدود 50-40 روز می­باشد (Mahfoozi et al., 2001).

شکل 5- تغییر میزان فعالیت آنزیم کاتالاز در ارقام گندم، از چپ به راست ستون­های هر رقم به‌ترتیب مربوط به گیاهان شاهد، گیاهان سازگار شده (دمای چهار درجه سانتی­گراد)، گیاهان سازگار شده تحت تنش سرما (دمای 5- درجه سانتی­گراد ) و گیاهان سازگار نشده تحت تنش سرما (دمای 5- درجه سانتی­گراد) می­باشد. حروف متفاوت نشان‌دهنده اختلاف معنی­دار بین میانگین­ها براساس آزمون دانکن در سطح یک درصد می‌باشد.

Figure 5. Catalase (CAT) enzyme activity change in wheat cultivars [from left to right, columns represent: control, acclimated plants (4ºC), acclimated plants under cold stress (-5ºC), and non-acclimated plants under cold stress (-5ºC), respectively]. Different letters indicate a significant difference among means based on Duncan’s multiple range test (P < 0.01).

با این وجود در این آزمایش، دوره سازگاری ۱۵ روز انتخاب شد. عقیده بر آن است که در شرایط طبیعی در مزرعه، همواره شرایط برای سازگاری کامل یک گیاه فراهم نیست، بنابراین ژنوتیپی می­تواند بقا و عملکرد مناسب داشته باشد که در دوره زمانی کوتاهتری، بیشترین سازگاری را در خود ایجاد کند تا بتواند به‌عنوان یک رقم جهت آزادسازی و کشت مد نظر قرار گیرد. بنابراین دوره­های کوتاه سازگاری و سرما در این آزمایش، شرایطی ایجاد کرد که بتوان ارزیابی مطلوب اما در مدت زمان کوتاه انجام داد. همچنین چنین شرایط آزمایشی می­تواند به ارزیابی تعداد بیشتری ارقام با هزینه­های کمتر منجر شود. بیشترین تغییر فعالیت آنزیم در گیاهان سازگار شده در دو رقم سرداری و آذر ۲ (به‌ترتیب 261 و187 درصد نسبت به شاهد) بود. بنابراین میزان افزایش فعالیت آنزیمی گیاه تحت تنش سرما به نوع رقم و شرایط تنش بستگی دارد. به‌عبارت‌دیگر، ارقام مختلف پاسخ­های متفاوتی برحسب فعالیت آنزیم­های مختلف به تنش نشان می­دهند. بر اساس نتایج، افزایش و کاهش میزان فعالیت آنزیم کاتالاز، نوعی سازگاری عمومی ­در راستای مواجهه با شرایط تنش به شمار می‌رود و تغییر در میزان فعالیت این آنزیم می­تواند ناشی از سازگاری به شرایط محیطی باشد (شکل 5).

در شرایط تنش شدید، رادیکال­های سوپر اکسید توسط آنزیم SOD به H₂O₂ تبدیل می­شود. افزایش فعالیت این آنزیم باعث تولید H₂O₂ بیشتری می­شود که برای سلول سمی است و باید سریعا به‌وسیله سیستم­های دفاعی آنتی­اکسیدانی از قبیل APX GPX و CAT به آب و اکسیژن تجزیه شود. نتایج تجزیه واریانس نشان داد که بین میزان فعالیت آنزیم GPX در ارقام، سطوح تیماری و اثر متقابل آن‌ها اختلاف معنی‌داری در سطح احتمال یک درصد وجود داشت (جدول1). نتایج مقایسه میانگین فعالیت آنزیم GPX تحت تنش­سرما نشان داد که درصد تغییر فعالیت این آنزیم در ارقام صدرا و باران در تیمارهای دمایی، به‌ترتیب افزایش و کاهش معنی­داری نسبت به آنزیم CAT نشان دادند، اما در سایر ارقام به‌ویژه سرداری و آذر ۲، روند تغییرات مشابهی نسبت به CAT مشاهده شد (شکل 6).

شکل 6- تغییر میزان فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز در ارقام گندم، از چپ به راست ستون­های هر رقم به‌ترتیب مربوط به گیاهان شاهد، گیاهان سازگار شده (دمای چهار درجه سانتی­گراد)، گیاهان سازگار شده تحت تنش سرما (دمای 5- درجه سانتی­گراد ) و گیاهان سازگار نشده تحت تنش سرما (دمای 5- درجه سانتی­گراد) می­باشد. حروف متفاوت، نشان‌دهنده اختلاف معنی­دار بین میانگین­ها بر اساس آزمون دانکن در سطح یک درصد می‌باشد.

Figure 6.  Guaiacol peroxidase (GPX) enzyme activity change in wheat cultivars [from left to right, columns represent: control, acclimated plants (4ºC), acclimated plants under cold stress (-5ºC), and non-acclimated plants under cold stress (-5ºC), respectively]. Different letters indicate a significant difference among the means based on Duncan’s multiple range test (P < 0.01).

افزایش فعالیت آنزیم GPX تحت تنش، مشارکت آن را در حذف ترکیبات ROS به موازات فعالیت سایر آنتی­اکسیدان­ها مانند CAT و APX نشان داد. بیشترین میزان فعالیت این آنزیم تحت تنش در گیاهان سازگار شده در رقم نورستار و کمترین میزان فعالیت در شرایط تنش در گیاهان سازگار نشده در ارقام باران، سرداری و کریم مشاهده شد که تفاوت معنی­داری نسبت به یکدیگر نداشتند. تطابق این نتایج با داده­های MSI و MDA نشان داد که به موازات فعالیت آنزیم­های حذف کننده H₂O₂، فعالیت GPX نیز در کاهش میزان خسارت در شرایط تنش در تمامی ارقام به­خصوص رقم باران و نورستار مشارکت داشت. علاوه بر نقش موثر حذف H₂O₂ تحت تنش در گیاهان سازگار شده، GPX، با کاتالیز اکسیداسیون الکل­های سینامیل که مرحله نهایی تولید لیگنین می­باشد، در چوب شدگی نقش دارند. گیاهان برای جلوگیری از  هدر رفت آب از طریق دیواره سلولی در تنش، سنتز لیگنین را افزایش می­دهند (Khaledian et al., 2015)؛ بنابراین تحت تنش سرما، کاهش میزان خسارت­های سلولی (نتایج MDA)، به دلیل هم تنظیمی فعالیت GPX با سایر آنزیم­های حذف کننده ROSها بویژه H₂O₂ می­باشد که نقش مهمی در بهبود تحمل به تنش سرما دارد. این موضوع به پیچیدگی پاسخ­های تحمل در گیاه گندم اشاره دارد، به‌طوری­که فرضیه بهبود تحمل به تنش به‌وسیله تشدید فعالیت یک ژن را با چالش مواجه می­کند.

نتایج تجزیه واریانس میزان فعالیت آنزیم APX نشان داد که بین ارقام، سطوح تیماری و اثر متقابل آن‌ها اختلاف معنی‌داری در سطح احتمال یک درصد وجود داشت (جدول۱). نتایج مقایسه میانگین فعالیت آنزیم APX نشان داد که با کاهش دما در گیاهان سازگار شده و همچنین در شرایط تنش در گیاهان سازگار شده، میزان فعالیت آنزیم APX افزایش یافت. بیشترین میزان فعالیت این آنزیم به رقم باران در شرایط تنش در گیاهان سازگار شده و کمترین میزان آن نیز به ارقام سرداری و صدرا در شرایط تنش در گیاهان سازگار نشده اختصاص یافت (شکل 7).

شکل 7- تغییر میزان فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز در ارقام گندم، از چپ به راست ستون­های هر رقم به‌ترتیب مربوط
 به گیاهان شاهد، گیاهان سازگار شده (دمای چهار درجه سانتی­گراد)، گیاهان سازگار شده تحت تنش سرما (دمای 5- درجه سانتی­گراد ) و گیاهان سازگار نشده تحت تنش سرما (دمای 5- درجه سانتی­گراد) می­باشد. حروف متفاوت، نشان‌دهنده اختلاف معنی­دار بین میانگین­ها بر اساس آزمون دانکن در سطح یک درصد می‌باشد.

Figure 7. Ascorbate peroxidase (APX) enzyme activity change in wheat cultivars [from left to right, columns represent: control, acclimated plants (4ºC), acclimated plants under cold stress (-5ºC), and non-acclimated plants under cold stress (-5ºC), respectively]. Different letters indicate a significant difference among means based on Duncan’s multiple range test (P < 0.01).

تحت تنش، بیشتر بودن فعالیت آنزیمی APX در رقم باران در مقایسه با نورستار، احتمالا به فعالیت­های موازی دیگر آنزیم­های حذف کننده H₂O₂ از جمله GPX اشاره دارد که تحت تنش سرما در نورستار بیشتر از باران بود. بنابراین به‌نظر می­رسد که تحت تنش سرما، کاهش خسارت­های سلولی در ارقام باران و نورستار، حاصل برآیند فعالیت­های آنزیمی در مسیر حذفROS ها باشد. بنابراین این ارقام احتمالا می­توانند میزان بیشتری از ترکیبات ROS را که در اثر اعمال تنش در گیاهان تولید می­شوند از بین ببرند و تا حد زیادی سلول را از آسیب‌های ناشی از تنش محافظت کنند. افزایش فعالیت APX در شرایط تنش در تحقیق­های فراوانی گزارش ‌شده­ است (Turkan et al., 2005; Terzi et al., 2010; Saglam et al., 2011; Nita & Grzybowski, 2016). فعالیت بالای APX نشان‌دهنده حفاظت بیشتر گیاه در برابر صدمات اکسایشی القا شده به‌وسیله تنش می­باشد (Nita & Grzybowski, 2016). از طرف دیگر، محصول واکنش فعالیت آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز (SOD) یعنی H₂O₂، سوبسترای فعالیت APX می­باشد. بنابراین، H₂O₂ می­تواند نقش سیگنال را برای القای APX ایفا کند (Faize et al., 2011). فعالیت بیشتر APX باعث تجزیه بیشتر H₂O₂ و تحمل بیشتر گیاه به تنش اکسایشی می‌شود. کاهش فعالیت آنزیم نیز می­تواند به دلیل کاهش ROS باشد که در نهایت سنتز آنزیم را کاهش می‌دهد. در شرایط تنش، افزایش ترکیبات ROS می­تواند با فعال­کردن مسیرهای انتقال پیام باعث افزایش بیان ژن­های کدکننده آنزیم­های آنتی‌اکسیدان از قبیل APX، GPX و CAT و افزایش فعالیت این آنزیم­ها ­شود (Mittler, 2002).

نتایج یافته­ها در این پژوهش نشان داد که فرآیند سازگاری با تغییر متابولیت­های سلولی ازجمله آنتی­اکسیدان­های آنزیمی، به‌عنوانسازوکار­ انطباقی مهم ارقام گندم تحت تنش سرما محسوب می­شود. این ساز و کارها در ارقام زمستانه و بهاره، متمایز از یکدیگر هستند. تغییر متابولیسم سلولی که تغییر متابولیت­ها را به‌دنبال دارد، پیامد برنامه­ریزی مجدد ژنوم در سلول­های گیاهی است (Amini et al., 2017). فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدان در نتیجه فرآیند سازگاری می­تواند در خنثی­سازی اثرات تنش اکسیداتیو کمک ­کند؛ بنابراین کاهش خسارت­های سلولی یا تعدیل آن‌ها، مهم­ترین عامل در مقابله با تنش سرما در گیاهان محسوب می­شود (Kazemi Shahandashti & Maali-Amiri, 2018)؛ نتایج MDA در این مطالعه، تایید کننده این موضوع بود. افزایش میزان فعالیت آنزیم­­های CAT، SOD، GPX و APX در تمامی ارقام به خصوص ارقام نورستار و باران نسبت به شرایط شاهد بیشتر بود. تغییر فعالیت این آنزیم­ها در این ارقام معمولاً با کمترین تغییر در کاهش شاخص پایداری غشا و افزایش میزان مالون دی آلدهید سلول همراه بود. تحت شرایط تنش، دو رقم باران و نورستار از بیشترین میزان شاخص پایداری غشا (MSI) برخوردار بودند. همچنین این ارقام، بیشترین فعالیت آنزیمSOD ، GPX و APX را در مقایسه با سایر ارقام از خود نشان دادند. تحت شرایط تنش در گیاهان سازگار نشده، محتوی پروتئین کل در تمامی ارقام کاهش یافت که این کاهش ممکن است از یک سو به‌دلیل کاهش سنتز پروتئین و از سویی دیگر به‌دلیل تخریب پروتئین­ها در اثر واکنش با رادیکال­های آزاد باشد (Kazemi Shahandashti & Maali-Amiri, 2018). در مقایسه دو تیپ بهاره و زمستانه، به‌نظر می­رسد کـه هر دو تیپ در شرایط بدون تنش از میزان MDA،MSI ، پروتئین کل و آنزیم­های آنتی­اکسیدانی تقریبا یکسانی برخوردار بودند، اما با کـاهش دما و اعمال تنش، کاهش معنی­داری در میزان پایداری غشا، پروتئین کل و افزایش معنی­داری در میزان MDA اتفاق افتاد که میزان پاسخ­ها، اشاره به ظرفیت ژنتیکی بالقوه ارقام زمستانه در مقایسه با ارقام بهاره داشت. از طرف دیگر در شرایط تنش در گیاهان سازگار شده، میزان پروتئین کل و فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانتی اندازه­گیری شده افزایش و همچنین شاخص­های خسارت در تمامی این ارقام کاهش یافت که این نتایج، بیانگر نقش مهم سازگاری در تحمل به تنش سرما می­باشد. بنابراین ارقام نورستار و باران می­توانند در برنامه­های به­نژادی به‌عنوان والد در تحقیقات مربوط به سرما استفاده شوند و یا به‌عنوان ارقام متحمل به سرما وارد چرخه تولید شوند.

REFERENCES

1. Amini, S., Maali-Amiri, R., Mohammadi, R. & Kazemi-Shahandashti, S. S. (2017). cDNA-AFLP analysis of transcripts induced in chickpea plants by TiO₂ nanoparticles during cold stress. Plant Physiology and Biochemistry, 111, 39-49.
2. Bradford, M. M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, 72(1-2), 248-254.
3. Choudhury, F. K., Rivero, R. M., Blumwald, E. & Mittler, R. (2017). Reactive oxygen species, abiotic stress and stress combination. Plant Journal, 90(5), 856-867.
4. Dionisio-Sese, M. L. & Tobita, S. (1998). Antioxidant responses of rice seedlings to salinity stress. Plant Science, 135(1), 1-9.
5. Faize, M., Burgos, L., Faize, L., Piqueras, A., Nicolas, E., Barba-Espin, G., Clemente-Moreno, M. J., Alcobendas, R., Artlip. T. & Hernandez, J. A. (2011). Involvement of cytosolic ascorbate peroxidase and Cu/Zn-superoxide dismutase for improved tolerance against drought stress. Journal of Experimental Botany, 62(8), 2599-2613.
6. Fowler, D. (2008). Cold acclimation threshold induction temperatures in cereals. Crop Science, 48, 1147–1154.
7. Gill, S. S. & Tuteja, N. (2010). Reactive oxygen species and antioxidant machinery in abiotic stress tolerance in crop plants. Plant Physiology and Biochemistry, 48(12), 909-930.
8. Guo, Z. F., Ou, W. Z., Lu, S. Y. & Zhong, Q. (2006). Differential responses of antioxidative system to chilling and drought in four rice cultivars differing in sensitivity. Plant Physiology and Biochemistry, 44(11-12), 828-836.
9. Hasanuzzaman, M., Nahar, K., Hossain, M., Mahmud, J., Rahman, A., Inafuku, M., Hirosuke, O. & Fujita, M. (2017). Coordinated actions of glyoxalase and antioxidant defense systems in conferring abiotic stress tolerance in plants. International Journal of Molecular Sciences, 18(1), 200.
10. Hassan, N. M., El-Bastawisy, Z. M., El-Sayed, A. K., Ebeed, H. T. & Alla, M. M. N. (2015). Roles of dehydrin genes in wheat tolerance to drought stress. Journal of Advanced Research, 6(2), 179-188.
11. Heidarvand, L. & Maali-Amiri, R. (2013). Physio-biochemical and proteome analysis of chickpea in early phases of cold stress. Journal of Plant Physiology, 170(5), 459-469.
12. Kazemi-Shahandashti, S. S. & Maali-Amiri, R. (2018). Global insights of protein responses to cold stress in plants: Signaling, defence, and degradation. Journal of Plant Physiology, 226, 123-135.
13. Kazemi-Shahandashti, S. S., Maali-Amiri, R., Zeinali, H., Khazaei, M., Talei, A. & Ramezanpour, S. S. (2014). Effect of short-term cold stress on oxidative damage and transcript accumulation of defense-related genes in chickpea seedlings. Journal of Plant Physiology, 171(13), 1106-1116.
14. Khaledian, Y., Maali-Amiri, R. & Talei, A. (2015). Phenylpropanoid and antioxidant changes in chickpea plants during cold stress. Russian Journal of Plant Physiology, 62(6), 772-778.
15. Loggini, B., Scartazza, A., Brugnoli, E. & NavariIzzo, F. (1999). Anti-oxidative defense system, pigment composition, and photosynthetic efficiency in two wheat cultivars subjected to drought. Plant Physiology, 119, 1091-1099.
16. Maali-Amiri, R., Yur’eva, N. O., Shimshilashvili, K. R., Goldenkova-Pavlova, I. V., Pchelkin, V. P., Kuznitsova, E. I., Tsydendambaev, V. D., Trunova, T. I., Los, D. A., Jouzani, G. S. & Nosov, A. M. (2010). Expression of acyl-lipid Δ12-desaturase gene in prokaryotic and eukaryotic cells and its effect on cold stress tolerance of potato. Journal of Integrative Plant Biology, 52(3), 289-297.
17. Mohammadi, M., Kalateharabi, M., Hosseinpour, T. & Hassanpour Hosni, M. (2012). Release of new cultivar- karim, a new spring bread wheat cultivar for semi-tropical rainfed areas in Iran. Seed and Plant Production, 28 (2), 253-256.
18. Mahfoozi, S., Limin, A. E. & Fowler, D. B. (2001). Developmental regulation of low-temperature tolerance in winter wheat. Annual of Botany, 87, 751-757.
19. Mittler, R. (2002). Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance. Trends in Plant Science, 7(9), 405-410.
20. Monroy, A. F., Dryanova, A., Malette, B., Oren, D. H., Farajalla, M. R., Liu, W., Danyluk, J., Ubayasena L. W. C., Kane, K., Scoles, G. J., Sarhan, F. & Gulick, P. J. (2007). Regulatory gene candidates and gene expression analysis of cold acclimation in winter and spring wheat. Plant Molecular Biology, 64(4), 409-423.
21. Nazari, M., Amiri, R. M., Mehraban, F. H. & Khaneghah, H. Z. (2012). Change in antioxidant responses against oxidative damage in black chickpea following cold acclimation. Russian Journal of Plant Physiology, 59(2), 183-189.
22. Nejadsadeghi, L., Maali-Amiri, R., Zeinali, H., Ramezanpour, S. & Sadeghzade, B. (2014). Comparative analysis of physio-biochemical responses to cold stress in tetraploid and hexaploid wheat. Cell Biochemistry and Biophysics, 70(1), 399-408.
23. Nita, M. & Grzybowski, A. (2016). The role of the reactive oxygen species and oxidative stress in the pathomechanism of the age-related ocular diseases and other pathologies of the anterior and posterior eye segments in adults. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. Article ID 3164734, 23 pages. doi: 10.1155/2016/3164734.
24. Ranieri, A., Castagna, A., Pacini, J., Baldan, B., Mensuali Sodi, A. & Soldatini, G. F. (2003). Early production and scavenging of hydrogen peroxide in the apoplast of sunflower plants exposed to ozone. Journal of Experimental Botany, 54(392), 2529-2540.
25. Rostaii, M., Hassanpour Hosni, M., Esmailzad, H., Sadeghzadeh, D., Sadeghzadeh, B., Amiri, A., Eslami, R., Rezaii, R., Golkari, S., Soleimani, K., Abedi Asl, G., Rohi, E., Pashapour, H., Haghparast, R., Aghaee, M., Ahmadi, M. M., Daryaee, A., Afshari, F., Torabi, M., Dehghan, MA., Mardokhi, V., Hoshyar, R., Dadrezaii, S. T. & Ata Hosseini, S. M. (2015). Baran a new winter bread wheat cultivar for dryland condition in cold and moderate regions of Iran. Research Achievements for Field and Horticulture Crops, 3(4), 233-242.
26. Saglam, A., Saruhan, N., Terzi, R. & Kadioglu, A. (2011). The relations between antioxidant enzymes and chlorophyll fluorescence parameters in common bean cultivars differing in sensitivity to drought stress. Russian Journal of Plant Physiology, 58(1), 60-68.
27. Sairam, R. K. & Srivastava, G. C. (2001). Water stress tolerance of wheat (Triticum aestivum): Variations in hydrogen peroxide accumulation and antioxidant activity in tolerant and susceptible genotypes. Journal of Agronomy and Crop Science, 186(1), 63-70.
28. Terzi, R., Sağlam, A., Kutlu, N., Nar, H. & Kadioğlu, A. (2010). Impact of soil drought stress on photochemical efficiency of photosystem II and antioxidant enzyme activities of Phaseolus vulgarisTurkish Journal of Botany, 34(1), 1-10.
29. Thomashow, M. F. (1999). Plant cold acclimation: freezing tolerance genes and regulatory mechanisms. Annual Review Plant Physiology Plant Molecular Biology, 50, 571-599.
30. Türkan, I., Bor, M., Özdemir, F. & Koca, H. (2005). Differential responses of lipid peroxidation and antioxidants in the leaves of drought-tolerant acutifolius Gray and drought-sensitive P. vulgaris L. subjected to polyethylene glycol mediated water stress. Plant Science, 168(1), 223-231.
31. Winfield, M. O., Lu, C., Wilson, I. D., Coghill, J. A. & Edwards, K. J. (2010). Plant responses to cold: transcriptome analysis of wheat. Plant Biotechnology Journal, 8, 749-771.

[1] Reactive oxygen species

[2] Membrane stability index

[3] Malondialdehyde

[4] Superoxide dismutase

[5] Catalase

[6] Ascorbate peroxidase

[7] Guaiacol peroxidase