Document Type : Research Paper
Authors
1 Agronomy and Plant Breeding Departmnt, Faculty of Agriculture, University of Tehran, Iran
2 Plant Breeding and Biotechnology Department, University of Tabriz, Iran.
Abstract
Keywords
مقدمه
شوری از جمله مهمترین تنشهای محیطی به شمار میرود که رشد و تولید محصولات زراعی را تحت تأثیر قرار میدهد (Abdul-Jaleel et al., 2007). به شرایطی که در آن مقدار نمکهای محلول خاک تا حد زیانبار افزایش یابد و باعث بروز اثرات مضر در گیاهان شود، شوری گفته میشود .(Ates et al., 2007) حتی نمکهای ضروری نیز در غلظتهای بالا میتوانند سبب بروز اثرات تنش شوری شوند ( Sidari et al., 2008). املاح خاک با کاهش پتانسیل آب در محیط ریشه، جذب آب توسط گیاه را با محدودیت رو به رو میکنند و عملکرد طبیعی گیاه را دچار اختلال مینمایند
) (Mauromicale, & Licandro, 2002. میزان خسارت تنش شوری به ژنوتیپ و مراحل نموی گیاه و شدت و مدت زمان تنش بستگی دارد (Manchanda et al., 2008). تنش شوری تقریباً تمامی فرایندهای بیولوژیکی و فیزیولوژیکی اصلی گیاه از جمله فتوسنتز و رشد را در اندازههای مختلف تحت تأثیر قرار میدهد
(Parida & Das, 2005). کاهش رشد (Kerepesi & Galiba, 2000)، جوانهزنی (Patel et al., 2011) و میزان ماده خشک ریشه، ساقه و برگ در گیاهان تحت تنش شوری گزارش شده است (Huang et al., 2010). مطالعه شاخصهای مورفولوژیکی و فیزیولوژیکی گیاه در شرایط تنش شوری در محیط گلخانه میتواند در انتخاب گیاهان مقاوم به تنش سودمند باشد (Ashraf and Harris, 2004)، چراکه تغییرات مورفولوژیکی، حاصل تغییرات فیزیولوژیکی و متابولیکی گیاه است و میتواند بهمنظوربرای غربال اولیه گیاهان جهت بررسیهای بیشتر مورد استفاده قرار گیرد (Ahmad et al., 2005). محتوای پرولین و کلروفیل، از جمله صفات مورد استفاده برای انتخاب اولیه گیاهان متحمل به تنش شوری میباشد (Ashraf, 2001; Hester et al., 2001)، زیرا تحقیقات نشان دادهاند که بین این شاخصها و میزان تحمل به تنش شوری ارتباط وجود دارد؛ این روابط در محیط گلخانه نیز میتواند صادق باشد (Ashraf, 2004). عدس، یکی از مهمترین لگومها در سیستمهای کشت محسوب میشود که دانههای آن، سرشار از پروتئینهایی با کیفیت بالا برای بشر و کاه و کلش آن، غذای با ارزشی در تغذیه دامها میباشد (Katerji et al., 2001). با این که این گیاه به تنش شوری بسیار حساس است (Katerji et al., 2001)، اما بین ژنوتیپها و ارقام مختلف از نظر حساسیت به تنش شوری تفاوت وجود دارد؛ بنابراین برای مهندسی گیاهان متحمل به تنش شوری میتوان از تنوع موجود در ژنوتیپها بهره جست. برای این منظور، بررسی واکنش ژنوتیپهای مختلف در شرایط تنش شوری میتواند در شناسایی ژنوتیپهای برتر برای کارهای اصلاحی بسیار ارزشمند باشد. تحقیق حاضر، جهت مطالعه ژنوتیپهای عدس موجود در بانک ژن گروه زراعت و اصلاح نباتات پردیس کشاورزی دانشگاه تهران در شرایط تنش شوری انجام شد.
مواد و روشها
بهمنظور ارزیابی واکنش ژنوتیپهای مختلف عدس تحت شرایط تنش شوری، دو آزمایش جداگانه در گلخانه تحقیقاتی گروه زراعت و اصلاح نباتات پردیس کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه تهران انجام شد. هر دو آزمایش با چهار سطح تنش شوری، به صورت فاکتوریل و در قالب طرح کاملاً تصادفی در سه تکرار در بستر خاکی، در گلخانه های با دمای حدوداً c ˚25 با 16 ساعت روشنایی و هشت ساعت تاریکی انجام شد.
در مرحله اول، 43 ژنوتیپ عدس به همراه رقم زراعی مردم از محل بانک ژن پردیس کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه تهران- واقع در کرج، تهیه شد.
خاک مورد استفاده در مرحله اول، دارای شوری طبیعی با هدایت الکتریکی mS/cm 9/24 بود که از خاکهای شور شهرستان نظرآباد کرج تهیه شد. بهمنظور ایجاد سطوح مختلف شوری، خاک مذکور با خاک معمولی که دارای میزان هدایت الکتریکی برابر با mS/cm 78/3 بود، در نسبتهای وزنی دو به یک، یک به یک و یک به دو (بهترتیب خاک معمولی و خاک شور) مخلوط شد. خاکهای نهایی بهترتیب دارای هدایت الکتریکی mS/cm 78/3 (خاک شاهد)، 95/9، 14 و mS/cm 17 بودند. ضدعفونی بذرها با استفاده از هیپوکلرید سدیم پنج درصد انجام شد و بذرها در سینیهای مخصوص کاشته شدند. آبیاری بهصورت روزانه با 50 سیسی آب مقطر برای هر پلات انجام شد و شمارش بذرهای سبز شده، هر 24 ساعت و به مدت 14 روز متوالی صورت گرفت. تمامی نمونهها در روز پانزدهم برداشت شدند. طول ریشه و ساقه با استفاده از خطکش و وزن تر ساقه بلافاصله پس از برداشت، با ترازوی حساس اندازهگیری شد. وزن خشک ریشه و ساقه پس از خشککردن کامل در دمایc ˚70، با ترازوی حساس اندازهگیری شد. سپس با استفاده از فرمولهای زیر، مولفههایی نظیر شاخص بنیه گیاهچه (Abdul-Baki and Anderson, 1973) نیز محاسبه شد.
SVI= (A + B) × C
SL= RL+SL
در این معادلات، SVI: شاخص بنیه گیاهچه، A: میانگین طول ساقه اولیه، B: میانگین طول ریشه اولیه، C: درصد جوانهزنی نهایی، SL: طول گیاهچه، RL: طول ریشه و SL: طول ساقه است.
جدول 1- اسامی و منشاء ژنوتیپهای عدس مورد مطالعه در این پژوهش.
Table 1. Names and origin of lentil genotypes studied in this research
origin |
Genotypic code |
Number genotype in gene bank and paper |
origin |
Genotypic code |
Number genotype in gene bank and paper |
Syria |
33-ICARDA-ill6042 |
701 |
Syria |
33-ICA-63134 |
553 |
Syria |
33-ICA-ILL06235 |
703 |
Syria |
33-ICA-63119 |
559 |
Turkey |
33-153-26279-68 |
714 |
Syria |
33-ICA-63139 |
564 |
Syria |
33-ICARDA-ill4400 |
715 |
Syria |
33-ICA-63108 |
565 |
Lebanon |
33-058-ill851 |
717 |
Syria |
33-ICA-ill05747 |
588 |
Iran |
33-072-10706 |
719 |
Syria |
33-ICA-ill05753 |
606 |
Syria |
33-ICA-ILL4368 |
724 |
Syria |
33-146-05817 |
607 |
Syria |
33-ICA-ILL49 |
738 |
Syria |
33-ICA-ill04400 |
608 |
Iraq |
33-072-79SH4890 |
741 |
Iran |
33-071-ill05753 |
609 |
Iraq |
33-072-13621-153 |
742 |
Syria |
33-ICA-ill5748 |
613 |
Shooshtar |
33-071-10150 |
745 |
Syria |
33-ICA-ill5845 |
622 |
India |
33-069-00066 |
746 |
Syria |
33-ICA-ill6001 |
629 |
Chile |
33-032-10316 |
747 |
Syria |
33-ICA-ill6195 |
638 |
Chile |
33-032-10344 |
748 |
Syria |
33-ICA-ill6205 |
648 |
Ardebil |
33-071-10434 |
749 |
Syria |
33-ICA-ill-6206 |
649 |
Fars |
33-071-10646 |
752 |
Syria |
33-ICA-ill6212 |
655 |
Jiroft |
33-071-10919 |
753 |
Jordan |
33-079-ill5582 |
669 |
Azarbayejan |
33-071-10685 |
756 |
Syria |
33-ICA- ill5803 |
680 |
Fars |
33-071-10960 |
757 |
Syria |
33-071-10437 |
689 |
Isfahan |
33-071-11043-2 |
760 |
Syria |
33-ICA-ill5840 |
690 |
---- |
----- |
--- |
Syria |
696-ICARDA-ill6014 |
696 |
در مرحله دوم، سه ژنوتیپ منتخب از مرحله اول که بر اساس واکنش به تنش شوری کلاستربندی شده بودند، انتخاب و به همراه رقم زراعی مردم ارزیابی شدند. برخلاف مرحله اول، در این آزمایش، چهار سطح تیمار شوری (صفر، 60، 120 و 180 میلیمولار) بهطور مصنوعی از طریق حل کردن مقادیر مشخصی نمک طعام (NaCl) در آب مقطر تهیه شد. آبیاری پلاتها با استفاده از محلولهای نمکی صورت گرفت و پلاتهای شاهد با آب مقطر آبیاری شدند. تعداد 10 بذر در هر یک از پلاتها (گلدانها) در بستر خاک معمولی کشت شدند و شمارش بذرهای سبز شده بهطور روزانه تا 14 روز ادامه یافت. نمونهگیری در روز پانزدهم انجام شد و بعد از اندازهگیری وزن تر ریشه و ساقه با استفاده از ترازوی حساس و اندازهگیری طول ساقه با استفاده از خطکش، نمونهها در فویل بستهبندی شدند و به فریزر 70- درجه سانتیگراد منتقل شدند. جهت اندازهگیری محتوی پرولینِ اندام هوایی(Bates, 1937) ، یک دهم گرم از نمونههای اندام هوایی برداشته شد و پس از کوبیدن در نیتروژن مایع، با پنج میلیلیتر سولفوسالیسیلیک اسید سه درصد مخلوط شد. سپس نمونهها در سانتریفیوژ با سرعت 3000 دور در دقیقه در دمای اتاق به مدت پنج دقیقه قرار گرفت. سوپرناتانت حاصل با پنج میلیلیتر اسید استیک گلاسیال و پنج میلیلیتر نینهیدرین مخلوط شد. سپس نمونهها یک ساعت در حمام آب گرم قرار گرفتند و 10 میلیلیتر تولوئن به محلول اضافه شد و به مدت 20 ثانیه با ورتکس مخلوط شد. سپس مقادیر پرولین موجود در نمونهها با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 520 نانومتر خوانده شد. همچنین جهت استخراج و اندازهگیری میزان کلروفیل a و b، کلروفیل کل و کاروتنوئیدها، متناسب با پروتوکلهای مربوطه، مقدار مشخصی از نمونههای اندام هوایی در نیتروژن مایع در هاون کوبیده شد. بهمنظور استخراج کلروفیل و کاروتنوئید با روش استون (Arnon, 1967)، نیم گرم از ماده گیاهی با استفاده از نیتروژن مایع در هاون خرد شد و 20 میلیلیتر استون 80 درصد به نمونه اضافه شد و در سانتریفیوژ با سرعت 6000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه قرار گرفت. سپس مقداری از عصاره فوقانی در کووت اسپکتوفتومتر ریخته شد و میزان جذب عصاره استخراجشده در طول موجهای 645، 663 و 470 نانومتر، بهترتیب برای کلرفیل b، a و کاروتنوئید قرائت شد و با استفاده از روابط زیر، میزان کلروفیل a، b و کل و کاروتنوئید بر حسب میلیگرم بر گرم وزن تر ماده گیاهی محاسبه شد .(Arnon, 1967; Ebrahimi et al., 2016).
Chlorophyll a (mg/g) = ((12.7× A663) – (2.69 × A645)) ×V/1000 × W
Chlorophyll b (mg/g) = ((22.9× A645) – (4.69 × A663)) ×V/1000 × W
Total Chlorophyll (mg/g) = ((20.2× A645) – (8.02 × A663)) ×V/1000 × W
carotenoid (mg/g) = (100 (A470) - 3.27(mg chl. a) – 104(mg chl. b))/227
در روابط بالا، A: میزان جذب در طول موج مورد نظر، V: حجم نهایی استون 80 درصد بر حسب میلیلیتر و w: وزن برگ تازه برحسب گرم میباشد. برای تجزیه و تحلیل دادهها و در نهایت گروهبندی ژنوتیپهای عدس بر اساس واکنش در شرایط شوری، از روشهای چند متغیره آماری استفاده شد. روشهای آماری مورد استفاده، شامل تجزیه و تحلیل مولفههای اصلی برای تفسیر بهتر رفتار ژنوتیپها بود. برای تجزیه و تحلیلهای آماری و رسم نمودارها از نرمافزارهای MSTATC و Excel و برای مقایسه میانگین در آزمایش اول، از آزمون LSD و در آزمایش دوم، از آزمون دانکن در سطح احتمال پنج درصد استفاده شد. تجزیه خوشهای و تجزیه به مؤلفههای اصلی نیز با نرمافزار SPSS24 انجام شد.
نتایج و بحث
آزمایش اول
نتایج تجزیه واریانس صفات مورد بررسی در آزمایش اول (جدول 2) نشان داد که اثرات فاکتورهای A و B (بهترتیب ژنوتیپ و تنش) و همچنین اثرات متقابل آنها در سطح یک درصد برای کلیه صفات اندازهگیریشده معنیدار بود.
جدول 2- تجزیه واریانس صفات مورد مطالعه در 43 ژنوتیپ و رقم مردم عدس.
Table 2. Variance analysis of the studied traits of 43 genotypes and Mardom cultivar of lentil
Mean Square |
df |
S.O.V. |
|||||||
Seed vigor index |
Percentage of germination |
fresh weight shoot |
dry weight shoot |
dry weight root |
seedling length |
shoot length |
root length |
||
23336.3** |
1261.207** |
0.010** |
0.000** |
0.000** |
33.098** |
15.296** |
5.69** |
43 |
A Factor (Genotype) |
13873.88** |
54394.658** |
0.103** |
0.001** |
0.000** |
1348.579** |
536.704** |
193.9** |
3 |
B Factor (salinity) |
71856.05** |
625.592** |
0.001** |
0.000** |
0.000** |
5.669** |
2.634** |
1.529** |
129 |
AB |
38349.39 |
382.737 |
0.000 |
0.000 |
0.000 |
1.546 |
0.699 |
0.462 |
352 |
Error |
36.39 |
32.04 |
17.59 |
24.68 |
28.39 |
16.32 |
17.29 |
24.25 |
|
C.V (%) |
** معنیدار در سطح احتمال یک درصد
** Significant at %1 of probability level.
بررسی ترکیبات تیماری (جدول 3) نشان داد که با افزایش سطح تنش شوری در ژنوتیپهای مختلف، میزان خسارت نیز به صورت معنیداری افزایش پیدا کرد؛ این خسارت میتواند به دلیل اختلالات فیزیولوژیکی و فتوسنتزی ناشی از تنش شوری باشد ((Ashraf, 2008. همچنین مطابق با تحقیقات صورت گرفته، شوری از طریق کاهش تعداد و اندازه سلولها، باعث کاهش رشد و کاهش وزن خشک گیاه میشود .(Mirmohammady et al., 2002)
جدول 3- مقایسه میانگین اثر متقابل ژنوتیپها و سطوح تنش بر صفات اندازهگیری شده.
Table 3. Mean comparison of the interaction effects genotypes and stress levels on measured traits.
Genotype |
Stress* |
Root length (cm) |
Genotype |
Stress |
Shoot length (cm) |
Genotype |
Stress |
Seedling length (cm) |
Genotype |
Stress |
Dry weight root (g) |
Genotype |
Stress |
Dry weight shoot (g) |
Genotype |
Stress |
Fresh weight shoot (g) |
Genotype |
Stress |
Percentage of germination (%) |
Genotype |
Stress |
Seed vigor index |
724 |
1 |
7.05 |
747 |
1 |
8.97 |
719 |
1 |
15.5 |
607 |
1 |
0.0095 |
649 |
1 |
0.017 |
609 |
1 |
0.217 |
559 |
1 |
100 |
714 |
1 |
1433.3 |
719 |
1 |
6.7 |
719 |
1 |
8.75 |
756 |
1 |
14.75 |
724 |
1 |
0.0087 |
607 |
1 |
0.016 |
756 |
1 |
0.208 |
607 |
1 |
100 |
607 |
1 |
1300.8 |
724 |
2 |
6.66 |
756 |
1 |
8.67 |
714 |
1 |
14.33 |
M |
2 |
0.0082 |
747 |
1 |
0.016 |
773 |
1 |
0.201 |
629 |
1 |
100 |
669 |
1 |
1258. 9 |
756 |
1 |
6.08 |
649 |
1 |
8.25 |
747 |
1 |
14.092 |
756 |
1 |
0.008 |
756 |
1 |
0.0164 |
607 |
1 |
0.194 |
648 |
1 |
100 |
749 |
1 |
1250 |
M |
1 |
5.85 |
753 |
1 |
8.17 |
724 |
1 |
13.55 |
715 |
1 |
0.008 |
719 |
1 |
0.016 |
649 |
1 |
0.193 |
649 |
2 |
100 |
724 |
1 |
1220.13 |
565 |
1 |
5.83 |
745 |
1 |
8.083 |
649 |
1 |
13.375 |
715 |
2 |
0.0077 |
756 |
2 |
0.0159 |
747 |
1 |
0.193 |
669 |
1 |
100 |
719 |
1 |
1205. 6 |
742 |
1 |
5.82 |
588 |
1 |
8.017 |
M |
1 |
13.375 |
756 |
2 |
0.0076 |
753 |
1 |
0.0151 |
773 |
2 |
0.191 |
669 |
2 |
100 |
742 |
1 |
1191. 7 |
607 |
1 |
5.74 |
756 |
2 |
608 |
607 |
1 |
13.008 |
717 |
1 |
0.0076 |
588 |
1 |
0.0142 |
609 |
2 |
0.19 |
689 |
2 |
100 |
756 |
1 |
1152. 8 |
714 |
1 |
5.56 |
747 |
2 |
7.93 |
756 |
2 |
12.917 |
649 |
1 |
0.0076 |
559 |
1 |
0.0139 |
773 |
3 |
0.187 |
696 |
1 |
100 |
745 |
1 |
1126.4 |
649 |
1 |
5.12 |
608 |
1 |
7.83 |
745 |
1 |
12.625 |
747 |
1 |
0.0073 |
747 |
2 |
0.0138 |
741 |
1 |
0.183 |
703 |
1 |
100 |
703 |
1 |
1118.3 |
747 |
1 |
5.12 |
753 |
2 |
7.806 |
669 |
1 |
12.59 |
717 |
2 |
0.0072 |
689 |
1 |
0.0137 |
622 |
1 |
0.181 |
714 |
1 |
100 |
746 |
1 |
1105 |
741 |
1 |
5.08 |
714 |
1 |
7.76 |
749 |
1 |
12.5 |
719 |
1 |
0.007 |
741 |
1 |
0.0136 |
756 |
2 |
0.18 |
742 |
1 |
100 |
753 |
1 |
1099.4 |
749 |
1 |
5.08 |
669 |
1 |
7.756 |
724 |
2 |
12.33 |
M |
1 |
0.0065 |
753 |
3 |
0.0136 |
607 |
2 |
0.177 |
746 |
1 |
100 |
747 |
1 |
1091.9 |
689 |
1 |
4.91 |
747 |
3 |
7.75 |
753 |
1 |
12.32 |
649 |
2 |
0.0064 |
748 |
1 |
0.01345 |
719 |
1 |
0.177 |
749 |
1 |
100 |
M |
1 |
1040.3 |
756 |
2 |
4.91 |
608 |
2 |
7.63 |
714 |
3 |
12.17 |
689 |
1 |
0.0062 |
747 |
3 |
0.0134 |
607 |
3 |
0.172 |
752 |
1 |
100 |
648 |
1 |
1028.3 |
....... |
|||||||||||||||||||||||
690 |
4 |
0.62 |
559 |
4 |
1 |
690 |
4 |
1.87 |
648 |
3 |
0.000833 |
771 |
4 |
0.0019 |
690 |
4 |
0.05 |
648 |
4 |
22.1 |
690 |
4 |
62.3 |
655 |
4 |
0.58 |
714 |
4 |
1 |
742 |
4 |
1.62 |
773 |
4 |
0.0008 |
559 |
3 |
0.0018 |
742 |
4 |
0.05 |
690 |
4 |
22.1 |
559 |
4 |
51.2 |
714 |
4 |
0.5 |
771 |
4 |
0.875 |
771 |
4 |
1.62 |
742 |
4 |
0.00075 |
655 |
4 |
0.0015 |
771 |
4 |
0.0475 |
559 |
4 |
22 |
742 |
4 |
41.5 |
773 |
4 |
0.5 |
559 |
3 |
0.83 |
714 |
4 |
1.5 |
771 |
4 |
0.00067 |
742 |
4 |
0.0012 |
773 |
4 |
0.047 |
714 |
4 |
22 |
714 |
4 |
38.8 |
742 |
4 |
0.37 |
773 |
4 |
0.611 |
773 |
4 |
1.11 |
648 |
4 |
0.0006 |
773 |
4 |
0.001 |
714 |
4 |
0.0375 |
742 |
4 |
22 |
773 |
4 |
37 |
638 |
2 |
0 |
638 |
2 |
0 |
638 |
2 |
0 |
638 |
2 |
0 |
638 |
2 |
0 |
638 |
2 |
0 |
638 |
2 |
0 |
638 |
2 |
0 |
638 |
3 |
0 |
638 |
3 |
0 |
638 |
3 |
0 |
638 |
3 |
0 |
638 |
3 |
0 |
638 |
3 |
0 |
638 |
3 |
0 |
638 |
3 |
0 |
638 |
4 |
0 |
638 |
4 |
0 |
638 |
4 |
0 |
638 |
4 |
0 |
638 |
4 |
0 |
638 |
4 |
0 |
638 |
4 |
0 |
638 |
4 |
0 |
689 |
4 |
0 |
689 |
4 |
0 |
689 |
4 |
0 |
689 |
4 |
0 |
689 |
4 |
0 |
689 |
4 |
0 |
689 |
4 |
0 |
689 |
4 |
0 |
715 |
4 |
0 |
715 |
4 |
0 |
715 |
4 |
0 |
715 |
4 |
0 |
715 |
4 |
0 |
715 |
4 |
0 |
715 |
4 |
0 |
715 |
4 |
0 |
LSD |
0.392 |
|
|
0.4826 |
|
|
0.7178 |
|
|
0.0006 |
|
|
0.0012 |
|
|
0.0123 |
|
|
11.295 |
|
|
113.06 |
* سطوح تنش شوری: شماره 1: خاک معمولی با هدایت الکتریکی mS/cm78/3، شماره 2: خاک با هدایت الکتریکی mS/cm 95/9، شماره 3: خاک با هدایت الکتریکی mS/cm 14و شماره 4: خاک با هدایت الکتریکی mS/cm 17
Salt stress levels: 1) normal soil, EC=3.78 mS/cm; 2) soil, EC=9.95 mS/cm; 3) soil, EC=14 mS/cm and 4) soil, EC=17 mS/cm.
بهمنظور ارزیابی تنوع ژنتیکی و دستهبندی ژنوتیپها، از روشهای تجزیه به مولفههای اصلی و تجزیه خوشهای استفاده شد. ژنوتیپهای مورد مطالعه با استفاده از الگوریتم WARD تجزیه خوشهای و میانگین دادههای کلیه صفات، گروهبندی شدند (شکل 1). برای تعیین محل برش دندوگرام نیز تجزیه تابع تشخیص انجام شد (جدول 4).
جدول 4- تجزیه تابع تشخیص برای تعیین برش دندروگرام حاصل از تجزیه خوشهای بر اساس کلیه صفات در 44 ژنوتیپ عدس
Table 4. Discriminant function analysis to determine the location of the dendrogram cutting
group |
p-value |
Wilks,lambda |
Chi-Square |
2 |
0.000 |
0.302 |
147.156 |
3 |
0.000 |
0.550 |
73.546 |
4 |
0.004 |
0.771 |
31.931 |
5 |
0.578 |
0.962 |
4.738 |
بر اساس نتایج تجزیه تابع تشخیص، نمودار دندوگرام برش یافته و چهار گروه ژنوتیپی بهدست آمد. گروه اول شامل ژنوتیپهای 608، مردم، 745، 715، 753، 719، 746، 747، 749، 748، 669، 724؛ گروه دوم شامل ژنوتیپهای 609، 680، 689، 564؛ گروه سوم شامل ژنوتیپهای 622، 771، 629، 717، 773، 553، 741، 760، 559، 613، 565، 655، 738، 606، 701، 690، 696 و گروه چهارم شامل ژنوتیپهای 648، 756، 742، 588، 703، 752، 757، 607، 649، 714 و 638 بودند. همچنین تجزیه به مولفههای اصلی در 44 ژنوتیپ مورد ارزیابی، بر اساس صفات مورد مطالعه نشان داد که حدود 86 درصد از تغییرات کل، توسط دو مولفه اصلی اول توجیه شد (جدول 5).
جدول 5- مقادیر ویژه و درصد واریانس تجمعی در تجزیه به مولفههای اصلی برای ژنوتیپهای مورد مطالعه.
Table 5. Eigenvalues and cumulative variance percentage in the principal components analysis for all genotypes.
Principal Component |
eigenvalues |
Variance% |
Percent of the total variance |
1 |
7.043 |
78.253 |
78.253 |
2 |
0.718 |
7.975 |
86.228 |
3 |
0.433 |
4.809 |
91.037 |
4 |
0.361 |
4.007 |
95.004 |
5 |
0.249 |
2.771 |
97.815 |
6 |
0.146 |
1.627 |
99.442 |
7 |
0.047 |
0.522 |
99.964 |
8 |
0.003 |
0.036 |
100 |
شکل 1- دندوگرام حاصل از تجزیهی خوشهای 44 ژنوتیپ عدس با استفاده از روش Ward.
Figure 1. The cluster analysis dendrogram of 44 genotypes of lentil using Ward method.
به طور کلی نتایج تجزیه واریانس آزمایش اول، بیانگر وجود تنوع ژنتیکی بالا در بین ژنوتیپها بود. با توجه به نتایج دیاگرام تجزیه خوشهای در آزمایش اول، از هر خوشه، یک ژنوتیپ شامل ژنوتیپهای 696، 753 و 638 به همراه رقم زراعی مردم برای انجام مطالعات بیشتر و مقایسه فیزیولوژیک انتخاب شدند.
آزمایش دوم
در تجزیه واریانس صفات مورد بررسی در آزمایش دوم برخلاف آزمایش اول، تنها اثرات متقابل بر صفات وزن تر ساقه، ریشه و گیاهچه معنیدار شدبهدست و در بقیه صفات، مقایسه میانگین برای اثرات اصلی صورت گرفت (جدول 6).
جدول 6- تجزیه واریانس صفات مورد مطالعه در سه ژنوتیپ و رقم مردم عدس.
Table 6. Variance analysis of studied traits in 3 genotypes and Mardom cultivar of lentil.
Mean Square |
df |
S.O.V. |
||||||||||
Prolin content |
Carotenoid content |
Total Ch. content |
Ch. A.B content |
Ch. A/B content |
Ch. B content |
Ch. α A content |
Fresh weight seedling (g) |
Fresh weight root (g) |
Fresh weight shoot (g) |
Shoot length(cm) |
||
0.00001* |
0.11** |
20.87** |
0.001** |
0.16** |
0.005** |
0.007** |
0.24** |
0.055** |
0.079** |
53.59** |
3 |
A Factor (Genotype) |
0.00001** |
0.183** |
49.56** |
0.002** |
0.4** |
0.01** |
0.017** |
0.43** |
0.28** |
0.017** |
18.05** |
3 |
B Factor (salinity) |
0.000004ns |
0.02ns |
3.44ns |
0.00001ns |
0.07ns |
0.001ns |
0.001ns |
0.011** |
0.01** |
0.002** |
0.87ns |
9 |
AB |
0.000005 |
0.017 |
2.331 |
0.00008 |
0.04 |
0.001 |
0.001 |
0.002 |
0.001 |
0.0001 |
0.51 |
32 |
Error |
9.72 |
15.2 |
15.29 |
27.73 |
9.37 |
25.86 |
12.6 |
4.97 |
5.46 |
3.11 |
5.71 |
|
C.V (%) |
: کلروفیل.
α: Chlorophyll
** ، * و ns: بهترتیب معنیدار در سطوح احتمال یک و پنج درصد و عدم معنیدار.
**,* and ns: Significant at %1 and %5 of probability levels and non significant, respectively.
نتایج مقایسات میانگین نشان داد که با افزایش میزان شوری، وزن تر ساقه، ریشه , گیاهچه (شکل 2) و طول ساقه (شکل a 3) و بهطورکلی رشد گیاه به صورت معنیداری در سه ژنوتیپ مورد بررسی و رقم مردم کاهش یافت. کمترین مقدار سه صفت اول در ژنوتیپ 753 و تنش mM 180 و بیشترین آنها در ژنوتیپ 696 و شرایط بدون تنش مشاهده شد. کمترین و بیشترین طول ساقه نیز بهترتیب در ژنوتیپهای 735 و 696 بهدست آمد (شکل b 3،). این کاهش در رشد میتواند به دلیل کاهش سطح برگ و در نتیجه از بین رفتن سطح فتوسنتز کننده گیاه باشد .( Shannon, 1986; Garg et al., 2001) همچنین کاهش سطح فتوسنتزکننده، موجب کاهش وزن تر گیاهچه و زیستتوده گیاه نیز میشود ((Kerepesi et al., 2000; Parida et al., 2005.
در این آزمایش، با افزایش میزان شوری از صفر به 180 میلیمولار، علاوه بر سه صفت فوق، میزان کلروفیل کل ژنوتیپها نیز کاهش معنیداری یافت. محتوای کلروفیل کل در ژنوتیپ 753 به صورت معنیداری کمتر از ژنوتیپهای دیگر بهدستبود، درحالیکه سه ژنوتیپ دیگر، اختلاف معنیدار با هم نداشتند (شکل 4). نتایج مربوط به تجزیه میانگین برای کلروفیل a، b، a/b و a.b نیز بهترتیب در قسمتهای a، b، c و d شکل 5 آورده شده است. تنش شوری، موجب کاهش معنیدار این صفات نسبت به حالت نرمال شد و کمترین میزان این پارامترها در ژنوتیپ 753 بهدست آمد.
تغییرات کاروتنوئیدها نیز مشابه با تغییرات کلروفیلها بود (شکل 6a ). کاروتنوئیدها یکی از رنگدانههای مهم دستگاه آنتیاکسیدانی گیاهان میباشند که به تخریب اکسیداتیو بسیار حساس هستند .(Havaux, 1998) کلروفیل نیز بهعنوان رنگدانه اصلی فتوسنتزی، دارای نقش اساسی در میزان تولید انرژی و رشد گیاه است. مطابق با تحقیقات صورت گرفته، این رنگدانهها متأثر از تنش شوری میباشند، بهطوریکه تأثیر منفی تنش شوری بر میزان رنگدانههای فتوسنتزی در گیاه نخود گزارش شده است (.(Mudgal, et al., 2009 متناسب با افزایش میزان شوری از تیمار صفر به 180 میلیمولار، غلظت پرولین نیز افزایش معنیدار نشان داد (نمودار b6). در شرایط تنش شوری، یکی از راهکارهای اصلیِ گیاه برای تعدیل تنش اسمزی، تولید مواد متابولیکی آلی از جمله پرولین، بتائین و ساکارز در گیاه میباشد (Flowers et al., 1977; Greenway et al., 1980). پرولین علاوه بر نقش اسمزی، بهعنوان یک عامل محافظتکننده از آنزیمها و ساختارهای درون سلولی عمل میکند و در مقابله با رادیکالهای آزاد نیز نقش دارد و همچنین در شرایط تنش، بهعنوان یک ترکیب ذخیرهای برای کربن و نیتروژن محسوب میشود (Lutts et al., 1996).
|
|||
«a» |
|||
«b» |
|||
«c» |
شکل 2- تأثیر سطوح مختلف تنش شوری بر وزن تر ساقه (a)، ریشه (b) و گیاهچه (c) در ژنوتیپهای مورد مطالعه.
در هر نمودار، ستونهای دارای حروف مشابه، اختلاف آماری معنیداری ندارند.
Figure 2. Effect of different level of salinity stress on shoot (a), root (b) and seedling (c) fresh weights in studied genotypes.In each graph, columns with similar letters are not statistically significant different.
شکل 3- تأثیر سطوح مختلف تنش شوری و ژنوتیپ بر طول ساقه گیاه.در هر نمودار، ستونهایی با حروف مشابه اختلاف آماری معنیداری ندارند.
.Figure 3. Effect of different levels of salinity stress and genotypes on shoot length. In each graph, columns with similar letters are not statistically significant different.
شکل 4- تأثیر سطوح مختلف شوری و ژنوتیپ بر محتوای کل کلروفیل. در هر نمودار، ستونهایی با حروف مشابه، اختلاف آماری معنیداری ندارند.
Figure 4. Effect of different levels of salinity stress and genotypes on total Chlorophyll content.
In each graph, columns with similar letters are not statistically significant different.
در آزمایش اول گفته شد که کاهش رشد گیاهان تحت تنش شوری، احتمالاً به دلیل اختلال در فرآیندهای فیزیولوژیک باشد که این فرضیه در آزمایش دوم بررسی و تایید شد.
نتیجهگیری کلی
رقم مردم، یکی از ارقام مورد کشت عدس توسط زارعین میباشد که در این پروژه، بهعنوان معیاری برای سنجش ژنوتیپها استفاده شد. با توجه به نتایج این پژوهش، بسیاری از ژنوتیپها در سطوح مختلف تنش، خسارت کمتری در صفات مورفولوژیک و فیزیولوژیک نسبت به این رقم نشان دادند. البته جهت انتخاب مطمئن ژنوتیپهای مقاوم به تنش شوری، به مطالعات بیشتر در سطوح مختلف فیزیولوژیک و مولکولی نیاز است تا بتوان با اطمینان بیشتری اقدام به انتخاب ژنوتیپهای برتر نمود. بهطورکلی نتایج این پروژه نشان میدهد که ژنوتیپهای موجود در بانکهای بذری کشور میتوانند پتانسیل خوبی برای ارزیابی و شناسایی ژنوتیپهای مقاوم به تنشهای مختلف از جمله تنش شوری باشند. با ارزیابیهای بیشتر و دقیقتر بر روی این ژنوتیپها میتوان ژنوتیپهای مقاومی را یافت که در کارهای اصلاحی و تولید ارقام با عملکرد بیشتر در شرایط تنش بسیار مفید باشد.
سپاسگزاری
با سپاس فراوان از آقای مهندس محمد انتصاری، آقای مهندس میثم ملکپور و آقای مهندس حمید فضلی و مسئولین بانک ژن به ویژه جناب آقای قدردان، آقای دشتکی، آقای صادقی و آقای محمدی که در انجام این پروژه ما را یاری کردند.
«a» |
|
«b» |
|
«c» |
|
«d» |
شکل 5- تأثیر سطوح مختلف تنش شوری و ژنوتیپ بر میزان کلروفیل A (a)، B (b)، A/B (c) و A.B (d). در هر نمودار، ستونهایی با حروف مشابه، اختلاف آماری معنیداری ندارند.
Figure 5. Effect of different levels of salinity stress and genotypes on chlorophyll a (a), chlorophyll b (b), chlorophyll a/b (c) and chlorophyll a.b (d) contents. In each graph, columns with similar letters are not statistically significant different.
«a» |
|
«b» |
شکل 6- تأثیر سطوح مختلف شوری و ژنوتیپ بر محتوای کارتنوئید (a) و پرولین (b). در هر نمودار، ستونهایی با حروف مشابه، اختلاف آماری معنیداری ندارند.
Figure 6. Effect of different levels of salinity stress and genotypes on carotenoid (a) and prolin (b) contents. In each graph, columns with similar letters are not statistically significant different.
REFERENCES
(Abdul-Jaleel et al., 2007). به شرایطی که در آن مقدار نمکهای محلول خاک تا حد زیانبار افزایش یابد و باعث بروز اثرات مضر در گیاهان شود، شوری گفته میشود .(Ates et al., 2007) حتی نمکهای ضروری نیز در غلظتهای بالا میتوانند سبب بروز اثرات تنش شوری شوند ( Sidari et al., 2008). املاح خاک با کاهش پتانسیل آب در محیط ریشه، جذب آب توسط گیاه را با محدودیت رو به رو میکنند و عملکرد طبیعی گیاه را دچار اختلال مینمایند
) (Mauromicale, & Licandro, 2002. میزان خسارت تنش شوری به ژنوتیپ و مراحل نموی گیاه و شدت و مدت زمان تنش بستگی دارد (Manchanda et al., 2008). تنش شوری تقریباً تمامی فرایندهای بیولوژیکی و فیزیولوژیکی اصلی گیاه از جمله فتوسنتز و رشد را در اندازههای مختلف تحت تأثیر قرار میدهد
(Parida & Das, 2005). کاهش رشد (Kerepesi & Galiba, 2000)، جوانهزنی (Patel et al., 2011) و میزان ماده خشک ریشه، ساقه و برگ در گیاهان تحت تنش شوری گزارش شده است (Huang et al., 2010). مطالعه شاخصهای مورفولوژیکی و فیزیولوژیکی گیاه در شرایط تنش شوری در محیط گلخانه میتواند در انتخاب گیاهان مقاوم به تنش سودمند باشد (Ashraf and Harris, 2004)، چراکه تغییرات مورفولوژیکی، حاصل تغییرات فیزیولوژیکی و متابولیکی گیاه است و میتواند بهمنظوربرای غربال اولیه گیاهان جهت بررسیهای بیشتر مورد استفاده قرار گیرد (Ahmad et al., 2005). محتوای پرولین و کلروفیل، از جمله صفات مورد استفاده برای انتخاب اولیه گیاهان متحمل به تنش شوری میباشد (Ashraf, 2001; Hester et al., 2001)، زیرا تحقیقات نشان دادهاند که بین این شاخصها و میزان تحمل به تنش شوری ارتباط وجود دارد؛ این روابط در محیط گلخانه نیز میتواند صادق باشد (Ashraf, 2004). عدس، یکی از مهمترین لگومها در سیستمهای کشت محسوب میشود که دانههای آن، سرشار از پروتئینهایی با کیفیت بالا برای بشر و کاه و کلش آن، غذای با ارزشی در تغذیه دامها میباشد (Katerji et al., 2001). با این که این گیاه به تنش شوری بسیار حساس است (Katerji et al., 2001)، اما بین ژنوتیپها و ارقام مختلف از نظر حساسیت به تنش شوری تفاوت وجود دارد؛ بنابراین برای مهندسی گیاهان متحمل به تنش شوری میتوان از تنوع موجود در ژنوتیپها بهره جست. برای این منظور، بررسی واکنش ژنوتیپهای مختلف در شرایط تنش شوری میتواند در شناسایی ژنوتیپهای برتر برای کارهای اصلاحی بسیار ارزشمند باشد. تحقیق حاضر، جهت مطالعه ژنوتیپهای عدس موجود در بانک ژن گروه زراعت و اصلاح نباتات پردیس کشاورزی دانشگاه تهران در شرایط تنش شوری انجام شد.
مواد و روشها
بهمنظور ارزیابی واکنش ژنوتیپهای مختلف عدس تحت شرایط تنش شوری، دو آزمایش جداگانه در گلخانه تحقیقاتی گروه زراعت و اصلاح نباتات پردیس کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه تهران انجام شد. هر دو آزمایش با چهار سطح تنش شوری، به صورت فاکتوریل و در قالب طرح کاملاً تصادفی در سه تکرار در بستر خاکی، در گلخانه های با دمای حدوداً c ˚25 با 16 ساعت روشنایی و هشت ساعت تاریکی انجام شد.
در مرحله اول، 43 ژنوتیپ عدس به همراه رقم زراعی مردم از محل بانک ژن پردیس کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه تهران- واقع در کرج، تهیه شد.
خاک مورد استفاده در مرحله اول، دارای شوری طبیعی با هدایت الکتریکی mS/cm 9/24 بود که از خاکهای شور شهرستان نظرآباد کرج تهیه شد. بهمنظور ایجاد سطوح مختلف شوری، خاک مذکور با خاک معمولی که دارای میزان هدایت الکتریکی برابر با mS/cm 78/3 بود، در نسبتهای وزنی دو به یک، یک به یک و یک به دو (بهترتیب خاک معمولی و خاک شور) مخلوط شد. خاکهای نهایی بهترتیب دارای هدایت الکتریکی mS/cm 78/3 (خاک شاهد)، 95/9، 14 و mS/cm 17 بودند. ضدعفونی بذرها با استفاده از هیپوکلرید سدیم پنج درصد انجام شد و بذرها در سینیهای مخصوص کاشته شدند. آبیاری بهصورت روزانه با 50 سیسی آب مقطر برای هر پلات انجام شد و شمارش بذرهای سبز شده، هر 24 ساعت و به مدت 14 روز متوالی صورت گرفت. تمامی نمونهها در روز پانزدهم برداشت شدند. طول ریشه و ساقه با استفاده از خطکش و وزن تر ساقه بلافاصله پس از برداشت، با ترازوی حساس اندازهگیری شد. وزن خشک ریشه و ساقه پس از خشککردن کامل در دمایc ˚70، با ترازوی حساس اندازهگیری شد. سپس با استفاده از فرمولهای زیر، مولفههایی نظیر شاخص بنیه گیاهچه (Abdul-Baki and Anderson, 1973) نیز محاسبه شد.
SVI= (A + B) × C
SL= RL+SL
در این معادلات، SVI: شاخص بنیه گیاهچه، A: میانگین طول ساقه اولیه، B: میانگین طول ریشه اولیه، C: درصد جوانهزنی نهایی، SL: طول گیاهچه، RL: طول ریشه و SL: طول ساقه است.
جدول 1- اسامی و منشاء ژنوتیپهای عدس مورد مطالعه در این پژوهش.
Table 1. Names and origin of lentil genotypes studied in this research
origin |
Genotypic code |
Number genotype in gene bank and paper |
origin |
Genotypic code |
Number genotype in gene bank and paper |
Syria |
33-ICARDA-ill6042 |
701 |
Syria |
33-ICA-63134 |
553 |
Syria |
33-ICA-ILL06235 |
703 |
Syria |
33-ICA-63119 |
559 |
Turkey |
33-153-26279-68 |
714 |
Syria |
33-ICA-63139 |
564 |
Syria |
33-ICARDA-ill4400 |
715 |
Syria |
33-ICA-63108 |
565 |
Lebanon |
33-058-ill851 |
717 |
Syria |
33-ICA-ill05747 |
588 |
Iran |
33-072-10706 |
719 |
Syria |
33-ICA-ill05753 |
606 |
Syria |
33-ICA-ILL4368 |
724 |
Syria |
33-146-05817 |
607 |
Syria |
33-ICA-ILL49 |
738 |
Syria |
33-ICA-ill04400 |
608 |
Iraq |
33-072-79SH4890 |
741 |
Iran |
33-071-ill05753 |
609 |
Iraq |
33-072-13621-153 |
742 |
Syria |
33-ICA-ill5748 |
613 |
Shooshtar |
33-071-10150 |
745 |
Syria |
33-ICA-ill5845 |
622 |
India |
33-069-00066 |
746 |
Syria |
33-ICA-ill6001 |
629 |
Chile |
33-032-10316 |
747 |
Syria |
33-ICA-ill6195 |
638 |
Chile |
33-032-10344 |
748 |
Syria |
33-ICA-ill6205 |
648 |
Ardebil |
33-071-10434 |
749 |
Syria |
33-ICA-ill-6206 |
649 |
Fars |
33-071-10646 |
752 |
Syria |
33-ICA-ill6212 |
655 |
Jiroft |
33-071-10919 |
753 |
Jordan |
33-079-ill5582 |
669 |
Azarbayejan |
33-071-10685 |
756 |
Syria |
33-ICA- ill5803 |
680 |
Fars |
33-071-10960 |
757 |
Syria |
33-071-10437 |
689 |
Isfahan |
33-071-11043-2 |
760 |
Syria |
33-ICA-ill5840 |
690 |
---- |
----- |
--- |
Syria |
696-ICARDA-ill6014 |
696 |
در مرحله دوم، سه ژنوتیپ منتخب از مرحله اول که بر اساس واکنش به تنش شوری کلاستربندی شده بودند، انتخاب و به همراه رقم زراعی مردم ارزیابی شدند. برخلاف مرحله اول، در این آزمایش، چهار سطح تیمار شوری (صفر، 60، 120 و 180 میلیمولار) بهطور مصنوعی از طریق حل کردن مقادیر مشخصی نمک طعام (NaCl) در آب مقطر تهیه شد. آبیاری پلاتها با استفاده از محلولهای نمکی صورت گرفت و پلاتهای شاهد با آب مقطر آبیاری شدند. تعداد 10 بذر در هر یک از پلاتها (گلدانها) در بستر خاک معمولی کشت شدند و شمارش بذرهای سبز شده بهطور روزانه تا 14 روز ادامه یافت. نمونهگیری در روز پانزدهم انجام شد و بعد از اندازهگیری وزن تر ریشه و ساقه با استفاده از ترازوی حساس و اندازهگیری طول ساقه با استفاده از خطکش، نمونهها در فویل بستهبندی شدند و به فریزر 70- درجه سانتیگراد منتقل شدند. جهت اندازهگیری محتوی پرولینِ اندام هوایی(Bates, 1937) ، یک دهم گرم از نمونههای اندام هوایی برداشته شد و پس از کوبیدن در نیتروژن مایع، با پنج میلیلیتر سولفوسالیسیلیک اسید سه درصد مخلوط شد. سپس نمونهها در سانتریفیوژ با سرعت 3000 دور در دقیقه در دمای اتاق به مدت پنج دقیقه قرار گرفت. سوپرناتانت حاصل با پنج میلیلیتر اسید استیک گلاسیال و پنج میلیلیتر نینهیدرین مخلوط شد. سپس نمونهها یک ساعت در حمام آب گرم قرار گرفتند و 10 میلیلیتر تولوئن به محلول اضافه شد و به مدت 20 ثانیه با ورتکس مخلوط شد. سپس مقادیر پرولین موجود در نمونهها با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 520 نانومتر خوانده شد. همچنین جهت استخراج و اندازهگیری میزان کلروفیل a و b، کلروفیل کل و کاروتنوئیدها، متناسب با پروتوکلهای مربوطه، مقدار مشخصی از نمونههای اندام هوایی در نیتروژن مایع در هاون کوبیده شد. بهمنظور استخراج کلروفیل و کاروتنوئید با روش استون (Arnon, 1967)، نیم گرم از ماده گیاهی با استفاده از نیتروژن مایع در هاون خرد شد و 20 میلیلیتر استون 80 درصد به نمونه اضافه شد و در سانتریفیوژ با سرعت 6000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه قرار گرفت. سپس مقداری از عصاره فوقانی در کووت اسپکتوفتومتر ریخته شد و میزان جذب عصاره استخراجشده در طول موجهای 645، 663 و 470 نانومتر، بهترتیب برای کلرفیل b، a و کاروتنوئید قرائت شد و با استفاده از روابط زیر، میزان کلروفیل a، b و کل و کاروتنوئید بر حسب میلیگرم بر گرم وزن تر ماده گیاهی محاسبه شد .(Arnon, 1967; Ebrahimi et al., 2016).
Chlorophyll a (mg/g) = ((12.7× A663) – (2.69 × A645)) ×V/1000 × W
Chlorophyll b (mg/g) = ((22.9× A645) – (4.69 × A663)) ×V/1000 × W
Total Chlorophyll (mg/g) = ((20.2× A645) – (8.02 × A663)) ×V/1000 × W
carotenoid (mg/g) = (100 (A470) - 3.27(mg chl. a) – 104(mg chl. b))/227
در روابط بالا، A: میزان جذب در طول موج مورد نظر، V: حجم نهایی استون 80 درصد بر حسب میلیلیتر و w: وزن برگ تازه برحسب گرم میباشد. برای تجزیه و تحلیل دادهها و در نهایت گروهبندی ژنوتیپهای عدس بر اساس واکنش در شرایط شوری، از روشهای چند متغیره آماری استفاده شد. روشهای آماری مورد استفاده، شامل تجزیه و تحلیل مولفههای اصلی برای تفسیر بهتر رفتار ژنوتیپها بود. برای تجزیه و تحلیلهای آماری و رسم نمودارها از نرمافزارهای MSTATC و Excel و برای مقایسه میانگین در آزمایش اول، از آزمون LSD و در آزمایش دوم، از آزمون دانکن در سطح احتمال پنج درصد استفاده شد. تجزیه خوشهای و تجزیه به مؤلفههای اصلی نیز با نرمافزار SPSS24 انجام شد.
نتایج و بحث
آزمایش اول
نتایج تجزیه واریانس صفات مورد بررسی در آزمایش اول (جدول 2) نشان داد که اثرات فاکتورهای A و B (بهترتیب ژنوتیپ و تنش) و همچنین اثرات متقابل آنها در سطح یک درصد برای کلیه صفات اندازهگیریشده معنیدار بود.
جدول 2- تجزیه واریانس صفات مورد مطالعه در 43 ژنوتیپ و رقم مردم عدس.
Table 2. Variance analysis of the studied traits of 43 genotypes and Mardom cultivar of lentil
Mean Square |
df |
S.O.V. |
|||||||
Seed vigor index |
Percentage of germination |
fresh weight shoot |
dry weight shoot |
dry weight root |
seedling length |
shoot length |
root length |
||
23336.3** |
1261.207** |
0.010** |
0.000** |
0.000** |
33.098** |
15.296** |
5.69** |
43 |
A Factor (Genotype) |
13873.88** |
54394.658** |
0.103** |
0.001** |
0.000** |
1348.579** |
536.704** |
193.9** |
3 |
B Factor (salinity) |
71856.05** |
625.592** |
0.001** |
0.000** |
0.000** |
5.669** |
2.634** |
1.529** |
129 |
AB |
38349.39 |
382.737 |
0.000 |
0.000 |
0.000 |
1.546 |
0.699 |
0.462 |
352 |
Error |
36.39 |
32.04 |
17.59 |
24.68 |
28.39 |
16.32 |
17.29 |
24.25 |
|
C.V (%) |
** معنیدار در سطح احتمال یک درصد
** Significant at %1 of probability level.
بررسی ترکیبات تیماری (جدول 3) نشان داد که با افزایش سطح تنش شوری در ژنوتیپهای مختلف، میزان خسارت نیز به صورت معنیداری افزایش پیدا کرد؛ این خسارت میتواند به دلیل اختلالات فیزیولوژیکی و فتوسنتزی ناشی از تنش شوری باشد ((Ashraf, 2008. همچنین مطابق با تحقیقات صورت گرفته، شوری از طریق کاهش تعداد و اندازه سلولها، باعث کاهش رشد و کاهش وزن خشک گیاه میشود .(Mirmohammady et al., 2002)
جدول 3- مقایسه میانگین اثر متقابل ژنوتیپها و سطوح تنش بر صفات اندازهگیری شده.
Table 3. Mean comparison of the interaction effects genotypes and stress levels on measured traits.
Genotype |
Stress* |
Root length (cm) |
Genotype |
Stress |
Shoot length (cm) |
Genotype |
Stress |
Seedling length (cm) |
Genotype |
Stress |
Dry weight root (g) |
Genotype |
Stress |
Dry weight shoot (g) |
Genotype |
Stress |
Fresh weight shoot (g) |
Genotype |
Stress |
Percentage of germination (%) |
Genotype |
Stress |
Seed vigor index |
724 |
1 |
7.05 |
747 |
1 |
8.97 |
719 |
1 |
15.5 |
607 |
1 |
0.0095 |
649 |
1 |
0.017 |
609 |
1 |
0.217 |
559 |
1 |
100 |
714 |
1 |
1433.3 |
719 |
1 |
6.7 |
719 |
1 |
8.75 |
756 |
1 |
14.75 |
724 |
1 |
0.0087 |
607 |
1 |
0.016 |
756 |
1 |
0.208 |
607 |
1 |
100 |
607 |
1 |
1300.8 |
724 |
2 |
6.66 |
756 |
1 |
8.67 |
714 |
1 |
14.33 |
M |
2 |
0.0082 |
747 |
1 |
0.016 |
773 |
1 |
0.201 |
629 |
1 |
100 |
669 |
1 |
1258. 9 |
756 |
1 |
6.08 |
649 |
1 |
8.25 |
747 |
1 |
14.092 |
756 |
1 |
0.008 |
756 |
1 |
0.0164 |
607 |
1 |
0.194 |
648 |
1 |
100 |
749 |
1 |
1250 |
M |
1 |
5.85 |
753 |
1 |
8.17 |
724 |
1 |
13.55 |
715 |
1 |
0.008 |
719 |
1 |
0.016 |
649 |
1 |
0.193 |
649 |
2 |
100 |
724 |
1 |
1220.13 |
565 |
1 |
5.83 |
745 |
1 |
8.083 |
649 |
1 |
13.375 |
715 |
2 |
0.0077 |
756 |
2 |
0.0159 |
747 |
1 |
0.193 |
669 |
1 |
100 |
719 |
1 |
1205. 6 |
742 |
1 |
5.82 |
588 |
1 |
8.017 |
M |
1 |
13.375 |
756 |
2 |
0.0076 |
753 |
1 |
0.0151 |
773 |
2 |
0.191 |
669 |
2 |
100 |
742 |
1 |
1191. 7 |
607 |
1 |
5.74 |
756 |
2 |
608 |
607 |
1 |
13.008 |
717 |
1 |
0.0076 |
588 |
1 |
0.0142 |
609 |
2 |
0.19 |
689 |
2 |
100 |
756 |
1 |
1152. 8 |
714 |
1 |
5.56 |
747 |
2 |
7.93 |
756 |
2 |
12.917 |
649 |
1 |
0.0076 |
559 |
1 |
0.0139 |
773 |
3 |
0.187 |
696 |
1 |
100 |
745 |
1 |
1126.4 |
649 |
1 |
5.12 |
608 |
1 |
7.83 |
745 |
1 |
12.625 |
747 |
1 |
0.0073 |
747 |
2 |
0.0138 |
741 |
1 |
0.183 |
703 |
1 |
100 |
703 |
1 |
1118.3 |
747 |
1 |
5.12 |
753 |
2 |
7.806 |
669 |
1 |
12.59 |
717 |
2 |
0.0072 |
689 |
1 |
0.0137 |
622 |
1 |
0.181 |
714 |
1 |
100 |
746 |
1 |
1105 |
741 |
1 |
5.08 |
714 |
1 |
7.76 |
749 |
1 |
12.5 |
719 |
1 |
0.007 |
741 |
1 |
0.0136 |
756 |
2 |
0.18 |
742 |
1 |
100 |
753 |
1 |
1099.4 |
749 |
1 |
5.08 |
669 |
1 |
7.756 |
724 |
2 |
12.33 |
M |
1 |
0.0065 |
753 |
3 |
0.0136 |
607 |
2 |
0.177 |
746 |
1 |
100 |
747 |
1 |
1091.9 |
689 |
1 |
4.91 |
747 |
3 |
7.75 |
753 |
1 |
12.32 |
649 |
2 |
0.0064 |
748 |
1 |
0.01345 |
719 |
1 |
0.177 |
749 |
1 |
100 |
M |
1 |
1040.3 |
756 |
2 |
4.91 |
608 |
2 |
7.63 |
714 |
3 |
12.17 |
689 |
1 |
0.0062 |
747 |
3 |
0.0134 |
607 |
3 |
0.172 |
752 |
1 |
100 |
648 |
1 |
1028.3 |
....... |
|||||||||||||||||||||||
690 |
4 |
0.62 |
559 |
4 |
1 |
690 |
4 |
1.87 |
648 |
3 |
0.000833 |
771 |
4 |
0.0019 |
690 |
4 |
0.05 |
648 |
4 |
22.1 |
690 |
4 |
62.3 |
655 |
4 |
0.58 |
714 |
4 |
1 |
742 |
4 |
1.62 |
773 |
4 |
0.0008 |
559 |
3 |
0.0018 |
742 |
4 |
0.05 |
690 |
4 |
22.1 |
559 |
4 |
51.2 |
714 |
4 |
0.5 |
771 |
4 |
0.875 |
771 |
4 |
1.62 |
742 |
4 |
0.00075 |
655 |
4 |
0.0015 |
771 |
4 |
0.0475 |
559 |
4 |
22 |
742 |
4 |
41.5 |
773 |
4 |
0.5 |
559 |
3 |
0.83 |
714 |
4 |
1.5 |
771 |
4 |
0.00067 |
742 |
4 |
0.0012 |
773 |
4 |
0.047 |
714 |
4 |
22 |
714 |
4 |
38.8 |
742 |
4 |
0.37 |
773 |
4 |
0.611 |
773 |
4 |
1.11 |
648 |
4 |
0.0006 |
773 |
4 |
0.001 |
714 |
4 |
0.0375 |
742 |
4 |
22 |
773 |
4 |
37 |
638 |
2 |
0 |
638 |
2 |
0 |
638 |
2 |
0 |
638 |
2 |
0 |
638 |
2 |
0 |
638 |
2 |
0 |
638 |
2 |
0 |
638 |
2 |
0 |
638 |
3 |
0 |
638 |
3 |
0 |
638 |
3 |
0 |
638 |
3 |
0 |
638 |
3 |
0 |
638 |
3 |
0 |
638 |
3 |
0 |
638 |
3 |
0 |
638 |
4 |
0 |
638 |
4 |
0 |
638 |
4 |
0 |
638 |
4 |
0 |
638 |
4 |
0 |
638 |
4 |
0 |
638 |
4 |
0 |
638 |
4 |
0 |
689 |
4 |
0 |
689 |
4 |
0 |
689 |
4 |
0 |
689 |
4 |
0 |
689 |
4 |
0 |
689 |
4 |
0 |
689 |
4 |
0 |
689 |
4 |
0 |
715 |
4 |
0 |
715 |
4 |
0 |
715 |
4 |
0 |
715 |
4 |
0 |
715 |
4 |
0 |
715 |
4 |
0 |
715 |
4 |
0 |
715 |
4 |
0 |
LSD |
0.392 |
|
|
0.4826 |
|
|
0.7178 |
|
|
0.0006 |
|
|
0.0012 |
|
|
0.0123 |
|
|
11.295 |
|
|
113.06 |
* سطوح تنش شوری: شماره 1: خاک معمولی با هدایت الکتریکی mS/cm78/3، شماره 2: خاک با هدایت الکتریکی mS/cm 95/9، شماره 3: خاک با هدایت الکتریکی mS/cm 14و شماره 4: خاک با هدایت الکتریکی mS/cm 17
Salt stress levels: 1) normal soil, EC=3.78 mS/cm; 2) soil, EC=9.95 mS/cm; 3) soil, EC=14 mS/cm and 4) soil, EC=17 mS/cm.
بهمنظور ارزیابی تنوع ژنتیکی و دستهبندی ژنوتیپها، از روشهای تجزیه به مولفههای اصلی و تجزیه خوشهای استفاده شد. ژنوتیپهای مورد مطالعه با استفاده از الگوریتم WARD تجزیه خوشهای و میانگین دادههای کلیه صفات، گروهبندی شدند (شکل 1). برای تعیین محل برش دندوگرام نیز تجزیه تابع تشخیص انجام شد (جدول 4).
جدول 4- تجزیه تابع تشخیص برای تعیین برش دندروگرام حاصل از تجزیه خوشهای بر اساس کلیه صفات در 44 ژنوتیپ عدس
Table 4. Discriminant function analysis to determine the location of the dendrogram cutting
group |
p-value |
Wilks,lambda |
Chi-Square |
2 |
0.000 |
0.302 |
147.156 |
3 |
0.000 |
0.550 |
73.546 |
4 |
0.004 |
0.771 |
31.931 |
5 |
0.578 |
0.962 |
4.738 |
بر اساس نتایج تجزیه تابع تشخیص، نمودار دندوگرام برش یافته و چهار گروه ژنوتیپی بهدست آمد. گروه اول شامل ژنوتیپهای 608، مردم، 745، 715، 753، 719، 746، 747، 749، 748، 669، 724؛ گروه دوم شامل ژنوتیپهای 609، 680، 689، 564؛ گروه سوم شامل ژنوتیپهای 622، 771، 629، 717، 773، 553، 741، 760، 559، 613، 565، 655، 738، 606، 701، 690، 696 و گروه چهارم شامل ژنوتیپهای 648، 756، 742، 588، 703، 752، 757، 607، 649، 714 و 638 بودند. همچنین تجزیه به مولفههای اصلی در 44 ژنوتیپ مورد ارزیابی، بر اساس صفات مورد مطالعه نشان داد که حدود 86 درصد از تغییرات کل، توسط دو مولفه اصلی اول توجیه شد (جدول 5).
جدول 5- مقادیر ویژه و درصد واریانس تجمعی در تجزیه به مولفههای اصلی برای ژنوتیپهای مورد مطالعه.
Table 5. Eigenvalues and cumulative variance percentage in the principal components analysis for all genotypes.
Principal Component |
eigenvalues |
Variance% |
Percent of the total variance |
1 |
7.043 |
78.253 |
78.253 |
2 |
0.718 |
7.975 |
86.228 |
3 |
0.433 |
4.809 |
91.037 |
4 |
0.361 |
4.007 |
95.004 |
5 |
0.249 |
2.771 |
97.815 |
6 |
0.146 |
1.627 |
99.442 |
7 |
0.047 |
0.522 |
99.964 |
8 |
0.003 |
0.036 |
100 |
شکل 1- دندوگرام حاصل از تجزیهی خوشهای 44 ژنوتیپ عدس با استفاده از روش Ward.
Figure 1. The cluster analysis dendrogram of 44 genotypes of lentil using Ward method.
به طور کلی نتایج تجزیه واریانس آزمایش اول، بیانگر وجود تنوع ژنتیکی بالا در بین ژنوتیپها بود. با توجه به نتایج دیاگرام تجزیه خوشهای در آزمایش اول، از هر خوشه، یک ژنوتیپ شامل ژنوتیپهای 696، 753 و 638 به همراه رقم زراعی مردم برای انجام مطالعات بیشتر و مقایسه فیزیولوژیک انتخاب شدند.
آزمایش دوم
در تجزیه واریانس صفات مورد بررسی در آزمایش دوم برخلاف آزمایش اول، تنها اثرات متقابل بر صفات وزن تر ساقه، ریشه و گیاهچه معنیدار شدبهدست و در بقیه صفات، مقایسه میانگین برای اثرات اصلی صورت گرفت (جدول 6).
جدول 6- تجزیه واریانس صفات مورد مطالعه در سه ژنوتیپ و رقم مردم عدس.
Table 6. Variance analysis of studied traits in 3 genotypes and Mardom cultivar of lentil.
Mean Square |
df |
S.O.V. |
||||||||||
Prolin content |
Carotenoid content |
Total Ch. content |
Ch. A.B content |
Ch. A/B content |
Ch. B content |
Ch. α A content |
Fresh weight seedling (g) |
Fresh weight root (g) |
Fresh weight shoot (g) |
Shoot length(cm) |
||
0.00001* |
0.11** |
20.87** |
0.001** |
0.16** |
0.005** |
0.007** |
0.24** |
0.055** |
0.079** |
53.59** |
3 |
A Factor (Genotype) |
0.00001** |
0.183** |
49.56** |
0.002** |
0.4** |
0.01** |
0.017** |
0.43** |
0.28** |
0.017** |
18.05** |
3 |
B Factor (salinity) |
0.000004ns |
0.02ns |
3.44ns |
0.00001ns |
0.07ns |
0.001ns |
0.001ns |
0.011** |
0.01** |
0.002** |
0.87ns |
9 |
AB |
0.000005 |
0.017 |
2.331 |
0.00008 |
0.04 |
0.001 |
0.001 |
0.002 |
0.001 |
0.0001 |
0.51 |
32 |
Error |
9.72 |
15.2 |
15.29 |
27.73 |
9.37 |
25.86 |
12.6 |
4.97 |
5.46 |
3.11 |
5.71 |
|
C.V (%) |
: کلروفیل.
α: Chlorophyll
** ، * و ns: بهترتیب معنیدار در سطوح احتمال یک و پنج درصد و عدم معنیدار.
**,* and ns: Significant at %1 and %5 of probability levels and non significant, respectively.
نتایج مقایسات میانگین نشان داد که با افزایش میزان شوری، وزن تر ساقه، ریشه , گیاهچه (شکل 2) و طول ساقه (شکل a 3) و بهطورکلی رشد گیاه به صورت معنیداری در سه ژنوتیپ مورد بررسی و رقم مردم کاهش یافت. کمترین مقدار سه صفت اول در ژنوتیپ 753 و تنش mM 180 و بیشترین آنها در ژنوتیپ 696 و شرایط بدون تنش مشاهده شد. کمترین و بیشترین طول ساقه نیز بهترتیب در ژنوتیپهای 735 و 696 بهدست آمد (شکل b 3،). این کاهش در رشد میتواند به دلیل کاهش سطح برگ و در نتیجه از بین رفتن سطح فتوسنتز کننده گیاه باشد .( Shannon, 1986; Garg et al., 2001) همچنین کاهش سطح فتوسنتزکننده، موجب کاهش وزن تر گیاهچه و زیستتوده گیاه نیز میشود ((Kerepesi et al., 2000; Parida et al., 2005.
در این آزمایش، با افزایش میزان شوری از صفر به 180 میلیمولار، علاوه بر سه صفت فوق، میزان کلروفیل کل ژنوتیپها نیز کاهش معنیداری یافت. محتوای کلروفیل کل در ژنوتیپ 753 به صورت معنیداری کمتر از ژنوتیپهای دیگر بهدستبود، درحالیکه سه ژنوتیپ دیگر، اختلاف معنیدار با هم نداشتند (شکل 4). نتایج مربوط به تجزیه میانگین برای کلروفیل a، b، a/b و a.b نیز بهترتیب در قسمتهای a، b، c و d شکل 5 آورده شده است. تنش شوری، موجب کاهش معنیدار این صفات نسبت به حالت نرمال شد و کمترین میزان این پارامترها در ژنوتیپ 753 بهدست آمد.
تغییرات کاروتنوئیدها نیز مشابه با تغییرات کلروفیلها بود (شکل 6a ). کاروتنوئیدها یکی از رنگدانههای مهم دستگاه آنتیاکسیدانی گیاهان میباشند که به تخریب اکسیداتیو بسیار حساس هستند .(Havaux, 1998) کلروفیل نیز بهعنوان رنگدانه اصلی فتوسنتزی، دارای نقش اساسی در میزان تولید انرژی و رشد گیاه است. مطابق با تحقیقات صورت گرفته، این رنگدانهها متأثر از تنش شوری میباشند، بهطوریکه تأثیر منفی تنش شوری بر میزان رنگدانههای فتوسنتزی در گیاه نخود گزارش شده است (.(Mudgal, et al., 2009 متناسب با افزایش میزان شوری از تیمار صفر به 180 میلیمولار، غلظت پرولین نیز افزایش معنیدار نشان داد (نمودار b6). در شرایط تنش شوری، یکی از راهکارهای اصلیِ گیاه برای تعدیل تنش اسمزی، تولید مواد متابولیکی آلی از جمله پرولین، بتائین و ساکارز در گیاه میباشد (Flowers et al., 1977; Greenway et al., 1980). پرولین علاوه بر نقش اسمزی، بهعنوان یک عامل محافظتکننده از آنزیمها و ساختارهای درون سلولی عمل میکند و در مقابله با رادیکالهای آزاد نیز نقش دارد و همچنین در شرایط تنش، بهعنوان یک ترکیب ذخیرهای برای کربن و نیتروژن محسوب میشود (Lutts et al., 1996).
|
|||
«a» |
|||
«b» |
|||
«c» |
شکل 2- تأثیر سطوح مختلف تنش شوری بر وزن تر ساقه (a)، ریشه (b) و گیاهچه (c) در ژنوتیپهای مورد مطالعه.
در هر نمودار، ستونهای دارای حروف مشابه، اختلاف آماری معنیداری ندارند.
Figure 2. Effect of different level of salinity stress on shoot (a), root (b) and seedling (c) fresh weights in studied genotypes.In each graph, columns with similar letters are not statistically significant different.
شکل 3- تأثیر سطوح مختلف تنش شوری و ژنوتیپ بر طول ساقه گیاه.در هر نمودار، ستونهایی با حروف مشابه اختلاف آماری معنیداری ندارند.
.Figure 3. Effect of different levels of salinity stress and genotypes on shoot length. In each graph, columns with similar letters are not statistically significant different.
شکل 4- تأثیر سطوح مختلف شوری و ژنوتیپ بر محتوای کل کلروفیل. در هر نمودار، ستونهایی با حروف مشابه، اختلاف آماری معنیداری ندارند.
Figure 4. Effect of different levels of salinity stress and genotypes on total Chlorophyll content.
In each graph, columns with similar letters are not statistically significant different.
در آزمایش اول گفته شد که کاهش رشد گیاهان تحت تنش شوری، احتمالاً به دلیل اختلال در فرآیندهای فیزیولوژیک باشد که این فرضیه در آزمایش دوم بررسی و تایید شد.
نتیجهگیری کلی
رقم مردم، یکی از ارقام مورد کشت عدس توسط زارعین میباشد که در این پروژه، بهعنوان معیاری برای سنجش ژنوتیپها استفاده شد. با توجه به نتایج این پژوهش، بسیاری از ژنوتیپها در سطوح مختلف تنش، خسارت کمتری در صفات مورفولوژیک و فیزیولوژیک نسبت به این رقم نشان دادند. البته جهت انتخاب مطمئن ژنوتیپهای مقاوم به تنش شوری، به مطالعات بیشتر در سطوح مختلف فیزیولوژیک و مولکولی نیاز است تا بتوان با اطمینان بیشتری اقدام به انتخاب ژنوتیپهای برتر نمود. بهطورکلی نتایج این پروژه نشان میدهد که ژنوتیپهای موجود در بانکهای بذری کشور میتوانند پتانسیل خوبی برای ارزیابی و شناسایی ژنوتیپهای مقاوم به تنشهای مختلف از جمله تنش شوری باشند. با ارزیابیهای بیشتر و دقیقتر بر روی این ژنوتیپها میتوان ژنوتیپهای مقاومی را یافت که در کارهای اصلاحی و تولید ارقام با عملکرد بیشتر در شرایط تنش بسیار مفید باشد.
سپاسگزاری
با سپاس فراوان از آقای مهندس محمد انتصاری، آقای مهندس میثم ملکپور و آقای مهندس حمید فضلی و مسئولین بانک ژن به ویژه جناب آقای قدردان، آقای دشتکی، آقای صادقی و آقای محمدی که در انجام این پروژه ما را یاری کردند.
«a» |
|
«b» |
|
«c» |
|
«d» |
شکل 5- تأثیر سطوح مختلف تنش شوری و ژنوتیپ بر میزان کلروفیل A (a)، B (b)، A/B (c) و A.B (d). در هر نمودار، ستونهایی با حروف مشابه، اختلاف آماری معنیداری ندارند.
Figure 5. Effect of different levels of salinity stress and genotypes on chlorophyll a (a), chlorophyll b (b), chlorophyll a/b (c) and chlorophyll a.b (d) contents. In each graph, columns with similar letters are not statistically significant different.
«a» |
|
«b» |
شکل 6- تأثیر سطوح مختلف شوری و ژنوتیپ بر محتوای کارتنوئید (a) و پرولین (b). در هر نمودار، ستونهایی با حروف مشابه، اختلاف آماری معنیداری ندارند.
Figure 6. Effect of different levels of salinity stress and genotypes on carotenoid (a) and prolin (b) contents. In each graph, columns with similar letters are not statistically significant different.
REFERENCES