Identification of conserved microRNAs and their targets in Cichorium intybus and Cichorium endivia

مقدمه

کاسنی گیاهی دارویی با نام علمی Cichorium intybus  به معنی کاسنی وحشی است. نوع دیگر آن، کاسنی اهلی به نام آندیو  (Cichorium endivia) یا کاسنی فرنگی است که به‌عنوان سالاد مصرف می­شود (Chakraborty et al., 2016). اکثر قسمت­های این گیاه دارای مقادیر زیادی ترکیبات شیمیایی دارویی مهم از جمله اینولین، آلکالوئیدها، سسکوئیترپن­لاکتون­ها، کومارین­ها، ویتامین­ها، رنگدانه­های کلروفیلی، استرول­های غیر اشباع، فلاوونوئیدها، ساپونین­ها و تانین­هاست (Srivastava et al., 2017). 

سنتز متابولیت­های گیاهی و به‌طور‌کلی تمام فرآیندهای سلولی، تحت کنترل سیستم ژنتیکی است که از جمله­ این روش­ها می­توان به کنترل بیان ژن توسط miRNAها اشاره کرد. miRNAها گروهی از RNAهای غیر کد کننده­ کوچک هستند که سبب کنترل بیان ژن پس از رونویسی از طریق سرکوب یا تخریب mRNA ژن­های هدفشان می­شوند (Reinhart et al, 2002). پس از کشف وجود miRNAها در آرابیدوپسیس و اینکه این نوع RNAهای غیر کد کننده ممکن است ناشی از تکامل یوکاریوت­ها باشند، تعداد miRNAهای شناسایی شده از طریق روش­های آزمایشگاهی و مقایسه­ای به‌صورت فزاینده­ای در جانوران، گیاهان و حتی ویروس­ها افزایش یافت (Mallory et al., 2006). روش­های مقایسه­ای ژنومیکی بر پایه­ حفاظت توالی، جهت شناسایی miRNA جدید استفاده می­شوند و روش­های بر پایه همولوژی، به شناسایی خانواده­های miRNA، بدون داشتن توالی­های ژنومی کمک می­کنند. زمانی که توالی­های ژنومی در دسترس نباشد، می­توان ESTها و GSSها را جهت شناسایی miRNAها به کار برد. ESTها توالی­های cDNA جزئی از ژن­های بیان شده­ای هستند که درون یک پلاسمید کلون شده‌اند (Zhang et al., 2005).

به همین منظور، این تحقیق با هدف شناسایی miRNAها و ژن­های هدف آن‌ها در دو گونه کاسنی شامل  C. intybus و C. endivia صورت گرفت. با انجام این کار، می‌توان به نقش تنظیمی احتمالی miRNAها در تنظیم بیان ژن‌های مسیرهای مختلف بیوسنتزی متابولیت‌هامتابولیت‌های اولیه و ثانویه پی برد. در ادامه، به نقش سینرژیستی یا انتاگونیستی آن‌ها با ژن‌های هدف پی برده خواهد شد که این امر خود می‌تواند در مهندسی مسیر بیوسنتزی انواع متابولیت‌ها و ترکیبات زیستی درون گیاهی کمک نماید. 

مواد و روش­ها

توالی­های miRNA و EST

تعداد 28645 توالی miRNA بالغ شناخته شده در تمام گونه­ها، به‌عنوان miRNA­های مرجع (reference) جهت پیش­گویی miRNAهای حفاظت شده در دو گونه گیاهی کاسنی شامل C. intybus  و C. endivia از بانک اطلاعاتی miRbase (http://www.mirbase.org) فروگذاری شد. تعداد 84144 توالی EST مربوط به این دو گونه نیز­ از بخش EST بانک اطلاعاتی NCBI (http:// ftp.ncbi.nlm.nih.gov) با فرمت FASTA فروگذاری شد (Xie et al., 2007). نمونه­های تکراری با استفاده از نرم­افزار Excel 2013 و مرتب کردن آن‌ها (sort) و سپس حذف توالی­هایی که بیش از یک بار تکرار شده بودند، حذف شدند.

جستجوی همولوژی

جهت جستجوی همولوژی بین miRNA­ها و ESTهای این دو گونه، از الگوریتم BLASTn (BLAST2.2.21) در بانک اطلاعاتی NCBI (ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/) استفاده شد. پارامترهایی که جهت به دست آوردن توالی­های کاندیدا miRNA­ در نظر گرفته شد، شامل میزان e-value ≤ 001/0  حداکثر عدم جفت شدگی بین miRNA­ و EST = چهار بود (Xie et al., 2007).

Blastx

 miRNA­ها توالی­های کدکننده پروتئینی نیستند؛ بنابراین توالی­های کاندیدا miRNA­ که پروتئین کد می­کنند، باید حذف شوند. برای این منظور، از الگوریتم BLASTx در بانک اطلاعاتی NCBI (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) استفاده شد. در این مرحله، توالی­های EST که به‌عنوان کاندیداهای miRNA­ غربال شده بودند، در برابر تمام توالی­های کد کننده­ پروتئینی (Non-redundant protein sequences (nr)) Blastx شدند (Zhou et al., 2008).

 تعیین ساختار ثانویه پیشساز miRNA (pre-miRNA)

پیش­بینی ساختار ثانویه pre-miRNAهایی با ساختار مناسب برای تبدیل شدن به miRNA، با استفاده از سرور  MFOLD انجام شد (http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/old/rna/) انجام شد (Pérez-Quintero et al., 2012) و پارامترهای پیش­فرض این سرور برای این مرحله مورد استفاده قرار گرفت. سپس توالی­هایی که ساختار ثانویه­ای با شرایط زیر داشتند به‌عنوان کاندیدا miRNA در نظر گرفته شدند:

حداکثر تعداد بازهای جفت نشده بین توالی miRNA و توالی پیش­ساز آن بیشتر از چهار نوکلئوتید نباشد؛ داشتن MFEI منفی بالاتر از انواع دیگر RNA؛ داشتن حداقل انرژی آزاد folding پیش­ساز miRNA؛ عدم وجود حلقه یا شکاف بزرگ در توالی miRNA بالغ و در نهایت این‌که توالی miRNA بالغ باید روی حلقه پیش­ساز قرار گیرد (Zhang et al., 2006).

تجزیه و تحلیل­های تبارزایی

RNAهای کوچک (sRNAها) به‌صورت طبیعی در بین موجودات مختلف حفاظت شده هستند؛ از این رو می­توان ارتولوگ­های آن‌ها را از طریق آنالیزهای بیوانفورماتیکی کشف کرد. miRNAهای کاندید حاصل از مراحل قبل، جهت بررسی روابط تکاملی آن‌ها در برنامه MEGA7 بر اساس فاصله ژنتیکی مورد آنالیز قرار گرفتند و درخت فیلوژنتیکی آن‌ها ترسیم شد (Devi et al., 2016).

 تعیین ژن­های هدف miRNAهای پیشگویی شده

جهت تعیین ژن­هایی که رونوشت آن‌ها، هدف miRNAهای پیشگویی شده قرار می­گیرد، از وب سایت psRNATarget  (Plant Small RNA Target Analysis Server.2017) استفاده شد. در این مرحله، miRNAهای پیشگویی شده­ به‌عنوان query در برابر ترانسکریپتوم AGI و TAIR استفاده شدند (Devi et al., 2016). پارامترهای این مرحله به‌صورت پیش فرض و توسط سرور اعمال شد که شامل حداکثر e-value  برابر سه، تعداد جایگاه­های هدف برابر دو، دامنه­ی عدم جفت شدگی مرکزی برای مهار رونویسی بین نه تا 11، حداکثر عدم جفت شدگی در جایگاه جفت شدن بزرگتر یا مساوی چهار و نداشتن هیچگونه gap می­باشند (Devi et al., 2016).

استخراج RNA، سنتز cDNA، انجام واکنش­های زنجیره­ای حرارتی  (PCR) و Real Time PCR

استخراج RNA با کیت استخراج بایوزول و مطابق با دستورالعمل شرکت سازنده انجام گرفت. جهت سنتز cDNA از سه نوع پرایمر شامل stem-loop RT، forward و reverse بر اساس توالی بالغ هر miRNA گزارش شده در سایت miRbase استفاده شد. پرایمرهای stem-loop RT و forward به‌صورت اختصاصی و پرایمر reverse به‌صورت عمومی برای تمامی  miRNAها طراحی شدند و طراحی پرایمر با استفاده از الگوریتم Primer-3  و  Primer Quest صورت گرفت (Din et al., 2012). برای هر واکنش PCR حدود 8/0 میکرولیتر از پرایمرهای forward و reverse، 5/7 میکرولیتر مسترمیکس PCR و سه میکرولیتر cDNA اضافه شد. حجم نهایی واکنش، با آب مقطر به 15 میکرولیتر رسانده شد و سپس واکنش با استفاده از دستورالعمل (Varkonyi-Gasic et al., 2007) انجام شد. جهت تعیین تمایز بیان miRNAها بین اندام­های مختلف، از واکنش­های Real Time PCR استفاده شد؛ برای این منظور، از cDNAهای مربوط به دو اندام برگ و گل هر دو گونه استفاده شد. این مرحله با استفاده از کیت شرکت Solis BioDyne که از رنگ فلئورسنت Eva Green استفاده می­کند انجام شد. شرایط دمایی و زمانی چرخه­های حرارتی و غلظت مواد، طبق دستورالعمل (Varkonyi-Gasic et al., 2007) اعمال شد. از آن‌جا که ژن رفرنس برای این miRNAها وجود نداشت، یکی از بافت­ها به‌عنوان کنترل در نظر گرفته شد و بافت­ دیگر با آن مقایسه شد. تجزیه و تحلیل داده‌ها با استفاده ا نرم­افزارهای Rest و Excel 2013 انجام شد.

نتایج و بحث

شناسایی miRNAها

طبیعت حفاظت شدگی در بین miRNAهای بالغ، شناسایی آن‌ها را در گونه­هایی که توالی ژنومی آن‌ها به طور کامل مشخص نیست به مقدار زیادی تسهیل می­کند (Devi et al., 2016). در این مطالعه، روش­های مقایسه­ای جهت شناسایی miRNAهای حفاظت شده دو گونه کاسنی مورد استفاده قرار گرفت. نتایج نشان داد که در بین توالی­های EST گونه C. intybus، سیزده توالی با شش توالی miRNA و از توالی­های EST گونه C. endivia نیز یازده توالی با چهار miRNA دارای همولوژی هستند. نتایج این مرحله در جدول 1 و 2 شان داده شده است. پس از فیلتر کردن توالی­های جانوری و داده­های تکراری، جهت حذف توالی­های کد کننده­ پروتئینی Blastx در برابر تمام توالی­های پروتئینی NCBI صورت گرفت (Devi et al., 2016). در مطالعه­ای که به منظور آنالیز شبکه­های تنظیم بیان ژن از طریق miRNA در گیاه C. intybus صورت گرفت، miRNA 91 کاندیدا متعلق به 57 خانواده­ miRNA پیشگویی شد (Srivastava et al., 2017). پس از حذف داده­های با خطای مثبت و منفی بالا، در نهایت 28 خانواده­ miRNA باقی ماند. در این مطالعه، در مجموع پنج miRNA کاندیدا در گونه C. intybus (ath-miR393b-3p، bdi-miR162، bna-miR156a، gma-miR166h-3p و bdi-miR166e-3p) و دو miRNA کاندیدا در گونه C. endivia (ath-miR162a-5p و cme-miR156j) به دست آمد که همولوژی بالایی با miRNAهای گیاهان عالی داشتند (Devi et al., 2016).

جدول1- نتایج جستجوی همولوژی بین ESTهای گونه­ C. intybus در برابر miRNAهای بالغ سایر جانداران

Table 1.  Identification of homology search of C. intybus C. EST against other organism miRNAs

توصیف miRNAهای کاندیدا درکاسنی

در مجموع هفت توالی کاندیدا شناسایی شده متعلق به چهار خانواده miRNA بودند که اکثر خانواده­ها دو عضوی (bdi-miR162، ath-miR162a-5p، bna-miR156a، cme-miR156j، gma-miR166h-3p و bdi-miR166e-3p) و فقط یک خانواده یک عضوی (ath-miR393b-3p) بودند. miRNAهای کاندیدا شناسایی شده در این تحقیق، با نتایج پیشگویی (Srivastava et al., 2017) مقایسه شدند که در این میان، سه  miRNA شامل miR162 ، miR156 و miR393 مشترک بودند، اما miR166 به‌عنوان یک miRNA جدید در این مطالعه شناسایی شد. miR156، miR166 و miR162 و miR393 قبلا در گیاهانی مثل مرکبات (Song et al., 2009) و ارزن وحشی (Xie et al., 2010) نیز شناسایی شده­اند. 

جدول 2- نتایج جستجوی همولوژی بین ESTهای گونه­ C. endivia در برابر miRNAهای بالغ سایر جانداران.

Table 1.  Identification of homology search of C. endivia C. EST against other organism miRNAs

طول miRNAهای بالغ کاسنی، بین 24-19 نوکلئوتید و به طور متوسط 37/21 می­باشد که مشابه با miRNAهای گیاهانی است که قبلا مطالعه شده‌اند (Xie et al., 2010). حداقل انرژی آزاد تاخوردگی (MFE)، اهمیت بسیار بالایی در تشکیل ساختار ثانویه RNAها دارد و به‌طور‌کلی، هر چه این مقدار منفی­تر باشد، پایداری آن ساختار بیشتر است
(Xie et al., 2010). این عدد برای گونه C. intybus از kcal/mol 84- تا kcal/mol 7/111- متغیر بود و به‌طور متوسط kcal/mol 65/102-  بود. همچنین در گونه C. endivia، این عدد از kcal/mol 5/94- تا kcal/mol 5/117- متغیر بود و به‌طور متوسط kcal/mol 4/102- بود. یک توالی پیشساز miRNA مناسب باید از پایداری بالایی نسبت به دیگر ساختارها برخوردار باشد. در این ساختار، تعداد عدم جفت شدگی بین توالی miRNA بالغ و miRNA* نباید از تعداد مشخصی زیادتر باشد و هر چه تعداد این عدم جفت شدگی کمتر باشد، آن ساختار از مطلوبیت بیشتری برای تبدیل شدن به یک miRNA بالغ برخوردار است. برای این منظور، از سرور MFOLD با پارامترهای پیشفرض جهت تعیین ساختار ثانویه pre-miRNA، حداقل انرژی آزاد folding، تعیین تعداد عدم جفت شدگی و ... استفاده شد. نتایج این مرحله نشان داد که هفت توالی pre-miRNA مناسب برای گونه C. intybus و هشت توالی pre-miRNA مناسب برای گونه C. endivia ده وجود داشت. شکل 1 و 2، نتایج تعیین ساختار ثانویه در گونه­ها­ی مورد بررسی را نشان می­دهد.

پیشگویی ژن‌های هدف miRNAهای شناسایی شده

مطالعات قبلی نشان می­دهند که miRNAها، بیان ژن را از طریق جفت شدن کامل یا تقریبا کامل با ژن‌های هدفشان و تخریب یا سرکوب کردن آن‌ها انجام می­دهند. miRNAهای گیاهی، درجه­ بالایی از جفت شدن با اهدافشان نشان می­دهند که این امر، پیشگویی ژن‌های هدف آن‌ها را ممکن می­سازد
(Devi et al., 2016). در این مطالعه، Transport Inhibitor Respons1 (TIR1) به‌عنوان هدف احتمالی miR393 ارائه شد که با نتایج (Devi et al., 2016) روی گیاه گلرنگ زراعی مطابقت داشت. این پروتئین به‌عنوان یک فاکتور رونویسی در پاسخ به اکسین عمل می­کند (Devi et al., 2016). از جمله هدف­هایی که برای miR156 یافت شد، یکی پروتئین­های متصل شونده به پروموتر Squamusa و دیگری خانواده­ی پروتئین کیناز هستند. پروتئین­های متصل شونده به پروموتر Squamusa (SBP یا SPL)، خانواده­ای از فاکتورهای رونویسی هستند که با دُمین (domain) اختصاصی متصل شونده به DNA مشخص می­شود
(Chain  et al.,2015). از مهم‌ترین ژن‌های هدف برای mir162 می­توان به ژنهای کدکننده پروتئین­ شبه دایسر یک (DCL1)، سیترات پروتئینازها و ATP سیترات لیازها و از مهم‌ترین ژن‌های هدف برای miR166 می­توان به ژن‌های کدکننده پروتئین­های متصل شونده به RNA و پروتئین­های HD-ZIP که در انصال به DNA و لیپید نقش دارند اشاره کرد. سایر نتایج در جدول 3 نشان داده شده است.

cit-miR166e       cit-miR166e      cit-miR393b    cit-miR162     cit-miR162    cit-miR156a      cit-miR162

شکل 1-  ساختار ثانویه ساقه- حلقه در pre-miRNAها کاندیدا در گونه  C. intybus. نواحی مشخص شده، دربردارنده­ توالی بالغ miRNA هستند که با اسفاده از سرور MFOLD به دست آمدند.

Figure 1. Predicted stem-loop hairpin secondary structures of the newly potential miRNAs identified in C. intybus that are generated by MFOLD. The mature miRNAs located in the secondary stem loop hairpin structure are highlighted in red color.

                A             B                       C                     D                E                F               G                   H          

شکل 2-  ساختار ثانویه ساقه-حلقه در pre-miRNAها کاندیدا در گونه  C. endivia با استفاده از سرور  MFOLD. نواحی مشخص شده، دربردارنده­ توالی بالغ miRNA هستند. از A تا F و همچنین H، مربوط به cen-miR162a و G مربوط به cen-miR156j می­باشند.

Figure 2. Predicted stem-loop hairpin secondary structures of the newly potential miRNAs identified in C. endivia that are generated by MFOLD. The mature miRNAs located in the secondary stem loop hairpin structure are highlighted in red color. Secondary structures of A to F and H belong to miR162a, while G belongs to cen-miR156j.

جدول 3-  ژن­های هدف miRNAهای جدید حاصل از ESTهای کاسنی، TAIR و AGI

Table 3. Targets of the newly predicted miRNAs from coffee EST sequences, TAIR and AGI

بررسی روابط فیلوژنتیکی

جهت بررسی روابط تکاملی بین خانواده­های miRNA این دو گونه، از نرم­افزار MEGA7 براساس الگوریتم UPGMA استفاده شد. درخت فیلوژنتیکی (شکل 3) نشان داد که این miRNAها بر اساس روابط تکاملی و حفاظت شدگی توالی، در سه گروه متفاوت قرار می­گیرند؛ گروه اول شامل miR156a و miR156j، گروه دوم شامل miR166e و miR166h و گروه سوم شامل miR162، miR162a و miR393b بودند. در این بین، بیشترین شباهت (کمترین فاصله) بین miR156a و miR156j و همچنین بین miR166e و miR166h مشاهده شد که نزدیک به 100 درصد همولوژی داشتند. علت این امر آن است که هر کدام از این دو گروه، به یک خانواده­ miRNA تعلق دارند و هر خانواده نیز از حفاظت شدگی بالایی در بین اعضا خود برخوردار است. در گروه سوم که شامل miR162، miR162a و miR393b هستند، فاصله­ی ژنتیکی زیادی مشاهده می­شود، به‌طوری‌که بین دو miR162 و miR162a حدود 43% تفاوت توالی و همچنین بین این دو miRNA و miR393b حدود 58% تفاوت توالی وجود دارد. در نهایت، بین دو گروه اول و گروه سوم، حدود 90% فاصله مشاهده شد.

نتایج سنتز cDNA و تکثیر miRNAها

پس از سنتز cDNA، جهت اطمینان از اختصاصی بودن پرایمرها و همچنین تکثیر miRNAها، از واکنش­های PCR استفاده شد و تمامی چهار miRNA مربوط به دو گونه تکثیر شدند. نتایج تکثیر دو miR156 و mir166  در شکل 4 نشان داده شده است. در شکل­ 4، ریشه با R (Root)، ساقه با S (Stem)، گل با F (Flower)، برگ با L (Leaf) و کنترل با C نشان داده شده است.

شکل 3-  نتایج بررسی­های فیلوژنتیکی pre-miRNAهای جدید پیشگویی شده دو گونه کاسنی

Figure 3. Phylogenetic analysis of the newly predicted pre-miRNA sequences of two chicory species

شکل 4- شناسایی miRNAها در هر دو گونه  C. endivia و C. intybus.  a: miR156 و b: miR166.

Figure 4.   Detection of miRNA with conventional PCR.  a: miR156, b: miR166

نتایج Real Time PCR

جهت بررسی تفاوت بیان miRNAهای در اندام­های مختلف، از Real Time PCR استفاده شد و برای این منظور، بافت گل و برگ هر دو گونه جهت بررسی بیان ژن مورد استفاده قرار گرفت. نتایج نشان داد که از تمام miRNAهای بررسی شده، فقط miR156 در هر دو گونه تکثیر می­شود؛ سایر miRNAها اگر چه تکثیر شدند، ولی به دلیل عدم توانایی در optimize کردن آن‌ها، وارد آنالیزها نشدند. از عواملی که ممکن است علت عدم تکثیر دیگر miRNAها باشد این است که فقط از دو اندام گل و برگ برای انجام آزمایش استفاده شد (Xie et al., 2007). نتایج آنالیز Real Time PCR برای miR156 و اندازه­گیری خطای استاندارد تیمارهای مختلف توسط نرم­افزار Excel 2013 نشان داد که این miRNA در برگ گونه C. endivia بیشترین میزان بیان را داشت، درحالی‌که در سه بافت دیگر (برگ و گل گونه C. intybus و گل گونه
 C .endivia) تفاوت معناداری از نظر میزان بیان نسبی وجود نداشت. این نتایج در شکل 5 نشان داده شده است. نکته قابل توجه در این تحقیق آن است که بیان ژن‌های هدف، مورد آزمون قرار نگرفت و بنابراین نمی‌توان تنها بر مبنای میزان بیان miRNAهای آزمون شده قضاوت نمود.

شکل 5- بیان نسبی miR156 در دو گونه کاسنی  C. endivia و C. intybus. F-I: گل C. intybus، L-I: برگ C. intybus، F-E: گل C. endivia و L-E: برگ C. endivia

Figure 5. Relative expression or miR156 in C. endivia and C. intybus.  F-I: C. intybus flower; L-I: C. intybus leaf; F-E: C. endivia flower; L-E: C. endivia leaf.

نتیجه­گیری کلی

در این تحقیق، از یک مجموعه ابزارهای بیوانفورماتیکی و روش­های آزمایشگاهی برای شناسایی miRNAها و ژن­های هدف آن‌ها در دو گونه گیاهی کاسنی شامل C. intybus و C. endivia که از منابع مهم متابولیت­های مهمی چون اینولین هستند استفاده شد که منجر به شناسایی چهار miRNA و پیشگویی 19 ژن هدف برای آن‌ها شد. اکثر ژن­های هدف پیشگویی شده، ژن‌های دخیل در پاسخ به اکسین، ژن‌های کد کننده پروتئین­ شبه دایسر یک (DCL1)، سیترات پروتئینازها و ATP سیترات لیازها و ژن‌های کدکننده پروتئین­های متصل شونده به RNA و پروتئین­های HD-ZIP دخیل در انصال به DNA و لیپید، را شامل شدند.  

REFERENCES

1. Din, M., Barozai, M. Y. K. & Baloch, I. A. (2014). Identification and functional analysis of new conserved microRNAs and their targets in potato (Solanum tuberosum). Turkish Journal of Botany, 38(6), 1199-1213.
2. Devi, K. J., Chakraborty, S., Deb, B. & Rajwanshi, R. (2016). Computational identification and functional annotation of microRNAs and their targets from expressed sequence tags (ESTs) and genome survey sequences (GSSs) of coffee (Coffea arabica L.). Plant Gene, 6, 30-42.
3. Das, S., Vasudeva, N. & Sharma, S. (2016). intybus: A concise report on its ethnomedicinal, botanical, and phytopharmacological aspects. Drug Development and Therapeutics, 7(1), 1.
4. De Paola, D., Cattonaro, F., Pignone, D. & Sonnante, G. (2012). The miRNAome of globe artichoke: conserved and novel micro RNAs and target analysis. BMC Genomics, 13(1), 41.
5. Pérez-Quintero, Á. L., Sablok, G., Tatarinova, T. V., Conesa, A., Kuo, J. & López, C. (2012). Mining of miRNAs and potential targets from gene oriented clusters of transcripts sequences of the anti-malarial plant, Artemisia annua. Biotechnology Letters, 34(4), 737-745.
6. Reinhart, B. J., Weinstein, E. G., Rhoades, M. W., Bartel, B. & Bartel, D. P. (2002). MicroRNAs in plants. Genes & Development, 16(13), 1616-1626.
7. Song, C., Fang, J., Li, X., Liu, H. & Chao, C. T. (2009). Identification and characterization of 27 conserved microRNAs in citrus. Planta, 230(4), 671-685.
8. Varkonyi-Gasic, E., Wu, R., Wood, M., Walton, E. F. & Hellens, R. P. (2007). Protocol: a highly sensitive RT-PCR method for detection and quantification of microRNAs. Plant Methods, 3(1), 12.
9. Xie, F. L., Huang, S. Q., Guo, K., Xiang, A. L., Zhu, Y. Y., Nie, L. & Yang, Z. M. (2007). Computational identification of novel microRNAs and targets in Brassica napus. Febs Letters, 581(7), 1464-1474.
10. Zhang, B., Pan, X. & Anderson, T. A. (2006). Identification of 188 conserved maize microRNAs and their targets. FEBS Letters, 580(15), 3753-3762.
11. Zhou, Z. S., Wang, S. J. & Yang, Z. M. (2008). Biological detection and analysis of mercury toxicity to alfalfa (Medicago sativa) plants. Chemosphere, 70(8), 1500-1509.