. مقدمه

در حال حاضر، گیاهان دارویی در عرصه پزشکی جایگزینی شایسته برای داروهای شیمیایی محسوب می‌شوند. به­ صورت کلی، گیاهان دارویی دارای آثار جانبی کمتری نسبت به داروهای شیمیایی هستند، اگرچه استثنائاتی نیز وجود دارد
(Huang & Chen., 2008). حداقل 28187 گونه گیاهی وجود دارد که به عنوان کاربرد دارویی ثبت شده است (Allkin, 2017).

گیاه وایه گل سفید (Ammi majus L.) گیاهی یک‌ساله و علفی متعلق به خانواده چتریان (Apiacea) می­باشد
 (Królicka et al., 2001). ارتفاع این گیاه بین 200-80 سانتی‌متر (Curini et al., 2006) و تکثیر آن به ‌وسیله بذر است. این گیاه دگرگشن و دارای 2n=22 است (Fedorov, 1974). میوه این گیاه حاوی ترکیباتی مانند سورالن (Psoralen)، زانتوتوکسول (Xanthotoxol)، ایمپراتورین (Imperatorin)، برگاپتن (Bergapten)، رزین، موسیلاژ و آمبلیفرون (Umbelliferone) است
 (Curini et al., 2006). در بررسی ترکیبات اسانس بذر گیاه A. majus (L.) که از طریق طیف­ سنجی جرمی مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند بیست و هشت ترکیب شناسایی شدند که ترکیبات اصلی آن شامل تولوئن (7/3 درصد)، تیمول (81/12 درصد) و کارواکرول (81/37 درصد) بود (Nayebi et al., 2013). به­ طور قابل توجهی، فورانوکومارین‌های خطی از زمان‌های قدیم در درمان اختلالات استفاده شده‌اند (Sarker & Nahar, 2004). این گیاه همچنین دارای خواص ضد دیابتی (Muthukumran et al., 2011)، آنتی­اکسیدانی (Hussain et al., 2015) و ضد میکروبی (Khalfallah et al., 2011) است.

گیاهان در دوره رشد و نمو خود با انواع مختلفی از تنش‌ها مواجه می‌شوند. تنش گرما یکی از مهم‌ترین تنش‌های محیطی محسوب می‌شود (Hasanuzzaman et al., 2013). شناسایی حساس‌ترین مرحله رشدی گیاه، بهترین محرک و مناسب‌ترین غلظت محرک‌ها در افزایش کمیت متابولیت‌های گیاهی مؤثر می‌باشد (Angelova et al., 2006). بنابراین، شناسایی پاسخ مولکولی و فیزیولوژیک گیاهان نسبت به تنش دمای بالا و کاربرد تحریک‌کننده‌هایی که منجر به افزایش تحمل گیاهان می‌شوند مهم و ضروری به نظر می‌رسد. با توجه به اهمیت بسیار بالای گیاهان دارویی و نیاز روز افزون به کشت ­وکار این گیاهان مخصوصاً گیاه A. majus (L.) به‌ واسطه دارا بودن ترکیبات دارویی بسیار مؤثر آن، به ­نظر می‌رسد استفاده از محرک‌های مختلف نامبرده به ‌منظور افزایش کیفیت متابولیت‌های ثانویه می‌تواند به ‌عنوان یک روش کمکی در زراعت این گیاه مؤثر باشد. هورمون‌های ‌گیاهی ترکیباتی هستند که هم به صورت طبیعی و هم به صورت شیمیایی سنتز می­شوند (Jager et al., 2008) و مسئول تنظیم و کنترل فرآیندهای فیزیولوژیک در گیاهان هستند. هورمون‌ها علاوه بر تنظیم جنبه‌های رشد و نمو در گیاهان، درکنترل پاسخ به استرس‌های محیطی‌ و تنظیم مسیرهای پیام­رسانی نیز نقش ایفا می­کنند. ملاتونین ( N-acetyl -5-methoxytryptamine) یکی از مهم‌ترین مشتقات تریپتوفان است که در سال 1995 در گیاهان شناسایی شده است (Dubbels et al., 1995). ملاتونین در جوانه­ زنی بذر، تنظیم گلدهی، رشد ریشه، فتوسنتز و چرخه شبانه‌روزی گیاه نقش دارد. همچنین نقش این هورمون در افزایش تحمل گیاهان نسبت به تنش ­های محیطی از قبیل خشکی، شوری، سرما، گرما، فلزات سنگین و ... در نتایج تحقیقات مختلف، تأیید شده است
 (Altaf et al., 2020). رایج‌ترین راه مقابله با تنش به واسطه ملاتونین، افزایش فعالیت دفاعی آنتی ­اکسیدانی گیاهان و مهار رادیکال­ های آزاد است (Sharma et al., 2020). تنش گرما سبب ایجاد یک سری تغییرات در بیان ژن­ های درگیر در محافظت از تنش می شود.

این ژن­ ها، مسئول بیان آنزیم ­های سم­زدا، اسموپروتئین ­ها و پروتئین ­های تنظیم ­کننده می­ باشند. اخیرا، کاربرد خارجی ترکیبات محافظت­ کننده از قبیل فیتوهورمون ها (Sharma, 2019; Sytar et al., 2019)، اسموپروتئین ها (Annunziata et al., 2019;
Estaji et al., 2019; Morgutti et al.,2019)، مولکول های پیام­ رسان (نیتریک اکسید)، پلی­ آمین­ ها (El Amrani et al., 2019;
Xu et al., 2019) در مقابله با خسارت ناشی از تنش در گیاهان گزارش شده است. ظرفیت آنتی­ اکسیدانی بالاتر ملاتونین نسبت به سایر آنتی ­اکسیدان­ های غیر آنزیمی از قبیل آسکوربات (Ascorbate) و توکوفرول­ ها (Tocopherol)، احتمالا با توانایی ملاتونین برای انتقال کارآمد از طریق محفظه­ های مختلف سلول مرتبط است (Martinez et al., 2018). در گیاه شنبلیله تحت تنش گرما میزان مالون­دی­آلدهید به­ طور چشمگیری افزایش یافت (Sheikhi et al., 2018). کاربرد خارجی ملاتونین در گیاهان می­تواند سبب کاهش سطح گونه های فعال اکسیژن و مالون­دی­آلدهید تحت شرایط تنش UV-B، سرما، گرما و تنش کم ­آبی شود
 (Wang et al., 2009; Szafranska et al., 2012; Kabiri et al., 2018; Naghizadeh et al., 2019).

تأثیر همزمان ملاتونین، سالسیلات و جیبرلین روی اسانس و متابولیت‌های ثانویه گیاهچه پرتقال تلخ (Citrus aurantium L.) بر فلاونوئیدها و ترکیبات فنولی و نیز ظرفیت آنتی­ اکسیدانی گیاه تأثیر می‌گذارد .(Sarrau et al., 2015) محلول­پاشی ملاتونین بر گیاه بادرشبو  (Dracocephalum moldavica) تحت تنش خشکی (به ­ویژه غلظت 100 میکرومول) باعث بهبود صفات مورفولوژیکی، افزایش رنگدانه    ­های فتوسنتزی، ترکیبات فنولی، آنتوسیانین و محتوای پروتئین و کاهش محتوای مالون­دی­آلدهید شده است .(Naghizadeh et al., 2019) اعمال ملاتونین سطح بیان ژن‌های کلیدی موجود در فرآیندهای متابولیسم کلروفیل و دفاع آنتی ­اکسیدانی را به­ طور قابل توجهی افزایش می‌دهد (Sharma et al., 2020).

با توجه به اهمیت گیاه وایه گل سفید به عنوان یک گیاه دارویی و تاثیرگذاری ملاتونین به­ عنوان یک تحریک­ کننده مقاومت گیاهان نسبت به تنش­ های غیر زیستی، این تحقیق با هدف بررسی پاسخ فیزیولوژیک بافت برگی A. majus (L.) و مطالعه اثر ملاتونین در افزایش تحمل این گیاه نسبت به تنش گرما انجام شد. با شناخت سازوکارها و بررسی پاسخ این گیاه نسبت به تنش گرما و تیمار با ملاتونین، شانس روش های اصلاحی با هدف آزادسازی ارقام مقاوم و همچنین روش­ های مبتنی بر بیوتکنولوژی افزایش می­ یابد.

2. روش ­شناسی پژوهش

2-1. شرایط رشد و نحوه اعمال تیمارها

در این تحقیق ابتدا بذور A. majus (L.) که از جنوب خوزستان جمع­آوری شده بود، در گلخانه دانشکده کشاورزی داخل گلدان (قطر 17 و ارتفاع 14 سانتی­متری) در دمای2±24 درجه سانتی­گراد، رطوبت 30-40 درصد و نور 8000-10000 لوکس در سه تکرار کشت شد که برای کشت از خاک اتوکلاوشده، پرلیت و پیت­ماس با نسبت 1:1:1 استفاده شد. آزمایشی در قالب آزمایش فاکتوریل بر پایه طرح کاملا تصادفی انجام ‌شد. گیاهچه‌ها در مرحله قبل از گلدهی، 72 روز بعد از کشت (حساس­ترین مرحله رشدی گیاه مذکور نسبت به تنش گرما مرحله گلدهی است) با هورمون ملاتونین (صفر، 30، 60 ppm) و به­ عنوان شاهد
 (Mohammadi Asboi et al., 2021)، گیاهان با آب مقطر به­ صورت اسپری­پاشی تیمار شدند. سپس به ­منظور اعمال تنش گرما به اتاقک رشد با دمای 2±42 درجه سانتی­گراد (Sheikhi et al., 2018) منتقل و در زمان‌های مختلف (24 و 48 ساعت) از بافت­ های برگی میانی بوته (به صورت ترکیب تکرارها باهم) نمونه ­برداری انجام شد. پس از نمونه­‌برداری بافت برگی، نمونه­ های گیاهی به فریزر 80- درجه سانتی‌گراد منتقل شدند.

2-2. اندازه ­گیری صفات فیزیولوژی

برای اندازه ­گیری رنگیزه ­های کلروفیل از پروتکل (Arnon, 1967) استفاده شد. در نهایت میزان جذب نور با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر (2150 (UV و ‌در طول موج‌های 480، 649 و 665 نانومتر تعیین‌ شد. نتایج حاصل از اندازه­ گیری مقدار رنگیزه ­های فتوسنتزی بر حسب میلی­گرم بر گرم وزن تر برگ محاسبه و گزارش شد.

در استخراج پروتئین کل ابتدا 250 میلی­گرم از بافت با نیتروژن مایع به­ خوبی پودر و به فالکون‌های حاوی 5/2 میلی­ لیتر بافر استخراج منتقل شد. پس از ورتکس، ‌نمونه­ ها‌ به مدت 15 دقیقه با سرعت3500 دور در دقیقه در دمای 4 درجه سانتی­گراد سانتریفیوژ شدند. پس از اتمام این مرحله، مایع ‌رویی فالکون‌ها به تیوب‌های جدید منتقل و به ­منظور قرائت پروتئین ‌کل و سنجش فعالیت آنزیم­ های کاتالاز، گایاکول­ پراکسیداز، آسکوربات ­پراکسیداز در یخچال 20- درجه سانتی­گراد نگهداری شدند. برای تهیه محلول بردفورد، ابتدا 100 میلی­ گرم‌ کوماسی بلو و 50 میلی ­لیتر اتانول 96 درصد با هم مخلوط شدند. سپس به محلول حاصل 100 میلی­ لیتر ارتوفسفریک ­اسید 85 درصد (به ­صورت ‌قطره قطره) اضافه شد. محلول پس ‌از 24 ساعت نگهداری در یخچال با آب مقطر به حجم نهایی یک لیتر رسید. در نهایت محلول با استفاده از کاغذ صافی فیلتر و در محیط تاریک و خنک ذخیره شد (4 درجه‌ سانتی­گراد). جهت اندازه­گیری غلظت پروتئین نمونه‌ها سه میلی­ لیتر از محلول بردفورد با 100 میکرولیتر عصاره آنزیمی درون فالکون مخلوط و برای اطمینان از مخلوط­ شدن، نمونه‌ها به­  شدت ورتکس‌ شدند. پس از گذشت 20 دقیقه، غلظت پروتئین هر نمونه توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 595 نانومتر اندازه   ­گیری و برحسب میلی­ گرم بر گرم بافت تازه برگ با استفاده از منحنی استاندارد تعیین شد.

در سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز با آغاز واکنش و با کاهش میزان هیدروژن ­پراکسید به­ واسطه واکنش با کاتالاز میزان جذب در این طول موج نیز به­ تدریج کاهش می ­یابد .(Scebba et al., 1998) فعالیت ویژه آنزیم کاتالاز (ΔoD) بر اساس میکرومول پراکسید هیدروژن در دقیقه در میلی گرم پروتئین با ضریب‌ خاموشی ‌برابر  mM^-1cm-¹4/39 محاسبه شد. در سنجش فعالیت آنزیم گایاکول ­پراکسیداز میزان جذب با گذشت زمان روند افزایشی داشته و بر اساس مقدار جذب ترکیب نارنجی­ رنگ تتراگایاکول در میلی ­گرم غلظت پروتئین میزان فعالیت آنزیم گایاکول محاسبه شد. فعالیت ویژه آنزیم گایاکول پراکسیداز (ΔoD) به­صورت تعداد میکرومول پراکسید هیدروژن تجزیه­ شده در دقیقه در میلی ­گرم پروتئین با ضریب خاموشی برابر  mM^-1cm^-16/26 گزارش شد
 .(Dionisio & Tobita, 1984) به منظور سنجش فعالیت آنزیم آسکوربات ­پراکسیداز با استفاده‌ از روش (Ranieri et al., 2000) در طول پنج دقیقه فعالیت ‌این آنزیم با ضریب خاموشی برابر  mM^-1cm^-13/39 اندازه ­گیری و ثبت شد. جهت اندازه­ گیری میزان پراکسیداسیون لیپیدی بر اساس مالون­دی­ آلدهید از روش (1980) Bewley & Stewart استفاده و میزان جذب نمونه ­ها‌ در دو طول ‌موج 532 و 600 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه ­گیری شد.

تجزیه و تحلیل آماری داده ­ها، با استفاده از نرم ­افزارهای Excel (2016) و  SAS (9.0) آنالیز و مقایسه میانگین داده ­ها با استفاده از آزمون  LSDدر سطح احتمال پنج درصد انجام شد. برای رسم نمودارها از نرم ­افزار GraphPad Prism (9.5.1) استفاده شد.

3. نتایج و بحث

در بافت برگی اثر سطوح مختلف تنش گرمایی برای صفات کلروفیل a، کلروفیلb ، کلروفیل کل، کاروتنوئید، پروتئین کل، آنزیم آسکوربات­  پراکسیداز، آنزیم کاتالاز، مالون­دی­ آلدهید در سطح احتمال یک درصد (بجز آنزیم گایاکول­ پراکسیداز در سطح احتمال پنج درصد) معنی­دار بود. همچنین اثرات سطوح مختلف ملاتونین برای همه صفات در سطح احتمال یک درصد معنی ­دار بود؛ در حالی­که اثر متقابل تنش گرما و ملاتونین معنی ­دار نبود (جداول 1 و 2).

جدول 1. تجزیه واریانس صفات فیزیولوژیک مورد مطالعه بافت برگی در سه سطح ملاتونین (M) و دو سطح دما (T).

جدول 2. تجزیه واریانس صفات مورد مطالعه بافت برگی در سه سطح ملاتونین (M) و دو سطح دما (T).

^* و ^** به ­ترتیب معنی­ داری در سطح احتمال پنج و یک درصد.

1-3. محتوای کلروفیل و کارتنوئید

اثر سطوح مختلف تنش گرما و ملاتونین بر محتوای کلروفیل و کاروتنوئید مطابق شکل 1 نشان می­ دهد که اثر متقابل تنش گرما و ملاتونین بر محتوای‌ کلروفیل و کاروتنوئید معنی ­دار نبود. بررسی اثر فاکتورها به ­صورت جداگانه نشان داد تنش گرما در 48 ساعت بیشترین کاهش را نسبت به تنش گرمای 24 ساعت داشته است. کاربرد سطوح مختلف ملاتونین نشان داد که با افزایش غلظت ملاتونین کلروفیل a، کلروفیل کل و کاروتنوئید به ­صورت معنی­ داری افزایش یافت. اندازه­ گیری رنگیزه­ های محتوی کلروفیل ‌یکی ‌از ویژگی­ های مورد استفاده برای ‌درک ‌پاسخ ‌گیاه ‌نسبت به تنش­ های وارده به آن می­ باشد. ‌کاهش ‌فتوسنتز ‌به­‌واسطه کاهش سنتز ‌کلروفیل اتفاق می ­افتد .(Afzal et al., 2014) مطالعات نشان می­دهد که اثرات ملاتونین روی رنگیزه­های فتوسنتزی ممکن است مرتبط با افزایش فعالیت آنتی ­اکسیدان­ ها یا افزایش ظرفیت سیستم آنتی­ اکسیدانی گیاهان باشد  (Xalxo & Keshavkant, 2019).

کاهش میزان کاروتنوئیدها در شـرایط استرس گیاه نیز به علـت تجزیه بتاکاروتن و تشکیل زئازانترین در چرخه گزانتوفیل می­ باشد (Ahmadi & SeioSemardeh, 2004). در شرایط تنش گرما، مقدار کاروتنوئید کاهش می­یابد و کارتنوئید توانایی ایفای نقش حفاظتی خود را ندارد که این کاهش احتمالا به علت اکسیداسیون توسط گونه­ های فعال اکسیژن و تخریب ساختار آنها روی داده است؛ اگرچه کاهش آنها نسبت به کلروفیل­ ها کمتر استet al., 2010)  (Wang. ‌دمای بالا ‌با‌ افزایش آسیب‌ به‌ غشاء ‌سلول‌ موجب نخلیه محتویات ‌درونی سلول ‌به ‌خارج ‌از ‌سلول می­ شود (Sheikhi et al., 2018). هورمون ملاتونین سبب بهبود فعالیت­ های رشدی گیاه همچون افزایش مقدار کلروفیل a وb ،کلروفیل کل و کاروتنوئیدها در گیاه شاهی (Lepidium sativum) شده است (Olomi et al., 2017).

شکل 1. نتایج مقایسه میانگین اثر تنش گرما و ملاتونین بر محتوای رنگیزه­های کلروفیل بافت برگ(L.)  A. majus، مقایسه میانگین با روش LSD و در سطح احتمال پنج درصد انجام شده است.

2-3. محتوای پروتئین

اثر متقابل ‌تنش ‌گرما و ملاتونین روی محتوای پروتئین معنی­ دار نبود؛ به­ همین منظور اثر فاکتورهای اصلی به ­صورت جداگانه مورد بررسی قرار گرفت (شکل 2). نتایج پژوهش نشان داد که با افزایش مدت زمان تنش گرما میزان پروتئین به­ صورت معنی ­داری افزایش پیدا می­کند. همچنین افزایش غلظت ملاتونین نیز سبب افزایش میزان پروتئین می شود؛ به ­طوری­که تیمار با غلظت ppm 60 ملاتونین بیشترین میزان و صفر ppm آن کمترین میزان پروتئین را داشت. نتایج ‌پژوهش­ های ‌مختلف ‌نشان ‌داده ‌است ‌که ‌میزان ‌پروتئین ‌کل ‌تحت ‌تاثیر ‌تنش‌های‌ زیستی ‌و ‌غیر ‌زیستی‌ افزایش ‌می‌یابد. ‌علت این افزایش در ‌طول تنش گیاه،‌ احتمالا افزایش بیان ‌برخی ‌ژن ­ها ‌شامل ‌تنظیم ‌اسمزی، ‌رفع ‌سمیت، ژن­های ‌وابسته ‌به‌ متابولیسم ‌اولیه است .(Jiang & Huang, 2002) افزایش ‌محتوای ‌پروتئین ‌کل‌ بعد ‌از ‌تیماردهی گیاهان ‌با ملاتونین که ‌تحت ‌شرایط ‌تنش‌ غیر زیستی‌ بودند در‌ بسیاری از منابع‌‌ گزارش ‌شده‌ است. ملاتونین، در اسفرزه (Plantago ovata Forssk) موجب افزایش مقدار پروتئین در شرایط تنش می­شود
 (Naghizadeh et al., 2021). در شنبلیله قرار گرفتن طولانی ­مدت در معرض تنش دمای بالا، موجب افزایش محتوای پروتئین کل در مقایسه با مدت زمان کوتاه تنش شد که با نتایج تحقیق حاضر مطابقت دارد  .(Sheikhi et al., 2018)

شکل 2. نتایج مقایسه میانگین اثر تنش گرما و اثر ملاتونین بر محتوای پروتئین ‌کل بافت برگی.A. majus (L.)  مقایسه‌ میانگین‌ با ‌روش ‌LSD و‌ در ‌سطح ‌احتمال ‌پنج ‌درصد ‌انجام ‌شده ‌است.‌

3-3. فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانی

بررسی­ های انجام­شده نشان داد که اثر متقابل تنش گرما و ملاتونین روی فعالیت آنزیم کاتالاز معنی­ دار نبود؛ به­ همین منظور فاکتورهای اصلی به­ صورت جداگانه مورد بررسی قرار گرفتند (شکل 3). نتایج بررسی اثر مدت زمان تنش گرما روی میزان فعالیت آنزیم کاتالاز نشان­  داد که با افزایش ساعت تنش گرما میزان فعالیت آنزیم نیز افزایش پیدا می­کند. همچنین کاربرد غلظت­ های مختلف ملاتونین سبب افزیش میزان معنی­ دار فعالیت این آنزیم نسبت به سطح صفرppm  آن شد. اثر متقابل تنش گرما و ملاتونین روی فعالیت آنزیم گایاکول معنی­  دار نبود که اثر هر فاکتور اصلی به ­صورت جداگانه بررسی­شد. نتایج نشان­ داد که اعمال تنش گرمای 48 ساعت نسبت به تنش گرمای 24 ساعت افزایش معنی­ داری داشت و همچنین کاربرد غلظت های مختلف ملاتونین سبب افزایش معنی­دار فعالیت آنزیم نسبت به سطح صفر ppm غلظت ملاتونین شد. فعالیت ‌آنزیم آسکوربات­ پراکسیداز ‌تحت تاثیر اثر متقابل تنش گرما و ملاتونین قرار نگرفت و معنی­ دار نبود. بررسی فاکتورهای اصلی نشان داد که با افزایش مدت زمان تنش گرما میزان فعالیت این آنزیم افزایش پیدا می­کند؛ به­طوری­که 48 ساعت تنش گرما میزان فعالیت بیشتری نسبت به 24 ساعت تنش گرما داشت. کاربرد غلظت­ های مختلف ملاتونین نیز سبب افزایش فعالیت آنزیم آسکوربات ­پراکسیداز نسبت به غلظت صفرppm  ملاتونین شد.

تولید ‌گونه ­های فعال اکسیژن، یکی ‌از ‌اولین ‌واکنش­ های ‌بیوشیمیایی ‌سلول­های ‌یوکاریوتی نسبت به تنش­ ها است. گونه­ های ‌فعال ‌اکسیژن ترکیبات بسیار ‌سمی‌ ‌برای‌ موجودات هستند و ‌بر ‌عملکرد ‌و ساختار مولکول­ های ‌زیستی‌ تاثیر‌ می ­گذارند. ‌همچنین سبب غیر فعال­‌شدن آنزیم­ های حساس ‌تخریب ‌کلروفیل، ‌لیپیدها،‌ نوکلئیک­‌اسیدها، ‌روزنه­ ها، غشاء‌ و ‌تخریب ‌فعالیت ‌پروتئین ­ها می­ شوند (Nikolaeva et al., 2010). گیاهان برای کاهش استرس اکسیداتیو، دارای سیستم­ های دفاعی آنتی­اکسیدان ­ها و آنزیم ­های آنتی­ اکسیدانی برای جاروب­  کردن گونه­ های فعال اکسیژن هستند (Choi, 2011). ‌مهمترین‌ آنتی­ اکسیدان ­هایی که فعالیت آنزیمی دارند شامل ‌سوپراکسید­دیسموتاز، ‌کاتالاز، ‌آسکوربات­‌پراکسیداز، ‌گلوتاتیون‌ردوکتاز ‌و ‌پراکسیداز‌ هستند (Hsu & Kao, 2003). نتایج این تحقیق نشان داد فعالیت آنزیم­های آنتی­ اکسیدان کاتالاز، گایاکول و آسکوربات پراکسیداز تحت تنش گرما افزایش می­ یابد که افزایش ‌فعالیت­های ‌آنتی­ اکسیدان ‌بعد ‌از ‌اعمال‌ تنش ‌شوری ‌در‌ منابع‌ مختلف‌ گزارش ‌شده ‌است (Shakeel et al., 2019) که با نتایج تحقیق حاضر مطابقت دارد. گیاهان به ‌منظور‌ حفاظت ‌از‌ غشای‌ سلولی ‌و ‌سایر اندام­ های گیاهی ‌از‌ خسارت ‌ناشی از ‌تنش‌ اکسیداتیو، سیستم ‌دفاعی‌ آنتی­ اکسیدانی ‌قوی ‌را ‌در ‌شرایط‌ تنش ‌توسعه ‌می­ دهند (Maia et al., 2010). نقش ‌کلیدی ‌ملاتونین ‌برون ­زاد در‌ بیان ‌ژن­ های ‌موثر ‌در ‌فرآیندهای ‌دخیل ‌در ‌بیوسنتز ‌آنتی ­اکسیدان ­ها ‌در ‌گیاهان ‌به اثبات رسیده ‌است
 (Jiang et al., 2020). اثرات‌ متقابل‌ ملاتونین ‌با‌ گونه­ های ‌فعال ‌اکسیژن‌ ‌منجر ‌به ‌رخداد‌ یک سری ‌واکنش­ های ‌آبشار ‌مانند ‌مبتنی­ بر‌ ملاتونین ‌می ­شود تا‌ ظرفیت ‌آنتی­ اکسیدانی‌ گیاه را ‌افزایش‌ داده ‌و‌ حتی‌ در‌ حضور ‌غلظت­ های ‌کم ملاتونین ‌نیز ‌مکانیزم ­های ‌دفاعی‌ گیاه را فعال‌ کند (Yan et al., 2020). نتایج این تحقیق نشان داد با افزایش غلظت ملاتونین فعالیت آنزیم­ های آنتی­ اکسیدانی افزایش یافت. افزایش ‌فعالیت ‌آنزیم ­های ‌آنتی ­اکسیدانی ‌بعد ‌از ‌کاربرد هورمون ‌ملاتونین ‌در‌ سایر ‌گیاهان ‌نیز‌ گزارش‌ شده است (Sheikhi et al., 2018) که با نتایج تحقیق حاضر مطابقت دارد. استفاده از ملاتونین سبب مهار تجمع H₂O₂ می­شود که ممکن است در نتیجه تأثیر مستقیم آن روی مهار گونه­های فعال اکسیژن و افزایش سطح آنزیم­های آنتی­اکسیدانی نظیر کاتالاز و پراکسیداز باشد. نتایج ‌پژوهش­ های متعدد ‌نشان ‌داد‌ه است که‌ کاربرد هورمون ­ها همچون هورمون اپی‌براسینواستروئیدها‌ از‌ طریق ‌تاثیر‌ بر بیان ‌ژن ­های مسئول‌ کنترل ‌فعالیت ‌آنزیم­های آنتی­  اکسیدانی، منجر ‌به افزایش مقاومت ‌گیاهان ‌در ‌برابر ‌خسارت ‌ناشی ‌از ‌گونه­ های ‌فعال اکسیژن می­ شود ‌ .(Choe et al., 2006)

 شکل 3. نتایج مقایسه میانگین اثر تنش گرما و ملاتونین بر فعالیت آنزیم ­های آنتی ­اکسیدان بافت برگ A. majus (L.). مقایسه‌ میانگین­ ها‌ با ‌روش ‌LSD و‌ در‌ سطح ‌احتمال ‌پنج ‌درصد ‌انجام ‌شده ‌است.

4-3. محتوای مالون‌دی‌آلدهید

محتوای مالون‌دی‌آلدهید تحت تاثیر اثر متقابل تنش گرما و ملاتونین قرار نگرفت (شکل 4). بررسی فاکتورهای اصلی تنش گرما و ملاتونین نشان داد که اعمال مدت زمان تنش گرمای بیشتر سبب افزایش پراکسیداسیون چربی­ های غشا می­شود. کاربرد غلظت­ های مختلف ملاتونین سبب کاهش معنی ­دار اکسیداسیون لیپیدهای غشا نسبت به غلظت صفرppm  ملاتونین شد؛ به­ طوری­که بیشترین میزان کاهش در غلظتppm  60 ملاتونین بود. ‌اولین ‌بخش از ‌گیاه، غشای سلولی است ‌که تحت‌ شرایط ‌تنش ‌آسیب ‌می ­بیند.(Liang et al., 2003)  پراکسیداسیون لیپیدهای غشایی، ‌نشانه بارز ‌آسیب ‌تنش ‌در ‌سطح ‌سلول است. ‌بنابراین اندازه­گیری سطح‌ مالون­دی­آلدهید،‌ اغلب‌ به­   عنوان یک‌ شاخص مهم ‌برای آسیب ناشی از تنش ‌اکسیداتیو ‌به ‌کار ‌می رود
 (Antoniou et al., 2017). در گیاه شنبلیله تحت تنش گرما میزان مالون­دی­ آلدهید به­ طور چشمگیری افزایش یافت
 (Sheikhi et al., 2018). افزایش در مقدار مالون­دی­ آلدهید تحت تنش به­ علت افزایش در پراکسیداسیون لیپیدها است که با نتایج تحقیق حاضر هم خوانی دارد. تحت تاثیر تنش رادیکال ­های آزاد ‌تولید­‌شده ‌با‌ ماکرومولکول­ هایی از ‌قبیل پروتئین، DNA و ‌همچنین ‌اسیدهای‌ چرب ‌غشا ‌سلولی ‌واکنش داده ‌و ‌منجر ‌به ‌اکسیداسیون ‌آن­ها‌ می ­شود (Baxter et al., 2014). تنش ‌دمای بالا ‌موجب‌ افزایش آسیب‌ به‌ غشای ‌سلول‌ و تخلیه‌ محتویات ‌درونی سلول ‌به ‌خارج ‌از ‌سلول می­ شود (Sheikhi et al., 2018). ‌نتایج ‌سایر ‌تحقیقات ‌نیز‌ نشان ‌داد ‌که ‌هورمون ملاتونین ‌به ­صورت ‌موثری ‌می ­تواند ‌از ‌نشت الکترولیت ‌و‌ تجمع ‌مالون­‌دی­ آلدهید ‌به ‌بیرون ‌از ‌غشای سلول ‌جلوگیری نموده و ‌باعث ‌افزایش‌ تحمل گیاه در برابر آسیب­ های تنش ‌شود (Zhang et al., 2020).

شکل 4. نتایج مقایسه میانگین اثر تنش گرما و اثر ملاتونین بر میزان مالون­دی ­آلدهید در بافت برگی A. majus (L.). مقایسه‌ میانگین‌ با ‌روش ‌LSD‌ و در‌سطح ‌احتمال ‌پنج ‌درصد ‌انجام ‌شده ‌است.

4. نتیجه ­گیری

نتایج این تحقیق نشان داد که کاربرد‌ خارجی ملاتونین در گیاهان تیمارشده با ملاتونین به­ صورت موثری ‌از ‌تخریب‌ کلروفیل ‌و ‌رنگدانه ­های ‌فتوسنتزی ‌جلوگیری ‌کرده و منجر ‌به ‌افزایش بیوسنتز ‌آن­ها ‌تحت ‌شرایط تنش گرما ‌شد. همچنین ‌نتایج ‌این ‌مطالعه ‌نشان ‌داد ملاتونین‌ به      ­صورت ‌معنی داری ‌فعالیت ‌آنزیم­های ‌آنتی­ اکسیدانی ‌را‌ افزایش ‌داده‌ و ‌بدین ­ترتیب‌ موجب‌ حذف ‌گونه های ‌فعال ‌اکسیژن و ‌رادیکال­ های ‌آزاد ‌شد. کاربرد ملاتونین همچنین از پراکسیداسیون اسیدهای چرب جلوگیری به عمل آورده و در نتیجه منجر به کاهش محتوی مالون­دی­  آلدهید شد. همچنین نتایج این تحقیق نشان داد غلظتppm  60 ملاتونین جهت کاهش خسارت­ های ناشی از تنش گرما مناسب می­ باشد.

5. منابع

Afzal, A., Gulzar, I., Shahbaz, M., & Ashraf, M. (2014). Water deficit-induced regulation of growth, gas exchange, chlorophyll fluorescence, inorganic nutrient accumulation and antioxidative defense mechanism in mungbean Vigna radiata (L.) Wilczek. Journal of Applied Botany and Food Quality, 87.

Ahmadi, A., & Seiosemardeh, A. (2004). Effect of drought stress on soluble carbohydrate, chlorophyll and proline in four adopted wheat cultivars with various climate of Iran. Iranian Journal of Agriculture Sciense, 35, 753-763. )In Persian(.

Allkin, B. (2017). Chapter useful plants: Medicines at least 28, 187 plant species are currently recorded as being of medicinal use. In State of the World’s Plants.

Altaf, M.A., Shahid, R., Ren, M.X., Naz, S., Altaf, M.M., Qadir, A., Anwar, M., Shakoor, A., & Hayat, F. (2020). Exogenous melatonin enhances salt stress tolerance in tomato seedlings. Biologia Plantarum, 64, 604-615.

Angelova, Z., Georgiev, S., & Roos, W. (2006). Elicitation of plants. Biotechnology & Biotechnological Equipment, 20(2), 72-83.

Annunziata, M.G., Ciarmiello, L.F., Woodrow, P., Dell’Aversana, E., & Carillo, P. (2019). Spatial and temporal profile of glycine betaine accumulation in plants under abiotic stresses. Frontiers in Plant Science, 10, 1-13.

Antoniou, P.F., Attikis, A., Constantinou, M.G., Costa, M.E., Hadjiyiannakou, K.A., Konstantinou, G.N., & Tsokkou, D. (2017). Controlling electron and exciton transfer paths in molecular systems.

Arnao, M.B., & Hernández-Ruiz, J. (2015). Melatonin: Synthesis from tryptophan and its role in higher plants. In: D’ Mello JPF, ed. Amino acids in higher plants. Boston: CAB International, 390–435.

Arnon, A.N. (1967). Method of extraction of chlorophyll in the plants. Agronomy Journal, 23(1), 112-121.

Baxter, A., Mittler, R., & Suzuki, N. (2014). ROS as key players in plant stress signalling. Journal of Experimental Botany, 65(5), 1229-1240.

Choe, E., & Min, D.B. (2006). Mechanisms and factors for edible oil oxidation. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 5(4), 169-186.

Choi, S.D. (2011). Melatonin protects against oxidative stress in granular corneal dystrophy type 2 corneal fibroblasts by mechanisms that involve membrane melatonin receptors. Journal of Pineal Research, 51, 94-103.

Curini, M., Cravotto, G., Epifano, F., & Giannone, G. (2006). Chemistry and biological activity of natural and synthetic prenyloxycoumarins. Current Medicinal Chemistry, 3(2), 199-222.

Dionisio-Sese, M.L., & Tobita, S. (1998). Antioxidant responses of rice seedlings to salinity stress. Plant Science, 135(1), 1-9.

Dongxiao, L.I., Zhang, D., Hongguang, W.A.N.G., Yanming, L.I., & Ruiqi, L.I. (2017). Physiological response of plants to polyethylene glycol (PEG-6000) by exogenous melatonin application in wheat. Zemdirbyste-Agriculture, 104(3), 219-228.

Dubbels, R., Reiter, R.J., Klenke, E., Goebel, A., Schnakenberg, E., Ehlers, C., & Schloot, W. (1995). Melatonin in edible plants identified by radioimmunoassay and by high performance liquid chromatography‐mass spectrometry. Journal of Pineal Research, 18(1), 28-31.

El Amrani, A., Couée, I., Berthomé, R., Ramel, F., Gouesbet, G., & Sulmon, C. (2019). Involvement of polyamines in sucrose-induced tolerance to atrazine-mediated chemical stress in Arabidopsis thaliana. Journal of Plant Physiology, 238, 1-11.

Estaji, A., Kalaji, H.M., Karimi, H.R., Roosta, H.R., & Moosavi-Nezhad, S.M. (2019). How glycine betaine induces tolerance of cucumber plants to salinity stress? Photosynthetica, 57(3), 753-761.

Fedorov, A. (1974). Chromosome numbers of flowering plants. Koeltz, Konigstein Gadnidze.

Hasanuzzaman, M., Nahar, K., Alam, M.M., Roychowdhury, R., & Fujita, M. (2013). Physiological, biochemical, and molecular mechanisms of heat stress tolerance in plants. International Journal of Molecular Sciences, 14, 9643-9684.

Hsu, Y.T., & Kao, C.H. (2003). Role of abscisic acid in cadmium tolerance of rice (Oryza sativa L.) seedlings. Plant, Cell & Environment, 26(6), 867-874.

Huang, S.T., & Chen, A.P. (2008). Traditional chinese medicine and infertility. Current Opinion in Obstetrics & Gynecology, 20, 211-215.

Hussain, I., Salman, S., Khan, H., & Ramzan, M. (2015). Screening of Ammi majus (L.) and Convolvulus arvensis for antioxidant activities. MDSRC Publications.

Jager, C.E., Symons, G.M., Ross, J.J., & Reid, J.B. (2008). Do brassinosteroids mediate the water stress response? Physiol Plant, 133, 417–425.

Jiang, D., Lu, B., Liu, L., Duan, W., Chen, L., Li, J., & Bai, Z. (2020). Exogenous melatonin improves salt stress adaptation of cotton seedlings by regulating active oxygen metabolism. Peer Journal, 8, e10486.

Jiang, Y., & Huang, B. (2002). Protein alternations in tall fescue in responseto drought stress and abscisic acid. Crop Science Journal, 42, 202-207.

Kabiri, R., Hatami, A., Oloumi, H., Naghizadeh, M., Nasibi, F., & Tahmasebi, Z. (2018). Foliar application of melatonin induces tolerance to drought stress in Moldavian balm plants (Dracocephalum moldavica) through regulating the antioxidant system. Folia Horticulture, 1, 155 -167.

Khalfallah, A., Labed, A., Semra, Z., Al Kaki, B., Kabouche, A., Touzani, R., & Kabouche, Z. (2011). Antibacterial activity and chemical composition of the essential oil of Ammi visnaga (L.) (Apiaceae) from constantine, Algria. International Journal of Medicinal and Aromatic Plants, 1, 302-305.

Królicka, A., Staniszewska, I., Bielawski, K., Malinski, E., Szafranek, J., & Łojkowska, E. (2001). Establishment of hairy root cultures of Ammi majus. Plant Science, 160, 259–264.

Maia, J.M., de Macedo, C.C., Voigt, E.L., Freitas, J.B.S., & Silveira, J.A.G. (2010). Antioxidative enzymatic protection in leaves of two contrasting cowpea cultivars under salinity. Biologia Plantarum, 54(1), 159-163.

Martinez, V., Nieves-cordones, M., Lopez-delacalle, M., Rodenas, R., Mestre, T.C., Garcia-Sanchez, F., Rubio, F., Nortes, P.A., Mittler, R., & Rivero, R.M. (2018). Tolerance to stress combination in tomato plants: New insights in the protective role of melatonin. Molecules, 23, 535.

Mohammadi Asboi, M., Ebrahimi, A., & Amrian, M. (2021). Increased expression of some genes involved in diosgenin biosynthesis pathway in fenugreek (Trigonella foenum-graecum L.) treated with different levels of melatonin under salt stress. Journal of Agricultural Plant Sciences, University of Tehran. (In Persian).

Mohammadi, H., Moradi, S., & Aghaei, A. (2019). The effect of melatonin on the morphological and physiological characteristics of the medicinal plant Agastaka under water stress conditions. Plant Process and Function, 10(4), 45-57. (In Persian).

Montazeri, F., Omid, M., & Imani, N. (2018). Comparison of seed and embryo cultivation methods and investigation of the effect of activated charcoal in optimizing the in vitro culture of the medicinal plant Ferula gummosa Bioss. Journal of Scientific Research on Medicinal and Aromatic Plants of Iran, 26, 511-595. (In Persian).

Morgutti, S., Negrini, N., Pucciariello, C., & Sacchi, G.A. (2019). Role of trehalose and regulation of its levels as a signal molecule to abiotic stresses in plants. Plant Signaling Molecules, 235-255.

Mukherjee, S. (2019). Insights into nitric oxide–melatonin crosstalk and N-nitrosomelatonin functioning in plants. Journal of Experimental Botany, 70(21), 6035-6047.

Muthukumran, P., Begumand, V.H., & Kalaiarasan, P. (2011). Anti-aiabetic activity of Ammi majus (L.) leaf extracts. International Journal of Pharmtech Research, 3, 136-139.

Naghizadeh, M., & Kabiri, R. (2015). Effect of foliar spraying with salicylic acid on some physiological characteristics of corn (Zea mays L.). In drought stress conditions. Environmental Tensions in Agricultural Sciences, 9(4), 315-327. (In Persian).

Naghizadeh, M., Kabiri, R., & Maqshoodi, K. (2021). Evaluation of the effect of foliar spraying of melatonin and ascorbic acid on the yield of seeds and mucilage of Plantago ovate Forssk. Iranian Journal of Medicinal and Aromatic Plants Research, 37(6), 919-908. )In Persian(.

Naghizadeh, M., Kabiri, R., Hatami, A., Oloumi, H., Nasibi, F., & Tahmasebi, Z. (2019) Exogenous application of melatonin mitigates the adverse effects of drought stress on morpho-physiological traits and secondary metabolites in Moldavian balm (Dracocephalum moldavica). Physiology and Molecular Biology Plants, 25, 881-894.

Nayebi, S., Kakeshpour, T., Hasanvand, A., Nadri, M., & Rashidi Monfared, S. (2013). Composition of volatile compounds of extract of Ammi majus from Iran by GC-MS. Journal of Sciences, Islamic Republic of Iran, 24(4), 335-338. )In Persian(.

Nikolaeva, M.K., Maevskaya, S.N., Shugaev, A.G., & Bukhov, N.G. (2010). Effect of drought on chlorophyll content and antioxidant enzyme activities in leaves of three wheat cultivars varying in productivity. Russian Journal of Plant Physiology, 57(1), 87-95.

Olomi, H., Nasibi, F., & Mozafari, H. (2017). Investigating growth changes and content of secondary metabolites of watercress under exogenous melatonin treatment. Nova Biologica Reperta, 5(2), 154-144. (In Persian).

Pribitkin, E.D., & Boger, G. (2001). Herbal therapy: What every facial plastic surgeon must.

Ranieri, A., Castagna, A., Pacini, J., Baldan, B., Mensuali Sodi, A., & Soldatini, G.F. (2003). Early production and scavenging of hydrogen peroxide in the apoplast of sunflower plants exposed to ozone. Journal of Experimental Botany, 54(392), 2529-2540.

Saeed, M.A., & Khan, F.Z. (1994). Studies on the contact dermatitic properties of indigenous Pakistani medicinal plants. Journal of Faculty of Pharmacy of Gazi University, 11(1), 17-24.

Sarker, S.D., & Nahar, L. (2004). Natural medicine: The genus Angelica Curr. Journal of Medicinal Chemistry, 11, 1479–1500.

Sarropoulou, V.N., Therios, I.N., & Dimassi‐Theriou, K.N. (2012). Melatonin promotes adventitious root regeneration in in vitro shoot tip explants of the commercial sweet cherry rootstocks CAB‐6P (Prunus cerasus L.), Gisela 6 (P. cerasus× P. canescens), and MxM 60 (P. avium× P. mahaleb). Journal of Pineal Research, 52, 38-46.

Sarrou, E., Chatzopoulou, P., Dimassi-Theriou, K., Therios, I., & Koularmani, A. (2015). Effect of melatonin, salicylic acid and gibberellic acid on leaf essential oil and other secondary metabolites of bitter orange (Citrus aurantium L.) young seedlings. Journal of Essential Oil Research, 27, 487- 496.

Scebba, F., Sebastiani, L., & Vitagliano, C. (1998). Changes in activity of antioxidative enzymes in wheat (Triticum aestivum L.) seedlings under cold acclimation. Physiologia Plantarum, 104(4), 747-752.

Sharma, A., Shahzad, B., Kumar, V., Kohli, S.K., Sidhu, G.P.S., Bali, A.S., & Zheng, B. (2019). Phytohormones regulate accumulation of osmolytes under abiotic stress. Biomolecules, 9(7), 285-321.

Sharma, A., Wang, J., Xu, D., Tao, S., Chong, S., Yan, D., Li, Z., Yuan, H., Zheng, B., Wang, J., & Xu, D. (2020). Melatonin regulates the functional components of photosynthesis, antioxidant system, gene expression, and metabolic pathways to induce drought resistance in grafted Carya cathayensis plants melatonin regulates the functional components. Science of The Total Environment, 713,136675.

Sheikhi, S., Ebrahimi, A., Amrian, M., & Heydari, P. (2018). Investigating the effect of epibrasinosteroid on diosgenin biosynthesis in fenugreek (Trigonella foenum-graecum L.) under high temperature stress conditions. Master's thesis. Shahrood University of Technology. Ph.D Thesis. Faculty of Agriculture and Natural Resources of Mohaghegh Ardabili University. (In Persian).

Stewart, R.R., & Bewley, J.D. (1980). Lipid peroxidation associated with accelerated aging of soybean axes. Plant Physiology, 65(2), 245-248.

Tanou, G., Molassiotis, A., & Diamantidis, G. (2009). Induction of reactive oxygen species and necrotic death-like destruction in strawberry leaves by salinity. Environmental and Experimental Botany, 65, 270-281.

Wang, Y., Hao, J., Li, Q., & Jia, J. (2009) Defend effects of melatonin on mung bean UV-B irradiation. Acta Photonica Sinica, 38, 2629-2633.

Xalxo, R., & Keshavkant, S. (2019). Melatonin, glutathione and thiourea attenuate lead and acid rain-induced deleterious responses by regulating gene expression of antioxidants in Trigonella foenum graecum (L.). Chemosphere Journal, 221, 1-10.

Xu, J., Liu, T., Yang, S., Jin, X., Qu, F., Huang, N., & Hu, X. (2019). Polyamines are involved in GABA-regulated salinity-alkalinity stress tolerance in muskmelon. Environmental and Experimental Botany, 164, 181-189.

Yan, Y., Shi, Q., & Gong, B. (2020). Review of melatonin in horticultural crops. In Melatonin the hormone of darkness and its therapeutic potential and perspectives. IntechOpen.

Zhang, T., Shi, Z., Zhang, X., Zheng, S., Wang, J., & Mo, J. (2020). Alleviating effects of exogenous melatonin on salt stress in cucumber. Scientia Horticulturae, 262, 109070.