Document Type : Research Paper
Authors
1 Department of Agronomy and Plant Breeding, University College of Agriculture & Natural Resources, University of Tehran, Karaj, Iran
2 Agriculture Biotechnology Research Institute of Iran (ABRII), Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO), Iran
Abstract
Keywords
مقدمه
گوجهفرنگی، با نام علمی Solanum lycopersicum متعلق به خانواده سولاناسه میباشد. گوجهفرنگی گیاهی است دیپلوئید که با 95 % خودگشنی جزو گیاهان خودگشن محسوب میشود (Shankara, 2005) این گیاه، یکی از مهمترین سبزیجات در سراسر دنیا محسوب شده و امروزه عواملی مانند بازار وسیع مصرف داخلی و امکان صادرات به کشورهای همسایه، سبب توجه بیشتر به این محصول و افزایش سطح زیر کشت آن در مناطق مختلف کشورمان شده است (Mohseni fard et al., 2009). علاوه بر این، گوجهفرنگی به خاطر داشتن خصوصیات بیولوژی مانند داشتن ژنوم نسبتاً کوچک (Mb950) و انتقال ژن راحت، به میزان زیادی به عنوان یک گیاه مدل برای مطالعات ژنتیکی، پاتولوژی و فیزیولوژی مورد استفاده قرار میگیرد (Cruz-Mendı vil, 2011). کشت بافت، یک ابزار مهم در بیوتکنولوژی به شمار میرود و به عنوان یک پیش نیاز اصلی در فرآیند انتقال ژن به گیاه مطرح میشود. در گیاه گوجه فرنگی، مهمترین عامل محدود کننده انتفال ژن، به دست آوردن یک دستورالعمل کشت بافت مطلوب با میزان نرخ باززایی بالا میباشد (Jamous & Abu-qaoud, 2015) بنابراین کشت بافت گیاه گوجهفرنگی به دلیل ارزش تجـاری ایـن محصول و اهمیت اصلاح آن از طریق دستکاری ژنتیکی، لازم و ضروری است (Piri et al., 2011). مطالعات مختلف نشان میدهد که سه عامل نوع و غلظت هورمونهای تنظیم‌کننده رشد، نوع ریزنمونه و نوع ژنوتیپ، بیشترین تأثیر را در باززایی گیاه گوجهفرنگی دارند et al., 2010) Nasher Mohamed ; Gerszberg et al., 2015).
در مطالعه‌ای که در سال2010 توسط ناشر محمد و همکاران صورت گرفت، تأثیر دو ریزنمونه کوتیلدون و هیپوکوتیل و همچنین غلظتهای مختلف هورمون BAP، بر روی میزان باززایی دو رقم Pearl و Beril گوجهفرنگی، مورد بررسی قرار گرفت. نتایج تحقیقات نشان داد که هورمون BAP با غلظت چهار میلیگرم در لیتر در هر دو ریزنمونه کوتیلدون و هیپوکوتیل، موجب کالوس‌زایی شد اما میزان کالوس‌زایی در هیپوکوتیل نسبت به کوتیلدون بیشتر بود. همچنین غلظت دو میلیگرم در لیتر هورمون BAP موجب ساقهزایی در هر دو ریزنمونه شد. میزان ساقهزایی در دو نوع ریزنمونه با هم تفاوت معناداری نداشت اما این میزان در دو رقم با هم متفاوت بود. در این مطالعه استفاده از غلظت-های مختلف هورمون BAP به عنوان سیتوکینن سبب القای ساقهزایی و کالوس‌زایی گردید) (Mohamed Nasher et al., 2010.
آشاکاریان و همکاران در سال 2011، تأثیر غلظتهای مختلف هورمونهای BAP، TDZ و کینتین به عنوان سیتوکینن و غلظتهای مختلف هورمون IAA به عنوان اکسین را بر روی میزان باززایی دو رقم Shalimar و MHTM و دو ریزنمونه کوتیلدون و برگ، مورد بررسی قرار دادند. نتایج تحقیقات آنها نشان داد که بیشترین میزان ساقهزایی در رقم MHTM، با استفاده از هورمون TDZ با غلظت 74/0 میلیگرم در لیتر و بدون حضور هورمون اکسین اتفاق افتاد. بین این دو محیط اختلاف معناداری دیده نشد. میزان باززایی در دو ریزنمونه کوتیلدون و برگ نیز اختلاف معناداری با هم نداشت. در مورد رقم Shalimar نیز همین نتایج به دست آمد. اما میزان باززایی آن نسبت به رقم MHTM کمتر بود(Ashakiran et al., 2011).
در مطالعه‌ی دیگری که بر روی چهار رقم گوجهفرنگی به نام‌هایRio، Grande، Moneymaker و Roma انجام شد، میزان کالوس‌زایی و میزان ساقهزایی در دو ریزنمونه هیپوکوتیل و برگ مورد بررسی قرار گرفت. در این مطالعه، تأثیر هورمونهای رشد شامل IAA، NAA و توفوردی به عنوان اکسین و زاتین، کینتین و BAP نیز به عنوان سیتوکینن در غلظتهای مختلف مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد میزان کالوس‌زایی در ریزنمونه هیپوکوتیل و میزان ساقه-زایی در ریزنمونه برگ بیشتر اتفاق افتاد. بیشترین میزان تولید کالوس در رقم Rio، سپس به ترتیب در ارقام Roma و Moneymaker با محیط کشت MS پایه به علاوه دو میلیگرم در لیتر IAA و 5/2 میلیگرم در لیتر BAP، به دست آمد. بیشترین میزان ساقهزایی نیز در دو رقم Rio و Roman به دست آمد. بهترین محیط ساقهزایی شامل MS پایه به علاوه 1/0 میلیگرم در لیتر IAA، یک میلیگرم در لیتر زاتین و دو میلیگرم در لیتر BAP بود. در مورد رقم Moneymaker بیشترین میزان ساقهزایی در محیط MS پایه حاوی 1/0 میلیگرم در لیتر IAA و سه میلیگرم در لیتر BAP اتفاق افتاد (Shah et al., 2015).
نظر به اینکه ژنوتیپ‌های متفاوت در باززایی عکس‌العمل متفاوتی نشان می‌دهند، در این مطالعه به منظور بهینه نمودن شرایط کشت بافت سه رقم نیوتون، دافینس و اینفینیتی گیاه گوجهفرنگی، تأثیر محیط کشتهای مختلف حاوی تنظیم کنندههای رشد متفاوت و دو ریزنمونه کوتیلدون و هیپوکوتیل مورد بررسی قرار گرفتند.
همانطور که اشاره شد یکی از کاربردهای مهم کشت بافت، انتقال ژن میباشد. انتقال ژن با استفاده از Agrobacterium tumefaciens در گوجهفرنگی برای اولین بار توسط(1986) Mccormick گزارش شد. از آن زمان تاکنون گزارشات متعددی در مورد انتقال ژن برای اهداف مختلفی مانند افزایش عملکرد، مقاومت به آفات و بیماری‌ها، مقاومت به علف‌کش‌ها، افزایش کیفیت میوه و غیره ارائه شده است
(Sharma et al., 2009).در انتقال ژن با استفاده از Agrobacterium tumefaciens، یکی از موانعی که موجب کاهش کارایی انتقال ژن میشود، پاسخ دفاعی گیاه می-باشد که موجب انفجارهای اکسیداتیوی و در نتیجه قهوهای شدن و مرگ سلولها میشود (Kuta, 2005 & Tripathi). سیگنالدهی یون کلسیم یکی از وقایع اولیه و البته مهمترین واقعه در ایجاد پاسخ دفاعی گیاه در مقابل پاتوژن‌هاست. مشخص شده است که شروع پاسخ دفاعی گیاه بستگی به انتقال یونهای کلسیم از آپوپلاست به سیتوسول دارد. پس از ایجاد مسیر سیگنالدهی کلسیم، تولید رادیکال‌های آزاد اکسیژن (ROS)، تجمع فیتوهورمون‌هایی مانند آبسیزیک اسید (ABA)، سالیسیلیک اسید (SA) و اتیلن (ET) موجب شکل‌گیری پاسخ دفاعی برنامهریزی شده‌ای در مقابل تنشهای زنده و غیر زنده خواهد شد. گیاه در مقابل Agrobacterium tumefaciens نیز به عنوان یک پاتوژن عکس-العمل نشان میدهد که این موضوع منجر به کاهش باززایی و کاهش راندمان تحویل ژن به درون ژنوم گیاه میشود. .(Lecourieux et al., 2006; Rejeba et al., 2014) بنابراین، به نظر میرسد که هنگام تلقیح ریزنمونهها با Agrobacterium tumefaciens، بسته ماندن کانالهای کلسیمی به صورت موقت میتواند سبب کاهش و یا تأخیر در شروع پاسخ دفاعی گیاه و در نتیجه کاهش میزان قهوهای شدن بافت و مرگ سلولها شود.
وراپامیل جزء داروهای بلوکهکننده کانالهای کلسیمی در انسان میباشد. در پزشکی از این دارو برای بسته نگه داشتن موقت کانالهای کلسیمی به منظور درمان انواع بیماریهای عصبی استفاده میشود. در بدن انسان پنج نوع کانال کلسیمی به نام‌های L، N، P/Q، R و T وجود دارد و مشخص شده است که بلوکهکننده کانالهای کلسیمی مانند وراپامیل که بر روی کانالهای L در بدن انسان تأثیر می‌گذارند، قادر خواهند بود که بر روی کانالهای کلسیمی در گیاهان نیز تأثیر بگذارند
(.(Pasko & Flynn, 2000; Ram & Elliott, 2011
این مطالعه، با فرض اینکه با بسته نگه داشتن کانالهای کلسیمی به صورت موقت با استفاده از وراپامیل و در نتیجه تأخیر در ورود یونهای کلسیم به سیتوسول میتواند سبب کاهش پاسخ دفاعی گیاه در مقابل Agrobacterium tumefaciens گردد، به انجام رسید.
مواد و روش‌ها
باززایی
در این مطالعه، از سه رقم مختلف گوجهفرنگی به نام‌های نیوتون، دافینس و اینفینیتی استفاده شد. بذرهای رقم‌های انتخاب شده ابتدا در محلول یک درصد هیپوکلریت سدیم به مدت 10 دقیقه ضد عفونی شدند، سپس با استفاده از آب مقطر اتوکلاو شده دو بار و هر بار به مدت 10 دقیقه به خوبی شسته شدند. بذور ضد عفونی شده پس از خشک شدن با استفاده از کاغذ صافی، بر روی محیط کشت0.5X MS (Murashige & Skoog, 1962) کشت شدند. محیط مورد استفاده علاوه بر MS، حاوی 30 گرم در لیتر ساکارز و سه گرم در لیتر ژل رایت نیز بود. سپس شیشه‌های حاوی بذور کشت شده به مدت پنج روز در تاریکی و در دمای 25 درجه سانتیگراد قرار گرفتند، و پس از آن در نور فلورسنت با شدت 60 میکرومول فوتون بر متر مربع در ثانیه با دوره فتوپریود 16/8 (به ترتیب روشنایی/تاریکی)، قرار گرفتند. در ادامه کوتیلدون‌های 11-8 روزه و هیپوکوتیل‌های 16-14 روزه، برای این مطالعه مورد استفاده قرار گرفتند
(Dan et al., 2006; Sharma et al., 2009; Ajenifujah-Solebo et al., 2012; Durosomo et al., 2014; Popoola et al., 2015).
به منظور انجام باززایی، از محیط کشت پایه MS به همراه 30 گرم در لیتر ساکارز و سه گرم در لیتر ژل رایت استفاده شده و pH محیط بر روی 8/5 تنظیم شد. همچنین، به منظور به دست آوردن دستورالعمل مناسب جهت باززا نمودن ارقام مورد استفاده، تأثیر 13 ترکیب هورمونی مختلف به همراه دو ریزنمونه کوتیلدون و هیپوکوتیل مورد بررسی قرار گرفتند (جدول 1). پس از گذشت چهار هفته، میانگین تولید ساقه برای هر ریزنمونه محاسبه شد، و بر اساس آن محاسبات آماری جهت تعیین بهترین محیط کشت و بهترین ریزنمونه انجام شد. این مطالعه در قالب آزمایش فاکتوریل بر پایه طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار و در هر پتری تعداد شش ریزنمونه انجام شد. نتایج به دست آمده با استفاده از نرمافزار9.4 SAS و با استفاده از آزمون مقایسه میانگین دانکن آنالیز گردید.
جدول 1- نسبت تنظیم کنندههای رشد مورد استفاده جهت باززایی ارقام گوجهفرنگی
Table 1- The ratio of growth regulators used to regenerate tomato cultivars
|
Regeneration Medium number |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
13 |
|
Hormon name |
TDZ |
BAP |
TDZ |
IAA |
TDZ |
BAP |
BAP |
BAP |
IBA |
BAP |
BAP |
Zeatin |
Zeatin |
|
NAA |
IAA |
NAA |
Zeatin |
- |
NAA |
IAA |
NAA |
BAP |
IAA |
IAA |
IAA |
- |
|
|
Hormon (mg/Lit) |
0.88 |
2 |
0.68 |
0.1 |
0.74 |
2 |
3 |
1 |
0.1 |
2.5 |
1.5 |
2 |
1.5 |
|
0.5 |
0.1 |
0.1 |
2 |
- |
0.1 |
0.07 |
0.5 |
2 |
2 |
0.3 |
0.2 |
- |
|
|
Source
|
(Jamous & Abu-qaoud., 2015) |
-
|
- |
(Dan et al., 2006; Ahsana et al., 2007) |
(Ashakiran et al., 2011) |
(Cruz-Mendıvil, 2011; Popoola et al., 2015) |
(Jedi et al., 2004) |
(Nahar Liza et al., 2013) |
(Manamohan et al., 2011) |
- |
- |
(Pawar et al., 2012) |
(Rani et al., 2013) |
بررسی تأثیر وراپامیل بر روی پاسخ دفاعی گیاه
مواد گیاهی و باکتری
در این مطالعه، به منظور بررسی تأثیر وراپامیل بر روی پاسخ دفاعی گیاه، تلقیح ریز نمونهها با باکتری Agrobacterium tumefaciens سویهLBA4404 ، حاوی پلاسمید pBI121 (کلون تک) انجام شد. این پلاسمید حامل ژن گزارشگر گیاهی بتاگلوکورونیداز (gus) uidA و نشانگر انتخابی نئومایسین فسفوترانسفراز (nptII)، رمزکننده مقاومت به کانامایسین میباشد. بر اساس نتایج حاصل از باززایی، برای انجام این مطالعه از رقم دافینس و ریزنمونه کوتیلدون استفاده شد.
تلقیح ریزنمونهها
به منظور تلقیح ریزنمونهها، از دستورالعمل Dan et al.(2006) با کمی تغییرات استفاده شد. برای تهیه محیط تلقیح ابتدا یک کلونی از باکتری Agrobacterium tumefaciens کشت شده در محیط کشت جامد را در پنج میلیلیتر محیط LB[1]مایع (Miller, 1972) ریخته و درون انکوباتور 28 درجه سانتیگراد با دور 200 دور در دقیقه قرار دادیم. محیط LB مایع حاوی 50 میلیگرم در لیتر از هریک از آنتیبیوتیکهای کانامایسین و ریفامپسین نیز بود. نظر به اینکه ژن مقاومت به آنتیبیوتیک ریفامپسین در ژنوم سویه LBA4404 وجود دارد، به منظور جلوگیری از رشد سایر باکتریها و در نتیجه کنترل آلودگی از آن در محیط کشت استفاده شد. پس از گذشت 22-18 ساعت، دو میلیلیتر از سوسپانیسون باکتری برداشته شد و در یک فالکون جدید که حاوی 30 میلیلیتر محیطLB مایع و50 میلیگرم در لیتر آنتیبیوتیک ریفامپسین بود، ریخته شد و به مدت چهار ساعت مجدداً در انکوباتور 28 درجه سانتیگراد و 200 دور در دقیقه قرار گرفت. پس از آن محیط تلقیح به مدت 10 دقیقه با 3000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. رسوب حاصل در 10 میلیلیتر MS مایع که حاوی 100 میکرومولار استوسرینگون بود حل شد و در انکوباتور 28 درجه با دور 200 دور در دقیقه قرار گرفت. زمانی که [2]OD باکتری به 5/0-3/0رسید برای تلقیح ریزنمونهها مورد استفاده قرار گرفت. کوتیلدونها پس از این که خراش خوردند به مدت سه تا پنج دقیقه در سوسپانسیون تلقیح غوطهور شدند، سپس با استفاده از کاغذ صافی خشک و بر روی محیط همکشتی (جدول 2) قرار گرفتند. محیطهای همکشتی به مدت دو شب در تاریکی و در فیتوترون با دمای 25 درجه سانتیگراد قرار گرفتند. کوتیلدونها پس از خشک شدن با کاغذ صافی از محیط همکشتی به محیط انتخابی (جدول 2) منتقل شدند. نمونههای باززا شده پس از 38 روز به محیط ساقهزایی (جدول 2) منتقل شدند و پس از دو هفته گیاهچههای رشد کرده به محیط ریشهزایی (جدول 2) انتقال یافتند. شرایط اتاق کشت برای محیطهای باززایی، ساقهزایی و ریشهزایی داری شرایط فتوپرویود 16/8 (به ترتیب روشنایی/ تاریکی) و نور فلورسنت با شدت 60 میکرومول فوتون بر متر مربع در ثانیه بود.
جدول 2- ترکیب محیط کشتهای مختلف با محیط پایه MS در طی انتقال ژن با Agrobacterium tumefaciens
Table 2- Compound of different media based on MS medium used in Agrobacterium mediate transformation
|
Rooting medium |
Shooting medium |
Regeneration medium |
coculture medium |
Preculture medium |
|
|
30 |
30 |
30 |
30 |
30 |
Sucrose(gr/lit) |
|
3 |
3 |
3 |
3 |
3 |
Gelrite(gr/lit) |
|
|
0.65 |
0.65 |
0.65 |
0.65 |
TDZ(mg/lit) |
|
|
|
0.1 |
0.1 |
0.1 |
NAA(mg/lit) |
|
300 |
300 |
300 |
|
|
Cefotaxime (mg/lit) |
|
30 |
30 |
30 |
|
|
Kanamycin (mg/lit) |
|
|
|
|
100 |
|
Astusryngan (µM) |
مطالعات هیستوشیمیایی
به منظور بررسی انتقال و بیان ژن gus، از مطالعات هیستوشیمیایی استفاده شد (Jefferson, 1987). در این روش برگ نمونۀ ترانسفورم شده در یک ویال قرار داده شد، سپس محلول X-Gluc به نحوی به هر نمونه اضافه شد که کل نمونه در محلول قرار گرفت و نمونهی مورد نظر به مدت 15-10 ساعت در انکوباتور 37 درجه در تاریکی، نگهداری شد. پس از آن محلول X-Gluc خارج شده و روی نمونه الکل 99% (اتانول) ریخته شد. پس از این که نمونه کلروفیل خود را از دست داد عکسبرداری انجام گرفت.
به منظور بررسی تأثیر ترکیب دارویی وراپامیل بر روی پاسخ دفاعی گیاه در مرحله همکشتی از این ماده در چهار غلظت0-50-100 و 150 میلیگرم در لیتر به عنوان تیمار با هشت ریزنمونه در هر پتری دیش با سه تکرار انجام شد. ترکیب این دارو شامل 5/2 میلیگرم در لیتر وراپامیل و 5/8 میلیگرم در لیتر NaCl میباشد که در آب حل، و pH آن بین چهار تا شش تنظیم میشود. در این مطالعه نیز از همین ترکیب استفاده شد. از هر تیمار، دو کالوس تصادفی به منظور بررسی میزان قهوهای شدن و سوختگی ریزنمونهها انتخاب شد. میانگین باززایی با تقسیم تعداد ریزنمونههای باززاشده بر تعداد کل ریزنمونهها محاسبه گردید. این آزمایشات در قالب طرح کاملاً تصادفی انجام و نتایج به دست آمده با استفاده از نرمافزار9.4 SAS آنالیز گردید. از تلقیح ریزنمونهها با Agrobacterium tumefacien فاقد پلاسمید نیز به عنوان شاهد استفاده شد.
نتایج و بحث
باززایی
در این مطالعه مشخص شد که ریزنمونه کوتیلدون در مورد دو رقم دافینس و نیوتون، و ریزنمونه هیپوکوتیل در مورد رقم اینفینیتی، در زمینه باززایی بهتر عمل میکند (جدول 5). در مورد دو رقم نیوتون و دافینس، محیط کشت حاوی نسبت هورمونی 68/0 TDZ= و 1/0NAA= میلیگرم در لیتر با میانگین تولید 9/11 و شش ساقه در هر ریزنمونه به ترتیب برای ارقام دافینس و نیوتون، بهترین ترکیب هورمونی در باززایی میباشد. در مورد رقم نیوتون علاوه بر محیط فوق، محیط 2BAP= و 1/0IAA= میلیگرم در لیتر نیز بهترین محیط کشت در باززایی به شمار میرود. بین این دو نوع محیط برای رقم نیوتون تفاوت معناداری دیده نشد (جدول 4). نوع و نسبت ترکیب هورمونی مورد استفاده در محیط کشت مهمترین عامل تأثیرگذار در میزان باززایی میباشد (Pawar et al., 2012). در طی دهههای گذشته، هورمونهای متعددی به منظور افزایش باززایی سلولهای گیاهی به صورت مصنوعی ساخته شده است. TDZ، به خاطر داشتن نقش مؤثر در کشت بافت و کشت سلولهای گیاهی، در طی چند دهه گذشته بسیار مورد توجه قرار گرفته است. اگرچه این هورمون جزو سیتوکینها طبقهبندی میشود، اما مشخص شده است که اکسینها نیز تأثیرات مشابه در سلول ایجاد میکنند. نکته جالب در مورد این هورمون این است که ساختار شیمیایی آن شبیه به هیچ یک از هورمونهای اکسین و سیتوکینن که تاکنون مورد استفاده قرار گرفتهاند، نمیباشد (Guo et al., 2011). در این مطالعه، ترکیب این هورمون با اکسین نفتالین استیک اسید، تأثیر مطلوبی در باززایی دو رقم نیوتون و دافینس گیاه گوجهفرنگی داشت.& Abu-qaoud Jamous (2015) از این ترکیب هورمونی با غلظتهای به ترتیب چهار میکرومولار و 5/0 میلیگرم در لیتر به ترتیب برای TDZ و نفتالین استیک اسید، به طور موفقیتآمیزی جهت باززایی گیاه گوجهفرنگی استفاده نمودند. در مورد هورمون نفتالین استیک اسید نیز باید به این نکته اشاره نمود که این هورمون نیز یک اکسین مصنوعی میباشد و یکی از پرکاربردترین اکسینها در کشت بافت گیاهی به شمار میرود (Guo et al., 2011). اما در مورد رقم اینفینیتی، نتایج تجزیه واریانس نشان داد که بین محیط کشتهای مختلف از جمله محیط کشت حاوی هورمونهای 2= Zeatin و 1/0IAA= میلیگرم در لیتر اختلاف معنیداری وجود نداشت. میزان باززایی رقم اینفینیتی در مقایسه با دو رقم دافینس و نیوتون کمتر بود، به گونهای که میانگین تولید ساقه برای این رقم در محیط مذکور سه ساقه در هر ریزنمونه برآورد گردید (جدول 4). بهترین ریزنمونه جهت باززایی برای ارقام دافینس و نیوتون کوتیلدون و برای رقم این فینیتی هیپوکوتیل میباشد (جدول 5). در گزارشات متعددی نیز به این موضوع اشاره شده است که میزان و شرایط باززایی برای ارقام مختلف گوجهفرنگی متفاوت بوده، و تاکنون یک دستورالعمل یکسان برای تمام ارقام مختلف گوجهفرنگی ارائه نشده است (Jedi et al., 2004). بدین ترتیب، بهترین رقم از لحاظ باززایی رقم دافینس بوده و پس از آن رقم نیوتون و رتبه بعدی متعلق به رقم اینفینیتی میباشد (جدول 6). مدت زمان ایجاد ساقه در هر سه رقم، چهار هفته، و مدت زمان طویل شدن ساقهها نیز به مدت سه هفته به طول انجامید. در نهایت گیاهچههای ایجاد شده از محل اتصال به کالوس جدا شده و در محیط ریشهزایی قرار گرفتند. محیط ریشهزایی MS کامل بود.
|
مدت زمان ریشهزایی نیز دو هفته طول کشید (شکل 1).
|
|
|
|
|
|
|
شکل 1- مراحل مختلف رشد گیاه گوجهفرنگی الف: رقم دافینس بر روی محیط MS پایه با ترکیب هورمونی 68/0TDZ=، 1/0NAA= میلیگرم در لیتر ب: رقم نیوتون بر روی محیط MS پایه با ترکیب هورمونی 68/0 TDZ= 1/0NAA= میلیگرم در لیتر ج: گوجهفرنگی باززا شده پس از جدا شدن از کالوس در محیط ریشهزایی قرار گرفت. د: محیط ریشهزایی
Figure 1- Different stages of growth of tomato plant A: Regeneration of The Dafines cultivar on MS medium with combination hormone TDZ=0.6, NAA==0.1 mg/Lit. B: Regeneration of The Newton cultivar on MS medium with combination hormone TDZ=0.6, NAA==0.1 mg/Lit. C: Regenerated tomato isolated from callus and placed in rooting medium. D: Rooting medium
جدول 1- نتایج تجزیه واریانس میزان باززایی برای ارقام، هورمونها و ریزنمونههای مختلف مورد مطالعه در گیاه گوجه فرنگی
Table 3- the results of analysis of variance for regeneration rate for different cultivars, hormones and microelements studied in the tomato plant
|
F value |
Mean Square |
df |
Source |
|
262.35** |
118.63 |
2 |
V |
|
493.43** |
223.12 |
1 |
T1 |
|
123.63** |
55.90 |
12 |
T2 |
|
279.86** |
126.55 |
2 |
V ×T1 |
|
35.16** |
15.89 |
24 |
V×T2 |
|
32.74** |
14.80 |
24 |
T1×T2×V |
|
|
0.45 |
154 |
Errore |
|
|
26.37 |
|
CV(%) |
** معنیداری در سطح 1% (p<0.01)
T1:ریزنمونه٬ T2:هورمون٬ V: رقم
جدول 2- مقایسه میانگین باززایی (تعداد ساقهها تقسیم بر تعداد ریزنمونه در هر پتری دیش) ارقام مختلف گوجهفرنگی برای محیط کشتهای مختلف
|
Cultivar |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
13 |
|
Infinity |
2.0a |
2.4a |
1.6a |
3a |
0.5b |
0.8b |
1.6a |
1.3a |
0.5b |
0.1b |
2.9a |
1.2a |
0b |
|
Newton |
2.0c |
6.0a |
6.0a |
1.7c |
0.2c |
1.6c |
3.0b |
2.2c |
0.2d |
2.7c |
1.9c |
2.5c |
0.1d |
|
Dafines |
5.9b |
5.5c |
11.9a |
6.5b |
0.5f |
2.3e |
2.5e |
4.0d |
3.8d |
0.8f |
3.8d |
2.3e |
0f |
*عددهای 1تا 13 نوع محیط کشتهای مختلف است که دز جدول 1 جزئیات هورمونی هر محیط کشت نشان داده شده است.
حروف مشترک در هرردیف بیانگر نبود اختلاف معنیدار میانگینها بر پایة آزمون دانکن (p˂0.05) است.
* The numbers range of 1 to 13 are different types of culture mediums that in Table 1 shows the hormonal
details of each culture medium.
Mean within a row followed by the same letters are not significantly different at p<0.05 according to the
Duncan test.
جدول 3- مقایسه میانگین باززایی ارقام مختلف برای ریزنمونههای کوتیلدون و هیپوکوتیل
Table 5- Comparison of mean regeneration of different cultivars for cotyledon and hypocotyl explants
|
Cotyledon |
hypocotyl |
Cultivar |
|
1.17d |
1.64c |
Infinity |
|
3.23b |
1.52c |
Newton |
|
6.16a |
1.55c |
Dafines |
حروف مشترک در هرردیف بیانگر نبود اختلاف معنیدار میانگینها بر پایة آزمون دانکن (p˂0.05) است.
Mean within a row followed by the same letters are not significantly different at p<0.05 according to the Duncan test .
جدول 4- مقایسه میانگین میزان باززایی برای ارقام اینفینیتی، نیوتون و دافینس
Table 6- Comparison of mean total regeneration for Infinity, Newton and Dafines
|
Average Regeneration |
Cultivar |
|
1.4c |
Infinity |
|
2.3b |
Newoton |
|
3.8a |
Dafines |
حروف مشترک در هرردیف بیانگر نبود اختلاف معنیدار میانگینها بر پایة آزمون دانکن (p˂0.05) است.
Mean within a row followed by the same letters are not significantly different at p<0.05 according to the Duncan test .
بر اساس نتایج به دست آمده از باززایی، به منظور بررسی تأثیر وراپامیل بر روی پاسخ دفاعی گیاه از رقم دافینس، از ریزنمونه کوتیلدون و محیط کشت حاوی هورمونهای TDZ و NAA با غلظتهای به ترتیب 68/0 و 1/0 میلیگرم در لیتر استفاده شد.
تأثیر وراپامیل بر روی ریزنمونههای تلقیح شده با Agrobacterium tumefaciens
بررسی میزان قهوهای شدن کالوسها
میزان سوختگی و قهوهای شدن کالوسهایی که در محیطهای حاوی وراپامیل رشد کرده بودند نسبت به کالوسهای شاهد یعنی کالوسهایی که در محیطهای فاقد وراپامیل رشد کرده بودند، به طور محسوسی کمتر بود (شکل 2). ورود Agrobacterium به سلول گیاهی به علت تجمع H2O2، موجب مرگ سلول و در نتیجه کاهش نرخ انتقال ژن خواهد شد. قهوهای شدن بافت و مرگ سلول در اثر ورود Agrobacterium tumefaciensبه گیاه، در بسیاری از گیاهان مثل سویا، گوجهفرنگی، آفتابگردان، انگور، چغندرقند و غیره گزارش شده است. Hansen (2000) نشان داده است که در ذرت پس از تلقیح با Agrobacterium tumefaciens، مرگ برنامهریزی شده سلول، به علت تکه تکه شدن DNA اتفاق افتاده است.et al.(2002) Parrott نشان دادند که پس از تماس جنین و ریشه گندم با Agrobacterium tumefaciens مرگ سلول همزمان با تجمع H2O2در سلول اتفاق میافتد (Dan et al., 2016).
همانطور که قبلاً اشاره شد، وراپامیل با تأثیر بر روی کانالهای L در انسان برای درمان بیماریهای عصبی مورد استفاده قرار میگیرد. کانالهای کلسیمی نوع L کانالهای نسبتاً بزرگی هستند که دارای فعالیت ولتاژ بالایی نیز میباشند. این کانالها دارای وزن مولکولی 400 کیلودالتون با پنج زیرواحد 1α، 2α، ẞ، γ و δ هستند. این نوع از کانالهای کلسیمی از طریق مسیرهای فسفریله کننده پروتئین CAMP فعال میشوند و به وسیله بلوکهکنندههای کلسیمی هم سریع غیر فعال میشوند (Pasko & Flynn, 2001; Ram & Elliott, 2011). در این مطالعه برای اولین بار مشخص شد که با استفاده از بلوکهکننده کانالهای کلسیمی-وراپامیل-میتوان با کاهش پاسخ دفاعی گیاه میزان قهوهای شدن و مرگ برنامهریزی شده سلولها را کاهش داد. تجمع H2O2 که به دنبال پاسخ دفاعی گیاه اتفاق میافتد نقش کلیدی را در مرگ برنامهریزی شده سلول بازی میکند (Dan et al., 2016). از این روet al.(2014) Dan برای اولین بار تأثیر مادهای به نام ملاتونین و 17 ترکیب دیگر شامل پنج آنتیاکسیدان و 12 غیرآنتیاکسیدان را بر روی افزایش میزان کارایی انتقال ژن با استفاده از Agrobacterium tumefaciens بر روی گوجهفرنگی و سویا، مورد بررسی قرار دادند. نتایج مطالعات آنها نشان داد که ملاتونین زمانی که به محیط انتخابی اضافه میشود، بیش از سایر ترکیبات میزان انتقال ژن را افزایش میدهد. آنها بیان نمودند که ملاتونین با خاصیت آنتیاکسیدانی که دارد، از ایجاد پاسخ دفاعی گیاه و قهوهای شدن ناشی از آن جلوگیری میکند و بدین ترتیب میزان باززایی پس از انتقال ژن را افزایش میدهد. ملاتونین یک هورمون انسانی است که توسط مغز ترشح میشود و در طیف وسیعی از فعالیتهای بیولوژیکی مانند فعایتهای عصبی، سیستم ایمنی بدن، فعالیت قلب، سیستم تناسلی و غیره ایفای نقش میکند. مشخص شده است که ملاتونین بیشتر فعالیتهای خود را از طریق خاصیت آنتیاکسیدانی ایفا میکند (Munik & Ekmekcioglu, 2015). Levine et al. (1995) نیز نشان دادند که تجمع H2O2، به دنبال سیگنالدهی یون کلسیم اتفاق میافتد. بنابراین به نظر میرسد وراپامیل این قابلیت را دارد که یک گام جلوتر از ملاتونین حرکت کند و با به تعویق انداختن سیگنالدهی یون کلسیم، افزایش میزان H2O2 و مرگ برنامهریزی شده سلول را کاهش دهد.
شکل 1- مقایسه بین کالوسها در محیط با و بدون وراپامیل؛: سمت راست :کالوسهای حاصل از ریزنمونههای گوجهفرنگی تلقیح شده با Agrobacterium tumefaciens رشد کرده در محیط دارای وراپامیل، سمت چپ: کالوسهای حاصل از ریزنمونههای گوجهفرنگی تلقیح شده با Agrobacterium tumefaciens رشد کرده در محیط فاقد وراپامیل
Figure 2- Comparison between calluses in mediums contaioning and free verapamil. Right: The calluses derived from inoculated tomato explants with Agrobacterium tumefaciens that grows in medium containing verapamil and Left: The calluses derived from inoculated tomato explants with Agrobacterium tumefaciens that grows in medium free verapamil.
باززایی
در جدول (7)، مقایسه میانگین باززایی نمونههای رشد کرده بر روی غلظتهای مختلف وراپامیل نشان داده شده است. میزان باززایی به علت تنش ناشی از تلقیح ریزنمونهها با Agrobacterium tumefaciens، در مقایسه با حالت کشت بافت به شدت کاهش یافته است. زمانی که از محیط همکشتی دارای 50 میلیگرم در لیتر وراپامیل استفاده شد، نرخ باززایی نسبت به شاهد و سایر غلظتهای وراپامیل بیشتر بود. کاهش پاسخ دفاعی گیاه به واسطه وجود وراپامیل سبب افزایش نرخ باززایی شده است. یونهای کلسیم به عنوان پیغامرسان ثانویه در بسیاری از مسیرهای سیگنالدهی در گیاهان و همینطور در جانوران فعالیت میکنند و سبب ایجاد پاسخهای فیزیولوژی مناسب گیاه به دامنه وسیعی از محرکهای محیطی میشوند. تغییرات غلظت کلسیم در پاسخ به محرکهای مختلفی شامل هورمونها، نور، تنشهای غیرزنده و الیستورهای میکروبی، میتواند اتفاق افتد. در حالت عادی میزان غلظت کلسیم در سیتوسول 100 تا 200 نانومولار، یعنی 104 بار کمتر از آپوپلاست و 104 تا 105 بار کمتر از اندامکهای سلولی است. این موضوع سبب ایجاد اختلاف پتانسیلی خواهد شد که در صورت نیاز، منجر به ورود یون کلسیم به درون سیتوسول یعنی جایی که به عنوان پیغامرسان ثانویه عمل میکند، می شود
(Ben Rejeba et al., 2014)
بنابراین به نظر میرسد با توجه به نقش کانالهای کلسیمی در رشد و نمو گیاه، هرچند غلظت مناسبی از وراپامیل سبب تأخیر در باز شدن کانالهای کلسیمی و در نتیجه کاهش پاسخ دفاعی گیاه میشود، اما استفاده از غلظت بالای آن سبب اختلال در فعالیت کانالهای کلسیمی و در نتیجه اختلال در فرآیند رشد گیاه خواهد شد.
جدول 5- مقایسه میانگین باززایی نمونههای گوجه فرنگی رقم دافینس ترانسفورم شده با Agrobacterium tumefaciens در غلظتهای مختلف وراپامیل به عنوان بلوکه کننده کانالهای کلسیمی.
Table 7- Average regeneration of transformed tomato Dafines variety explants with Agrobacterium tumefaciens on different concentrations of verapamil as blocker of calcium channels
|
200 |
150 |
50 |
0 |
Different concentrations of verapamil(mg/L) |
|
0.05b |
0.1b |
0.3a |
0b |
Average regeneration* |
حروف مشترک در هرردیف بیانگر نبود اختلاف معنیدار میانگینها بر پایة آزمون دانکن (p˂0.05) است.
Mean within a row followed by the same letters are not significantly different at p<0.05 according to the
Duncan test.
مطالعات هیستوشیمیایی
نتایج حاصل از مطالعات هیستوشیمیایی نشان داد که از تعداد هشت نمونه باززا شده شش تای آنها در تماس با محلول X-gluc، آبی شدند (شکل 3).
شکل 2- نمونههای برگ حاصل از تست هیستوشیمیایی که به علت بیان پروتئین gus آبی شدهااند.
Figure 3- Leaf samples resulted from a histochemical test, which is blued due to the expression of gus protein.
نتیجهگیری کلی
نتایج این مطالعه نشان داد که استفاده از ترکیب هورمونی TDZ و NAA نتیجه بسیار مطلوبی در باززایی دو رقم دافینس و نیوتون ایجاد میکند. اما در مورد رقم اینفینیتی باززایی آن در چند ترکیب هورمونی مختلف، تفاوت چندانی با هم نداشت. علاوه بر این مشخص شد که در بین سه رقم مورد مطالعه، میزان باززایی رقم دافینس بیشتر و میزان باززایی رقم اینفینیتی کمتر میباشد. در این مطالعه برای اولین بار مشخص شد که وجود غلظت مناسبی از وراپامیل در محیط کشت سبب تأخیر و یا کاهش باز شدن کانالهای کلسیمی و در نتیجه کاهش پاسخ دفاعی میشود. کاهش پاسخ دفاعی خود عامل مهمی برای افزایش میزان باززایی و همچنین کاهش میزان قهوهای شدن ریزنمونهها به حساب میرود. اما به نظر میرسد از آنجا که کانالهای کلسیمی در بسیاری از فعالیتهای حیاتی سلول نقش دارند، استفاده از غلظت بالای وراپامیل در محیط کشت احتمالاً منجر به اختلال در فعالیتهای حیاتی سلول و کاهش رشد و نمو آن شود. در نتیجه اگر از وراپامیل در غلظت بالا استفاده شود، خود یک عامل بازدارنده برای باززایی و در نتیجه انتقال ژن خواهد بود. به گونهای که در این مطالعه مشخص شد، غلظت 50 میلیگرم در لیتر غلظت مناسبی است و در غلظتهای بالاتر نتیجه عکس خواهد بود. در این جا باید به این نکته نیز اشاره نمود که به دلیل اهمیت سیگنالدهی یون کلسیم در سایر فعالیتهای حیاتی گیاه، تأثیر وراپامیل در محیط همکشتی مورد بررسی قرار گرفت، چون به نظر میرسید وجود این ماده در محیط انتخابی سبب اختلال در رشد و نمو گیاه شود.
References:
[1] Luria-Bertani Broth
References:
)
