Evaluation of phytochemical variation in the essential oils of Yarrow (Achillea spp.) originated from different regions of Iran

مقدمه

گونه‌های جنس Achillea عمدتا به عنوان بومادران[1] شناخته می‌شوند که به دلیل داشتن خصوصیات داروئی فراوان، صدها سال در طب سنتی کاربرد داشته­اند (Turkmenoglu et al., 2015). اسم Achillea از نام آکیلیس[2] از اساطیر یونایی بر گرفته شده است. همچنین او بومادران را برای درمان خونریزی مچ پا و زخم‌ها استفاده می‌کرد (Turkmenoglu et al., 2015). بومادران با نام علمیAchillea spp.  متعلق به تیرهAsteraceae ، گیاهی چند ساله، اغلب کرکدار و با ارتفاع متفاوت در گونه‌های مختلف است و اغلب بیخ ساقه ضخیم و چوبی می‌شود. گل‌های گونه‌ها و زیرگونه‌های مختلف جنس Achillea نیز دارای رنگ‌های مختلفی نظیر سفید یا زرد هستند. بومادران یکی از مهم‌ترین جنس‌های خانواده مرکبان است که برای این جنس در دنیا، بیش از 100 گونه و در ایران 19 گونه علفی چند ساله که اغلب معطر هستند وجود دارد (Mozaffarian, 1998).

بومادران یکی از گیاهان دارویی مهم در دنیا می‌باشد که دارای مقادیر قابل توجهی متابولیت­های ثانویه، به‌ویژه روغن­های اسانسی می‌باشد. از مواد مؤثره این گیاه، استفاده فراوانی هم در طب و هم در صنایع دارویی، آرایشی و بهداشتی می‌شود. ایـن گیاه دارای زیر گونه‌های متعددی اسـت کـه ترکیـب‌هـای متفاوتی از مونوترپن­ها و سزکوئی­ترپن­هـا در آن‌هـا یافـت می‌شود. ترکیب­های اسانسی شناخته شده در این گیـاه در حال حاضـر، بـیش از 120 نـوع است کـه از مهم‌ترین آن‌ها در این گیاه می‌توان بـه کامـازولن، کـامفور، 1،8- سینئول، لیمونن، لینالول، گاما-تـرپینن، پـارا-سـیمن، آلفــا-پیــنن و بتا-اسمین (Ocimene-ẞ) اشــاره کــرد (Pljevljakušić et al., 2017). ترکیب‌های اسانسـی بومادران، به دلیل اهمیت دارویی  در برخی از کشورها مورد بررسی قرار می‌گیرند و مونه‌ها یـا تیـپ­هـای شـیمیایی[3] متفــاوتی از منــاطق مختلــف گــزارش شده است (Polatoğlu et al., 2013; El-Kalamouni et al., 2017; Saeidi et al., 2018).

در تحقیقی، خصوصیات زراعی و شیمیایی اسانس 28 جمعیت از گونه A. millefolium که از مناطق مختلف صربستان جمع آوری شده بودند مورد ارزیابی قرار گرفت. ترکیبات اسانس، بسیار متنوع بودند، اما به‌طورکلی عمده‌ترین ترکیبات در بخش مونوترپن، ẞ- pinene (حداکثر 3/36 درصد) و sabinene (حداکثر 7/35 درصد)، 1,8-cineol (حداکثر 6/26 درصد)، borneol (حداکثر 2/20 درصد)، trans-ẞ-ocimene (حداکثر 1/16 درصد)، camphor (حداکثر 3/11 درصد)، cis-chrysanthemol (حداکثر 3/11 درصد) و trans-verbenol (حداکثر 1/10 درصد) قرار داشتند. در بخش sesquiterpene عمده‌ترین ترکیبات، trans-caryophyllene (حداکثر 6/18 درصد) و lavandulyl acetate (حداکثر 1/18 درصد)، در پی آن elemol (حداکثر 5/15 درصد)، α-bisabolo (حداکثر 9/14 درصد)، terpinen-4-ol (حداکثر 9/12 درصد) بودند. از بین ترکیبات آروماتیک (معطر)، فراوان‌ترین ترکیب، chamazulene (حداکثر 1/29 درصد) بود (Pljevljakušić et al., 2017). ترکیبات اسانس از بخش‌های هوایی پنج نمونه از گونه‌ی Achillea biebersteinii Afan که از ترکیه از کونیا، اسپارتا و آنکارا جمع‌آوری شده‌ بودند، تجزیه و تحلیل شدند. 84 ترکیب شناسایی شد که 87 تا 99 درصد کل ترکیبات اسانس را شامل می‌شدند. ترکیبات اصلی شناسایی شده شامل 1,8-cineole (9-37%)، camphor (16-30%) و p-cymene (1-27%) بودند (Tabanca et al., 2011). در مطالعه­ای ترکیبات شیمیایی اسانس حاصل از بخش‌های هوایی 11 گونه از جنس Achillea مورد ارزیابی قرار گرفت و ترکیبات اصلی اسانس 1,8-cineole، p-cymene، viriflorol، nonacosane، α-bisabolol، caryophyllene oxide، α-bisabolon oxide A، ẞ-eudesmol، 15-hexadecanolide و camphor بودند. بر مبنای تجزیه و تحلیل مولفه‌های اصلی شیمیایی 13 ترکیب، سه گروه گونه و یک زیر گروه شناسایی شدند که در آن، هر گروه یک chemotype را تشکیل داد (Turkmenoglu et al., 2015).

با وجود مطالعات انجام شده در زمینه بررسی تنوع ژنتیکی و فیتوشیمیایی در جنس Achillea، با توجه به اطلاعات موجود، تحقیق جامعی در رابطه با بررسی فیتوشیمیایی گونه­های مختلف جنس Achillea بومی ایران، همزمان در دو مرحله قبل و پس از گلدهی و در یک مکان مشخص (برای مثال، کشت آن‌ها در یک گلخانه با شرایط همسان) انجام نشده است. بنابراین در تحقیق حاضر، تجزیه فیتوشیمیایی 10 گونه مختلف جنس Achillea در دو مرحله قبل و پس از گلدهیمورد ارزیابی قرار گرفت.

مواد و روش­ها

مواد گیاهی

بذرهای 10 گونه مختلف گیاه بومادران از موسسه تحقیقات جنگل­ها و مراتع واقع در پیکان­شهر تهران تهیه شد (جدول 1). در ادامه و به‌منظور بررسی گونه­های مورد مطالعه از منظر میزان درصد اسانس و تفاوت در محتوی اسانس، بذرها در سال زراعی 1396-1397 در گلخانه باغ گیاهان دارویی همدان، در مخلوطی از خاک مزرعه، ماسه و خاک برگکشت شدند. بعد از جوانه زنی بذرها و در زمان مناسب، نشاها به زمین زراعی باغ گیاهان دارویی منتقل شدند. نمونه برداری طی دو سال انجام شد؛ در سال اول، از هر گونه به‌طور میانگین، 10 بوته انتخاب شد و پس از برداشت بخش انتهایی اندام­های هوایی شامل برگ و ساقه، در دمای اتاق خشک شدند.  در سال دوم نیز پس از مرحله گلدهی، از همان بوته­های سال قبل نمونه­برداری انجام شد و در دمای اتاق خشک (به صورت مخلوط نمو نه های هر گونه) شدند.

جدول 1- مشخصات 10 گونه جنس Achillea spp. و محل جمع آوری آن‌ها

Table 1. Characteristics of 10 species of Achillea and their sampling sites

استخراج اسانس

به‌منظور استخراج اسانس از نمونه های گیاهی مورد مطالعه، از دستگاه کلونجر استفاده شد. برای این کار، حدود 10 گرم از هر نمونه با ترازو وزن شد و به یک بالن ته گرد یک لیتری حاوی 500 میلی لیتر آب مقطر و تعدادی سنگ جوش منتقل شد. دمای هیتر منتل روی ˚C 100 به مدت هشت ساعت تنظیم شد. اسانس حاصل پس از استخراج جمع آوری شد.

آنالیز اسانس با استفاده از دستگاه GC-MS

شناسایی ترکیبات، بر اساس معیارهای کروماتوگرافی (زمان بازداری) و طیف سنجی (تفسیر طیف جرمی، مقایسه با اطلاعات کتابخانه ای و ترکیبات استاندارد) انجام گرفت. داده­های کروماتوگرافی و طیف سنجی با استفاده از یک کروماتوگراف گازی مدل Thermo Scientific Trace OQ301 متصل به طیف سنج جرمی مدل DSQ OQ301 (یونیزاسیون برخورد الکترونی، EI، eV 70؛ Thermo Scientific) به‌دست آمدند. تزریق از نوع Split (با نسبت 1:50) بود و نرم افزار Xcalibur مجهز به کتابخانه­های WILEY و  NISTبرای تجزیه و تحلیل داده ها مورد استفاده قرار گرفت. ستون DB-5MS (J&W Scientific) با طول 30 متر، قطر داخلی mm 25_/0 با فاز ساکن پنج درصد فنیل پلی­متیل سایلوکسان با ضخامت µm 25_/0 مورد استفاده قرار گرفت. برنامه دمایی آون GC به‌صورت ˚C50 (به مدت min 1)، افزایش دما با سرعت ˚C/min10 تا ˚C280 و توقف به مدت 15 دقیقه تنظیم شد. دمای منطقه تزریق و خط انتقال، به‌ترتیب ˚C250 و ˚C280 تنظیم شده و هلیوم (995_/99 درصد) نیز به‌عنوان گاز حامل با فشار kPa 155 و سرعت cm/min 27 (جریان ثابت یک ml/min) مورد استفاده قرار گرفت. طیف جرمی و کروماتوگرام با روش اسکن جرمی در گستره mlz 500-45 در scan/sec 1_/5 تنظیم شد. هم­چنین جهت تایید صحت ترکیبات از ضریب کواتز^[4] استفاده شد.

تجزیه به مؤلفه های اصلی (PCA) و تجزیه خوشه­ای تجمیعی[5] (AHC)

برای انجام PCA و AHC، به‌ترتیب از نرم‌افزارهای XLSTAT (XLSTAT 2017: Data Analysis and Statistical Solution for Microsoft Excel. Addinsoft, Paris, France (2017)) وPAST (Paleontological Statistics Software Package; Version 3.22) استفاده شد (Hammer et al., 2001). بدین منظور، ابتدا هر کدام داده­های خام حاصل از تفسیر طیف جرمی اسانس 10 گونه بومادران مورد مطالعه قبل و بعد از گلدهی، به‌صورت یک ماتریس متشکل از نمونه­ها، به‌عنوان ردیف­های ماتریس و درصد نسبی اجزای تشکیل دهنده اسانس­های استخراجی به‌عنوان ستون­های ماتریس طراحی شد. سپس از بین تمامی ترکیبات به‌دست آمده، اجزای با فراوانی بیش از 10 درصد در تمامی 10 گونه­ مورد مطالعه انتخاب شدند و برای آنالیزهای آماری استفاده شدند. آنالیز PCA بر اساس Pearson type (n) PCA انجام شد و به‌منظور ترسیم بای­پلات مربوطه، از اولین و دومین مؤلفه استفاده شد. برای تجزیه خوشه­ای تجمیعی نیز از فاصله اقلیدوسی و روش وارد استفاده شد. توانمندی خوشه­ها با استفاده از آزمون بوت­استرپ با ١٠٠٠ نمونه مدل محاسبه شد.

نتایج و بحث

مرحله قبل از گلدهی

نتایج حاصل از آنالیز GC-MS نمونه­های به‌دست آمده در مرحله قبل از گلدهی در جدول 2 خلاصه شده است. همانطور که مشاهده می­شود، درمجموع و در مرحله قبل از گلدهی، 26 ترکیب شیمیایی گوناگون از 10 گونه مختلف بومادران مورد مطالعه در این تحقیق به‌دست آمد. در تمامی گونه­های مورد مطالعه و صرفنظر از برخی استثنائات، ترکیبات غالب (با فراوانی بیشتر از 10 درصد) به‌صورت 1,8-cineol، artemesia alcohol، artemesia ketone، camphor، germacrene-D، linalool، Terpineol و nerolidol گزارش شدند. از بین این ترکیبات نیز بسته به نوع گونه گیاهی، یک یا چند نوع از این ترکیبات غالب بودند. برای مثال برای گونه A. biebersteinii، سه ترکیب 1,8-cineol (45/21 درصد)، artemesia alcohol (53/12 درصد) و camphor (98/24 درصد)، ترکیبات غالب بودند. برای گونه­های A. millefolium و A. vermicularis تنها ترکیبات غالب به ترتیب nerolidol (89/16 درصد) و germacrene-D (27/7 درصد) بودند. در گونه A. eriophora ترکیبات 1,8-cineol (5/21 درصد)، و artemesia ketone (14/15)، camphor (89/28 درصد) غالب بودند، درحالی­که برای گونه  A. santolinaبیشترین مقدار ترکیبات متعلق به ماده شیمیایی linalool (17/13) و Terpineol (03/11) بود. برای سه گونه A. filipendula، A. alepica و نیز A. nobilis تنها ترکیب غالب 1,8-cineol (به ترتیب، 64/20، 05/34 و 55/18 درصد) بود. در نهایت در دو گونه A. tenuifolia و A. wilhelmsii بیشترین فروانی مربوط به ترکیب germacrene-D (به ترتیب 19/43 و 03/47 درصد) بود؛ اگرچه بردرای گونه A. tenuifolia میزان ترکیب elemene (03/10) نیز قابل توجه بود.

جدول 2- درصد ترکیب­های شناسایی شده در اسانس ١0 گونه جنس Achillea spp قبل از مرحله گلدهی

Table 2. The percentage of the identified compounds in the essential oil (EO) of 10 species of Achillea spp., before flowering.

با توجه به نتایج GC-MS، دامنه تغییرات ترکیبات اصلی گیاه بومادران نظیر 1,8-Cineole بین 2/1 تا 05/34 درصد و camphor بین صفر تا 89/28 درصد متغیر بود. بیشترین میزان 1,8-Cineole در گونه­های A. alepica، A. eriophora، A. biberstinii ، A. filipendula و A. nobilis به‌دست آمد و دو گونه A. alepica، و A. eriophora نیز بیشترین مقدار camphor  را نشان دادند. همچنین در این تحقیق برای اولین بار، ماده ارزشمند Germacrene D در دو گونه A. tenuifolia و A. wilhelmsii به‌ترتیب با فراوانی 19/43 و 03/47 درصد گزارش شد؛ اگرچه در تحقیقات پیشین مقدار این ماده کمتر گزارش شده بود.

مرحله بعد از گلدهی

نتایج حاصل از آنالیز GC-MS نمونه­های به‌دست آمده در مرحله بعد از گلدهی در جدول 3 خلاصه شده است. درمجموع، 78 ترکیب شیمیایی گوناگون از 10 گونه مختلف بومادران مورد مطالعه در این تحقیق به‌دست آمد. در تمامی گونه­های مورد مطالعه و صرفنظر از برخی استثنائات، ترکیبات (با فراوانی بیش از 10 درصد) Camphor، Cubenol، Chamazulene، Eucalyptol، Germacrene D، Sabinol، trans-Nerolidol، و در نهایت 2-Cyclohexen-1-ol, 1-methyl-4-(1-methylethyl)-, cis- به‌عنوان ترکیبات غالب گزارش شدند.

جدول 3- درصد ترکیب­های شناسایی شده در اسانس ١0 گونه جنس Achillea spp بعد از مرحله گلدهی

Table 3. The percentage of the identified compounds in the essential oil (EO) of 10 species of Achillea genus

به‌طور گسترده پذیرفته شده است که فاکتورهای ژنتیکی و محیطی و همچنین روش‌های زراعی (تاریخ کاشت و برداشت، نگهداری و عملیات پس از برداشت، سن گیاه و غیره)، مسئول تنوع بین و درون گونه‌ای برای محتوی و ترکیبات اسانس‌ها می‌باشند (Potzernheim et al., 2012; Pluhár et al., 2016; Saeidi et al., 2018).

با مقایسه ترکیبات غالب در مرحله قبل و پس از گلدهی، تنها سه ترکیب غالب camphor، Germacrene-D، و nerolidol در بین گونه­ها (و نه تمامی گونه­ها) مشترک بودند. بیشترین مقدار camphor در مرحله قبل از گلدهی و در گونه A. eriophora یافت شد (حدود 89/29 درصد)، ولی در مرحله پس از گلدهی، این مقدار در این گونه کاهش قابل ملاحظه­ای داشت (حدود چهار درصد). در مقابل در برخی از گونه­ها، مقدار این ماده پس از گلدهی و در مقایسه با قبل از گلدهی، تا حدودی بهبود یافت؛ برای مثال، مقدار این ماده در گونه A. alepica صفر بود، ولی پس از گلدهی، این مقدار به حدود 06/14 درصد رسید. نکته قابل توجه این است که در گونه A. filipendula و در هر دو مرحله نمونه‌برداری از گیاه، مقدار این ماده صفر بود. بیشترین مقدار Germacrene-D در مرحله قبل از گلدهی و در دو گونه A. tenuifolia و A. wilhelmsii (به ترتیب 19/43 و 03/47 درصد) یافت شد، ولی در مرحله پس از گلدهی، این مقدار در این دو گونه کاهش قابل ملاحظه­ای داشت (به‌ترتیب حدود 97/3 و 09/11 درصد). نکته قابل توجه دیگر این است که مقدار Germacrene-D در مرحله قبل از گلدهی در گونه A. eriophora حدود صفر بود، در حالی­که پس از مرحله گلدهی، مقدار آن به میزان قابل ملاحظه­ای رسید (یعنی حدود 71/11 درصد). در گونه A. santolina نیز تقریبا در هر دو مرحله قبل و پس از گلدهی، مقدار این ترکیب بسیار ناچیز بود (به‌ترتیب صفر و 29/0 درصد). بیشترین مقدار nerolidol در مرحله قبل از گلدهی و در گونه A. millefolium یافت شد (حدود 89/16 درصد) ولی در مرحله پس از گلدهی، این مقدار در این گونه به‌میزان کمی کاهش یافت (حدود 57/13 درصد). در مقابل در برخی از گونه­ها، مقدار این ماده پس از گلدهی و در مقایسه با قبل از گلدهی، تا حدودی بهبود یافت؛ برای مثال، مقدار این ماده در گونه A. nobilis حدود 08/1 درصد بود، ولی پس از گلدهی، این مقدار به حدود 31/21 درصد رسید. با این وجود و در سه گونه A. tenuifolia، A. wilhelmsii، و A. vermicularis در هر دو مرحله نمونه­برداری، مقدار این ماده صفر بود.

به‌طورکلی در اکثر تحقیقات پیشین، ترکیبات 1,8-Cineole، Chamazulene و Eucalyptol به همراه برخی ترکیبات دیگر (بویژه Camphor)، از جمله ترکیبات غالب موجود در اسانس گونه­های مختلف بومادران بوده­اند. با این وجود در این تحقیق، ترکیب 1,8-Cineole، تنها در اسانس حاصل از تمامی نمونه­های قبل از مرحله گلدهی یافت شد (یعنی تمامی 10 گونه­)، ولی در مرحله پس از گلدهی، در هیچ کدام از 10 گونه­ مورد مطالعه یافت نشد. دو ترکیب Chamazulene (تنها در سه گونه) و Eucalyptol (در هشت گونه) نیز تنها در اسانس حاصل از نمونه­های بعد از مرحله گلدهی یافت شد. همان‌گونه که مشاهده می شود، درمجموع می­توان گفت که در جنس Achillea، بسته به نوع گونه ، ترکیبات شیمیایی مختلفی غالب هستند که این امر درحقیقت می تواند به محیط درونی گیاه و نیز محیط جغرافیایی که در آن تکامل یافته و زیست می­کند، نسبت داده شود . برای مثال، در دو گونه A. tenuifolia و A. wilhelmsii بیشترین فروانی مربوط به ترکیب germacrene-D (به ترتیب 19/43 و 03/47 درصد) بود، درحالی­که فراوانی این دو متابولیت در هشت گونه دیگر بسیار کم بود. با نگاهی به منشأ این دوگونه، یعنی استان مرکزی و قزوین، می­توان این گونه پنداشت که احتمالا شرایط جغرافیایی و آب و هوایی این دو منطقه که هم مرز نیز هستند، منجر به تولید بالای این دو ماده در این دو گیاه به‌صورت یک متابولیت دائمی شده است. به‌عبارت دیگر، هرچند این دو گونه به همراه سایر گونه­ها در شرایط مشابهی، یعنی گلخانه واقع در همدان، کشت شده اند، اما احتمالا تولید بالای این دو ترکیب در این دو گونه تثبیت شده است.

نکته قابل توجه دیگر این است که اگر نتایج میزان ترکیبات اسانس گونه A. wilhelmsii را با مقالات پیشین مقایسه کنیم، مشاهده می­شود که در برخی از مطالعات (Lori-Gooini et al., 2018)، میزان ترکیب germacrene-D درصد پایینی را به خود اختصاص داده است (حدود 24/0 درصد) که احتمالا این امر به تنوع درون گونه­ای در این گونه مربوط می­شود. همچنین در مطالعه دیگری رویدرصد ترکیبات موجود در اسانس A. wilhelmsii جمع­آوری شده از سه منطقه شمال، غرب و شرق هرمزگان، میزان ماده germacrene-D حدود دو درصد (در توده شمال) بود و در دو توده دیگر، میزان این ماده قابل ردیابی نبود (TAHERI et al., 2016). در مطالعه دیگری، ترکیبات عمده موجود در اسانس برگ گونه A. wilhelmsii سه ترکیب Camphor (۱/۲۴ درصد)، 1,8-Cineole (۳/۲۲ درصد) و Borneol (۱/11 درصد) و در اسانس گل گیاه Camphor (۲/21 درصد)، Myrtenol (۴/14 درصد) و Myrtenyl acetate (9/8 درصد) گزارش شد (Azadbakht et al., 2003). از سوی دیگر، در سه تحقیق یاد شده که بر روی گونه A. wilhelmsii انجام شده است، ترکیبات دیگری غالب بودند که از بین آن‌ها، 1,8-Cineole و camphor قابل توجه بودند؛ هرچند ترکیبات دیگری نیز فراوانی محسوسی داشتند. در تحقیق دیگری، میزان ترکیبات موجود در اسانس سه گیاه دارویی گیشنیز، شوید و بومادران (A. wilhelmsii) مورد ارزیابی قرار گرفت که بیشترین میزان ترکیب موجود در اسانس گیاه بومادران، به آلفا-پینن (76/19 درصد) و بتا-پینن (06/10 درصد) اختصاص داده شد و ترکیب camphor در رده نهم قرار گرفت (Ghaderi et al.,2012). در مقابل در مطالعه­ای بر روی اسانس هشت گونه مختلف جنس Achillea،  پایین‌ترین و بالاترین مقادیر germacrene-D، به‌ترتیب متعلق به گونه‌های A. nobilis (74/8) و A. tenuifolia (84/55 درصد) تعلق داشت؛ ضمن این‌که مقدار این ماده برای گونه A. wilhelmsii نیز قابل توجه بود (95/19 درصد) (Gharibi et al., 2015) که با نتایج این تحقیق همخوانی داشت.

برای گونه A. millefolium نیز نتایج جالبی به‌دست آمد. درحقیقت، همان‌طور که گفتهد، برای گونه­ A. millefolium، تنها ترکیب غالب nerolidol (89/16 درصد) بود؛ درحالی­که در مطالعات پیشین برای این گونه از جنس بومادران، ترکیبات دیگری غالب بوده‌اند. برای مثال، در مطالعه­ای ترکیب­های شیمیایی و مقدار اسانس 15 جمعیت رویشگاهی بومادران هزاربرگ (A. millefolium) ایران مورد بررسی قرار گرفت (Kheiry et al.i, 2013). نتایج به‌دست آمده، تنوع فیتوشیمیایی بالایی را در میزان اسانس و نوع ترکیب­های تشکیل دهنده نمونه های مناطق مختلف کشور نشان داد؛ به‌طور مثال، دامنه تغییرات ترکیبات اصلی نظیر 1,8-Cineole، بین پنج تا 9/41 درصد و camphor، بین 7/0 تا 6/39 درصد متغیر بود. بیشترین میزان  1,8-Cineole در جمعیت­های تبریز، همدان، رینه، آبعلی و لار به‌دست آمد و جمعیت­های اردبیل، تبریز، ارومیه، زنجان، همدان و طالقان، بیشترین مقدار کامفور را نشان دادند. همچنین در این تحقیق برای اولین بار، ماده ارزشمند 1,8-Cineole با فراوانی 9/41 درصد گزارش شد. بر مبنای نتایج به‌دست آمده، تمامی نمونه های مورد مطالعه در هفت کموتیپ دسته بندی شدند. همچنین در این پژوهش برای اولین بار، دو ترکیب Hinesol و Cubenol را از بومادران هزاربرگ گزارش نمودند (Kheiry et al., 2013).

در تحقیقی، خصوصیات زراعی و شیمیایی اسانس 28 جمعیت از گونه A. millefolium که از مناطق مختلف صربستان جمع آوری شده بودند مورد ارزیابی قرار گرفت. ترکیبات اسانس، بسیار متنوع بودند اما بطورکلی، عمده‌ترین ترکیبات در بخش مونوترپن، ẞ- pinene (حداکثر 3/36 درصد ) و sabinene (حداکثر 7/35 درصد )، 1,8-cineol (حداکثر 6/26 درصد )، borneol (حداکثر 2/20 درصد )، trans-ẞ-ocimene (حداکثر 1/16 درصد )، camphor (حداکثر 3/11 %)، cis-chrysanthemol (حداکثر 3/11 درصد ) و trans-verbenol (حداکثر 1/10 درصد ) قرار داشتند. در بخش sesquiterpene، عمده‌ترین ترکیبات، trans-caryophyllene (حداکثر 6/18 درصد ) و lavandulyl acetate (حداکثر 1/18 درصد )، در پی آن elemol (حداکثر 5/15 درصد )، α-bisabolo (حداکثر 9/14 درصد )، terpinen-4-ol (حداکثر 9/12 %) بودند. از بین ترکیبات آروماتیک (معطر)، فراوان‌ترین chamazulene (حداکثر 1/29 درصد ) بود (Pljevljakušić et al., 2017). در مطالعه­ای دیگری، ترکیبات اسانس بخش هوایی گیاه وحشی A. millefolium موجود در فرانسه مورد بررسی قرار گرفت. درمجموع، 43 ترکیب در اسانس A. millefolium شناسایی شدند که 3/96 درصد  کل اسانس را تشکیل می‌دهند. Oxygenated monoterpenes جزء اصلی اسانس (7/40 درصد ) بودند. سایر بخش‌های مهم از نظر کیفیت hydrocarbon sesquiterpenes (17%) و oxygen-containing sesquiterpenes (19.5%)، germacrene-D (12.0%) و (E)-nerolidol (7.3%) بودند. بخش monoterpene تنها 15 درصد را شامل شد و sabinene (6.7%) و ẞ-pinene (3.4%) جزء اصلی آن بودند. این نتایج تایید می‌کنند که چندشکلی شیمیایی، یک ویژگی خاص در گونه بومادران می‌باشد (El-Kalamouni et al., 2017).

ارزیابی ارتباط بین 10 گونه بومادران بر مبنای صفات فیتوشیمیایی

نتایج تجزیه کلاستر و PCA در مرحله قبل از گلدهی

به‌طورکلی و با توجه به دندوگرام ترسیم شده مربوط به نه ترکیب غالب (با فراوانی بالای 10 درصد)، تمامی 10 گونه مورد مطالعه در سه گروه مجزا قرار گرفتند (شکل 1، سمت چپ). در گروه اول، دو گونه A. wilhelmsii و A. tenufolia قرار گرفتند و این دو گونه از لحاظ دو ترکیب germacrene-D (به ترتیب 03/47 و 19/43 درصد) و elemene (به ترتیب 78/4 و 03/10 درصد) غالب بودند. گروه دوم شامل A. bibrestinii، وA. eriophora بود که هر دو از لحاظ چهار ترکیب camphor، artemesia ketone، artemesia alcohol و 1,8-cineol غالب بودند. گروه سوم نیز شامل شش گونه A. vermicularis، A. alepica، A. santolina، A. filifendula، A. nobilis، و A. wilhelmsii بود که از لحاظ دارا بودن مقادیر بالای ترکیبات Linalool، Terpineol، nerolidol و 1,8-cineol حایز اهمیت هستند. نتایج PCA نیز نتایج تجزیه کلاستر را تا حدودی تایید نمود (شکل 2، سمت چپ). بطورکلی، دو مولفه اول، حدود 14/62 درصد از تغییرات را توجیه کردند و با توجه به فراوانی­های ترکیبات غالب موجود در اسانس، تمامی 10 گونه را به سه گروه مجزا تقسیم نمود.

شکل 1- تجزیه خوشه­ای تجمیعی و روابط بین 10 گونه بومادران بر مبنای اجزای اسانس در مرحله قبل از گلدهی (سمت چپ) و بعد از گلدهی (سمت راست). اعداد پایین شاخه، نمایانگر شاخص بوت استرپ می باشد.

Figure 1. Dendrogram of cluster analysis constructed from quantitative data of essential oil components in 10 species of Achillea genus before flowering (left) and after flowering (right). Bootstrap values (1000 replicates) are presented at each node.

نتایج PCA و تجزیه کلاستر در مرحله بعد از گلدهی

بطورکلی و با توجه به دندوگرام ترسیم شده مربوط به هشت ترکیب غالب (با فراوانی بالای 10 درصد)، تمامی 10 گونه مورد مطالعه در چهار گروه مجزا قرار گرفتند (شکل 1، سمت راست). در گروه اول، تنها گونه A. millefolium قرار گرفت، که این گونه نیز تنها دارای مقدار بالای ترکیب Chamazulene بود. در گروه دوم، چهار گونه­ A. bibrestinii، A. vermicularis، A. alepica، و A. tenufolia جای گرفتند و جالب این‌ که هر چهار گونه از نظر دارا بودن مقادیر بالای ترکیب Camphor و تا حدودی ترکیب Sabinol (به‌ویژه برای گونه A. bibrestinii با مقدار 43/15 درصد) نسبت به سایرین متمایز بودند. گروه سوم شامل تنها یک گونه موسوم به A. santolina بود که این گونه دارای بالاترین مقدار ترکیب Eucalyptol (01/48 درصد) بود. گروه چهارم شامل A. eriophora، A. filifendula، A. nobilis، و A. wilhelmsii بود که از بین آن‌ها دو گونه A. eriophora و A. wilhelmsii دارای بیشترین مقادیر Germacrene D، و 2-Cyclohexen-1-ol, 1-methyl-4-(1-methylethyl)-, cis بودند و بنابراین برای این دو نوع ترکیب، یک نوع کموتایپ محسوب شدند، درحالی که برای دو گونه دیگر یعنی A. filifendula، و A. nobilis، دو ترکیب Cubenol، و Nerolidol بیشینه بودند. نتایج PCA نیز نتایج تجزیه کلاستر را تایید نمود (شکل 2، سمت چپ). بطورکلی، دو مولفه اول حدود 43/58 درصد از تغییرات را توجیه کردند و با توجه به فراوانی­های ترکیبات غالب موجود در اسانس، تمامی 10 گونه را به چهار گروه مجزا تقسیم نمودند. نکته قابل توجه این است که کموتایپ چهارم، مشابه با تجزیه کلاستر به دو زیرکموتایپ تقسیم بندی شد.

شکل 2- بای­پلات تجزیه به مؤلفه­های اصلی 10 گونه بومادران بر مبنای اجزای اسانس در مرحله قبل (سمت چپ) و بعد از گلدهی (سمت راست)

Figure 2. Biplot of principal component analysis (PCA) based on quantitative data of essential oil components in 10 species of Achillea genus before (left) and after (right) flowering

همان‌طور که مشاهده می‌شودد، گروه­بندی 10 گونه بومادران مورد مطالعه بر مبنای اجزای اسانس در مرحله قبل و بعد از گلدهی، تا حدودی متفاوت است. این امر نشان می­د­هد که احتمالا گونه­های مختلف بومادران طی مراحل مختلف رشد و نموی (برای مثال، قبل و بعد از گلدهی)، متابولیت­های متفاوتی را تولید می­نمایند. برای مثال، ممکن است گیاه برای جذب حشرات گرده­افشان، ترکیبات معطر فراری تولید نماید که در مرحله قبل از گلدهی نیازی به تولید آن‌ها نیست. برعکس، ممکن است گیاه در مرحله قبل از گلدهی نیاز به متابولیت(هایی) داشته باشد که برای این مرحله ضروری هستند. درضمن، گروه­بندی آن‌ها بر مبنای نواحی جغرافیایی نزدیک به هم نیز صورت نپذیرفته است. برای توضیح این امر، باید خاطرنشان کرد که بذرهای هر 10 گونه، در یک مکان و تحت شرایط آب و هوایی کاملا مشابه کشت شده‌اند؛ بنابراین تفاوت مشاهده شده، احتمالا بیشتر منشأ ژنتیکی دارد؛ هرچند احتمال می­رود که گونه­های مربوط به نواحی جغرافیایی دیگر، احتمالا و به‌منظور سازگاری خود با محیط جدید، تحت تأثیر محیط جدید قرار گیرند و بنابراین ترکیبات شیمیایی متنوعی با کمیت­های گوناگون تولید کنند. نتایج مشابهی در تحقیقات پیشین در رابطه با این گیاه و یا سایر گیاهان دارویی گزارش شده است (Amin et al., 2008; Medina-Holguín et al., 2008; Herraiz-Peñalver et al., 2013; Polatoğlu et al., 2013; Sadeghi et al., 2014; Turkmenoglu et al., 2015; Fattahi et al., 2016; El-Kalamouni et al., 2017; Pljevljakušić et al., 2017; Saeidi et al., 2018).

نتیجه‌گیری نهایی

بطورکلی نتایج این تحقیق، طیف وسیعی از تنوع فیتوشیمیایی را در اسانس 10 گونه مختلف از گیاه بومادران نشان داد. در مرحله قبل از گلدهی و در تمامی گونه­های مورد مطالعه و صرفنظر از برخی استثنائات، ترکیبات 1,8-cineol، artemesia alcohol، artemesia ketone، camphor، germacrene-D، linalool، Terpineol و nerolidol به عنوان ترکیبات غالب (با فراوانی بیشتر از 10 درصد) بصورت گزارش شدند. بیشترین میزان 1,8-Cineole در گونه­های A. alepica، A. eriophora، A. biberstinii ، A. filipendula و A. nobilis به‌دست آمد و دو گونه A. alepica، و A. eriophora نیز بیشترین مقدار camphor را داشتند. همچنین در این تحقیق برای اولین بار، ماده ارزشمند Germacrene D در دو گونه A. tenuifolia و A. wilhelmsii به‌ترتیب با فراوانی 19/43 و 03/47 درصد گزارش شد. در مرحله بعد از گلدهی و در تمامی گونه­های مورد مطالعه و صرفنظر از برخی استثنائات، ترکیبات Camphor، Cubenol، Chamazulene، Eucalyptol، Germacrene D، Sabinol، trans-Nerolidol، و نهایتا 2-Cyclohexen-1-ol, 1-methyl-4-(1-methylethyl)-, cis- به‌عنوان ترکیبات غالب (با فراوانی بیش از 10 درصد) بصورت گزارش شدند. همچنین با توجه به نتایج تجزیه کلاستر و PCA و با توجه به داده­های فیتوشیمیایی قبل و بعد از گلدهی، تمامی 10 گونه مورد مطالعه به‌ترتیب در سه و چهار گروه مجزا قرار گرفتند. در نهایت، نتایج این تحقیق نشان داد که تفاوت در نوع ترکیب شیمیایی اسانس 10 گونه مورد مطالعه، چه از لحاظ کمیت و چه از لحاظ کیفیت، به فاکتورهای مختلفی نظیر نوع گونه مورد مطالعه، مراحل مختلف رشد و نموی (قبل و پس از گلدهی)، بک گراند ژنتیکی و احتمالا فاکتورهای اقلیمی و جغرافیایی بستگی دارد.

REFERENCES

1. Amin, G., Sourmaghi, M. S., Azizzadeh, M., Yassa, N. & Asgari, T. (2008). Seasonal variation of the essential oil composition of cultivated yarrow in Tehran-Iran. Journal of Essential Oil Bearing Plants, 11(6), 628-633.
2. Azadbakht, M., Morteza-Semnani, K. & Khansari, N. (2003). The essential oils composition of Achillea wilhelmsii C. Koch leaves and flowers. Journal of Medicinal Plants, 2(6), 55-58.
3. El-Kalamouni, C., Venskutonis, P., Zebib, B., Merah, O., Raynaud, C. & Talou, T. (2017). Antioxidant and antimicrobial activities of the essential oil of Achillea millefolium grown in France. Medicines, 4(2), 30.
4. Fattahi, B., Nazeri, V., Kalantari, S., Bonfill, M. & Fattahi, M. (2016). Essential oil variation in wild-growing populations of Salvia reuterana collected from Iran: Using GC–MS and multivariate analysis. Industrial Crops and Products, 81, 180-190.
5. Ghaderi, S., Sarailoo, M. H. & Ghanbari, V. (2012). Investigation of the components and antibacterial effects of three plant's essential oil Coriandrum sativum, Achilleh millefolium, Anethum graveolens in vitro. Journal of Shahrekord Uuniversity of Medical Sciences,
6. Gharibi, S., Tabatabaei, B. E. S. & Saeidi, G. (2015). Comparison of essential oil composition, flavonoid content and antioxidant activity in eight Achillea species. Journal of Essential Oil Bearing Plants, 18(6), 1382-1394.                
7. Hammer, Ø., Harper, D. A. & Ryan, P. D. (2001). PAST: paleontological statistics software package for education and data analysis. Palaeontologia Electronica, 4(1), 9.
8. Herraiz-Peñalver, D., Cases, M. Á., Varela, F., Navarrete, P., Sánchez-Vioque, R. & Usano-Alemany, J. (2013). Chemical characterization of Lavandula latifolia essential oil from Spanish wild populations. Biochemical Systematics and Ecology, 46, 59-68.
9. Kheiry, A., Sefidkon, F., Delshad, M., FATTAHI, M. M. & Izadi, A. (2013). Phytochemical variation of essential oils of Achillea millefolium from different habitats of Iran.
10. Lori-Gooini, Z., Rabiei, Z., Farhadi, B., Bijad, E., Azomon, E., & Rafieian-Kopaei, M. (2018). Investigation of chemical compounds and effects of Achilea wilhelmsii L essential oil on antioxidant and malondialdehyde levels of serum and brains of reserpined mice. Iranian Journal of Physiology and Pharmacology, 2(3), 176-166.
11. Medina-Holguín, A. L., Holguín, F. O., Micheletto, S., Goehle, S., Simon, J. A. & O’Connell, M. A. (2008). Chemotypic variation of essential oils in the medicinal plant, Anemopsis californica. Phytochemistry, 69(4), 919-927.
12. Pljevljakušić, D., Ristić, M. & Šavikin, K. (2017). Screening of yarrow (Achillea millefolium) populations in Serbia for yield components and essential oil composition. Lekovite sirovine, 37, 25-32.
13. Pluhár, Z., Szabó, D. & Sárosi, S. (2016). Effects of different factors influencing the essential oil properties of Thymus vulgaris Plant Science Today, 3(3), 312-326.
14. Polatoğlu, K., Karakoç, Ö. C. & Gören, N. (2013). Phytotoxic, DPPH scavenging, insecticidal activities and essential oil composition of Achillea vermicularis, teretifolia and proposed chemotypes of A. biebersteinii (Asteraceae). Industrial Crops and Products, 51, 35-45.
15. Potzernheim, M. C., Bizzo, H. R., Silva, J. P. & Vieira, R. F. (2012). Chemical characterization of essential oil constituents of four populations of Piper aduncum from Distrito Federal, Brazil. Biochemical Systematics and Ecology, 42, 25-31.
16. Sadeghi, H., Jamalpoor, S. & Shirzadi, M. H. (2014). Variability in essential oil of Teucrium polium of different latitudinal populations. Industrial Crops and Products, 54, 130-134.
17. Saeidi, K., Moosavi, M., Lorigooini, Z. & Maggi, F. (2018). Chemical characterization of the essential oil compositions and antioxidant activity from Iranian populations of Achillea wilhelmsii Koch. Industrial Crops and Products, 112, 274-280.
18. Tabanca, N., Demirci, B., Gurbuez, I., Demirci, F., Becnel, J. J., Wedge, D. E. & Baser, K. H. (2011). Essential oil composition of five collections of Achillea biebersteinii from central Turkey and their antifungal and insecticidal activity: Agricultural Research Service University Ms Natural Products Utilization, 701-706.
19. Taheri, E., Shirzadian, K. R., Sharifi, S. G. R., Sabouri, A. & Abbaszadeh, K. (2016). Investigation of genetic and photochemical diversities of yarrow (Achillea willhelmsii) in Iran. Modern Genetics Journal, 367-376.
20. Turkmenoglu, F., Agar, O., Akaydin, G., Hayran, M. & Demirci, B. (2015). Characterization of volatile compounds of eleven Achillea species from Turkey and biological activities of essential oil and methanol extract of A. hamzaoglui Arabacı & Budak. Molecules, 20(6), 11432-11458.

[1]Yarrow

[2] Achilles

[3] Chemotypes

[4] Kovats index

[5] Agglomerative hierarchical clustering